一种枯草芽孢杆菌的发酵方法及发酵液与流程

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌的发酵方法及发酵液。

背景技术：

枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis），是芽孢杆菌属的一种。枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。枯草芽孢杆菌作为一种益生菌，可以应用于生物工程、工农业、食品安全以及生命健康领域。

枯草芽孢杆菌的发酵是一种复杂的生化过程，其发酵好坏涉及诸多因素，除了菌种的生产性能，还与培养基的配方、灭菌条件等密切相关。然而，传统枯草芽孢杆菌的发酵方法存在工艺成本高，浓度达不到理想效果，发酵效率等问题，故亟待对枯草芽孢杆菌的发酵方法进行改进。

技术实现要素：

本发明实施例的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌的发酵方法，旨在解决背景技术中提出的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种枯草芽孢杆菌的发酵方法，其包括以下步骤：

将枯草芽孢杆菌菌种接种至种子培养基中进行活化培养，得到种子液；

取一发酵培养基，并将发酵培养基的ph值调至8.5~10后，再进行灭菌处理，得到灭菌后的发酵培养基；

将种子液置于灭菌后的发酵培养基中进行发酵培养，得到枯草芽孢杆菌的发酵液；

其中，每升所述种子培养基包括以下组分：葡萄糖4~8g、黄豆粉30~50g、玉米淀粉20~30g、酵母浸粉2~6g、硫酸锰0.1~0.5g、消泡剂0.5~1.5g；

每升所述发酵培养基包括以下组分：葡萄糖1~3g、黄豆粉25~45g、玉米淀粉20~40g、酵母浸粉2~6g、氯化钠1~3g、磷酸氢二钾1~3g、硫酸锰0.1~0.5g、消泡剂0.5~1.5g。

作为本发明实施例的一种优选方案，每升所述种子培养基包括以下组分：葡萄糖5~7g、黄豆粉35~45g、玉米淀粉24~26g、酵母浸粉3~5g、硫酸锰0.2~0.3g、消泡剂0.8~1.2g。

作为本发明实施例的另一种优选方案，每升所述发酵培养基包括以下组分：葡萄糖1.5~2.5g、黄豆粉30~40g、玉米淀粉25~35g、酵母浸粉3~5g、氯化钠1.5~2.5g、磷酸氢二钾1.5~2.5g、硫酸锰0.2~0.3g、消泡剂0.8~1.2g。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述步骤中，灭菌处理的温度为120~122℃。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述步骤中，发酵培养时，种子液的体积为发酵培养基体积的5%~10%。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述步骤中，发酵培养时的温度为36~38℃。

本发明实施例的另一目的在于提供一种由上述发酵方法发酵得到的发酵液。

本发明实施例提供的一种枯草芽孢杆菌的发酵方法，工艺成本低，其通过在种子培养基和发酵培养基中采用黄豆粉来代替豆粕，可以降低体系粘稠度，以利于枯草芽孢杆菌的发酵培养；另外，本发明通过控制灭菌前发酵培养基的ph值，可以使发酵过程中的发酵液的ph值降至合适的范围，从而有利于枯草芽孢杆菌的的生长繁殖，以提高枯草芽孢杆菌的发酵效率，而且其得到的发酵产品的保存时间较长。

附图说明

图1为本发明实施例1得到的枯草芽孢杆菌的发酵液的菌落形态图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

该实施例提供了一种枯草芽孢杆菌的发酵方法，其包括以下步骤：

s1、在37℃的温度条件下，将保藏的枯草芽孢杆菌菌种接种至ph=7.2的种子培养基中进行活化培养，得到种子液；其中，每升种子培养基中包括葡萄糖6g、黄豆粉40g、玉米淀粉25g、酵母浸粉4g、硫酸锰0.25g、消泡剂1g。

s2、在50l的小罐中配制30l的ph=7.2的发酵培养基，并将发酵培养基的ph值调至8.5后，再置于121℃的温度条件下进行灭菌处理30min，并用精过滤器蒸汽压力0.12mpa处理30min，得到灭菌后的发酵培养基。其中，每升发酵培养基包括葡萄糖2g、黄豆粉35g、玉米淀粉30g、酵母浸粉4g、氯化钠2g、磷酸氢二钾2g、硫酸锰0.25g、消泡剂1g。

s3、在37℃温度以及200rpm的振荡条件下，将种子液按照置于灭菌后的发酵培养基中进行发酵培养46h，即可得到枯草芽孢杆菌的发酵液；其中，发酵培养时，种子液的体积为发酵培养基体积的5%。

其中，发酵过程中小罐灭菌前的ph值为8.5，加入菌种后为6.98；发酵4h内ph为6.03~6.98，5~17h内为5.51~6.2，18~46h内为6.08~6.96。溶氧量表现为：发酵0~3h为95%~125%、通气量为0.68~0.75m²/h；（注：3h后下降很快）4~46h为2%~4%、通气量为1~1.3m²/h；溶氧含量最高在5%，最低在1%。此外，发酵过程中，在发酵18h后每毫升发酵液的活菌含量达到6亿，46h后活菌含量达到15亿。

实施例2

该实施例提供了一种枯草芽孢杆菌的发酵方法，其包括以下步骤：

s1、在37℃的温度条件下，将保藏的枯草芽孢杆菌菌种接种至ph=7.2的种子培养基中进行活化培养，得到种子液；其中，每升种子培养基中包括葡萄糖6g、黄豆粉40g、玉米淀粉25g、酵母浸粉4g、硫酸锰0.25g、消泡剂1g。

s2、在500l的大罐中配制300l的ph=7.2的发酵培养基，并将发酵培养基的ph值调至8.96后，再置于121℃的温度条件下进行灭菌处理30min，并用精过滤器蒸汽压力0.12mpa处理30min，得到灭菌后的发酵培养基。其中，每升发酵培养基包括葡萄糖2g、黄豆粉35g、玉米淀粉30g、酵母浸粉4g、氯化钠2g、磷酸氢二钾2g、硫酸锰0.25g、消泡剂1g。

s3、在37℃温度以及160rpm的振荡条件下，将种子液按照置于灭菌后的发酵培养基中进行发酵培养70h，即可得到枯草芽孢杆菌的发酵液；其中，发酵培养时，种子液的体积为发酵培养基体积的10%。

其中，灭菌前大罐中的ph值在8.96，灭菌后接完菌种后为7.01，发酵4h-~18h内为5.74~6.04，19~43h内为6.15~7.1，44~70内为6.92~8.11；（此情况说明在随发酵时间越久产生的酸性物质就会减少，ph值就会有所回升）。溶氧量表现为：发酵前三个小时溶氧量在40%~50%左右、通风量4~5m²/h；4~34h内溶氧量基本在0~1%之间、通风量6~8m²/h；35~51h内溶氧量由4%升到42%后降至3%、通风量8~12m²/h；52~62h内溶氧量为0~1%、通风量10~12m²/h；63~70h内溶氧量由3%升至27%后降至24%，通风量10~12m²/h。此外，发酵过程中，在发酵18h后每毫升发酵液的活菌含量达到15亿，42h后达到25亿，70h达到200亿左右，芽孢形成率接近于100%。

实施例3

该实施例提供了一种枯草芽孢杆菌的发酵方法，其包括以下步骤：

s1、在37℃的温度条件下，将保藏的枯草芽孢杆菌菌种接种至ph=7.2的种子培养基中进行活化培养，得到种子液；其中，每升种子培养基中包括葡萄糖4g、黄豆粉30g、玉米淀粉20g、酵母浸粉2g、硫酸锰0.1g、消泡剂0.5g。

s2、在50l的罐中配制30l的ph=7.2的发酵培养基，并将发酵培养基的ph值调至8.5后，再置于120℃的温度条件下进行灭菌处理30min，并用精过滤器蒸汽压力0.1mpa处理30min，得到灭菌后的发酵培养基。其中，每升发酵培养基包括葡萄糖1g、黄豆粉25g、玉米淀粉20g、酵母浸粉2g、氯化钠1g、磷酸氢二钾1g、硫酸锰0.1g、消泡剂0.5g。

s3、在36℃温度以及160rpm的振荡条件下，将种子液按照置于灭菌后的发酵培养基中进行发酵培养40h，即可得到枯草芽孢杆菌的发酵液；其中，发酵培养时，种子液的体积为发酵培养基体积的5%。

实施例4

该实施例提供了一种枯草芽孢杆菌的发酵方法，其包括以下步骤：

s1、在37℃的温度条件下，将保藏的枯草芽孢杆菌菌种接种至ph=7.2的种子培养基中进行活化培养，得到种子液；其中，每升种子培养基中包括葡萄糖8g、黄豆粉50g、玉米淀粉30g、酵母浸粉6g、硫酸锰0.5g、消泡剂1.5g。

s2、在50l的罐中配制30l的ph=7.2的发酵培养基，并将发酵培养基的ph值调至10后，再置于122℃的温度条件下进行灭菌处理30min，并用精过滤器蒸汽压力0.15mpa处理30min，得到灭菌后的发酵培养基。其中，每升发酵培养基包括葡萄糖3g、黄豆粉45g、玉米淀粉40g、酵母浸粉6g、氯化钠3g、磷酸氢二钾3g、硫酸锰0.5g、消泡剂01.5g。

s3、在38℃温度以及200rpm的振荡条件下，将种子液按照置于灭菌后的发酵培养基中进行发酵培养60h，即可得到枯草芽孢杆菌的发酵液；其中，发酵培养时，种子液的体积为发酵培养基体积的10%。

实施例5

该实施例提供了一种枯草芽孢杆菌的发酵方法，其包括以下步骤：

s1、在37℃的温度条件下，将保藏的枯草芽孢杆菌菌种接种至ph=7.2的种子培养基中进行活化培养，得到种子液；其中，每升种子培养基中包括葡萄糖5g、黄豆粉35g、玉米淀粉24g、酵母浸粉3g、硫酸锰0.2g、消泡剂0.8g。

s2、在50l的罐中配制30l的ph=7.2的发酵培养基，并将发酵培养基的ph值调至9后，再置于121℃的温度条件下进行灭菌处理30min，并用精过滤器蒸汽压力0.12mpa处理30min，得到灭菌后的发酵培养基。其中，每升发酵培养基包括葡萄糖1.5g、黄豆粉30g、玉米淀粉25g、酵母浸粉3g、氯化钠1.5g、磷酸氢二钾1.5g、硫酸锰0.2g、消泡剂0.8g。

s3、在37℃温度以及180rpm的振荡条件下，将种子液按照置于灭菌后的发酵培养基中进行发酵培养50h，即可得到枯草芽孢杆菌的发酵液；其中，发酵培养时，种子液的体积为发酵培养基体积的8%。

实施例6

该实施例提供了一种枯草芽孢杆菌的发酵方法，其包括以下步骤：

s1、在37℃的温度条件下，将保藏的枯草芽孢杆菌菌种接种至ph=7.2的种子培养基中进行活化培养，得到种子液；其中，每升种子培养基中包括葡萄糖7g、黄豆粉45g、玉米淀粉26g、酵母浸粉5g、硫酸锰0.3g、消泡剂1.2g。

s2、在50l的罐中配制30l的ph=7.2的发酵培养基，并将发酵培养基的ph值调至9.5后，再置于121℃的温度条件下进行灭菌处理30min，并用精过滤器蒸汽压力0.13mpa处理30min，得到灭菌后的发酵培养基。其中，每升发酵培养基包括葡萄糖2.5g、黄豆粉40g、玉米淀粉35g、酵母浸粉5g、氯化钠2.5g、磷酸氢二钾2.5g、硫酸锰0.3g、消泡剂1.2g。

s3、在37℃温度以及180rpm的振荡条件下，将种子液按照置于灭菌后的发酵培养基中进行发酵培养50h，即可得到枯草芽孢杆菌的发酵液；其中，发酵培养时，种子液的体积为发酵培养基体积的7%。

实验例：

1、样品稀释：准备上述实施例1得到的枯草芽孢杆菌的发酵液1ml，以及10个装有9ml生理盐水的离心管；将1ml发酵液加入到第一个装有9ml生理盐水的离心管中。

2、在涡旋震荡仪上充分震荡混匀或上下颠倒混匀，记为10-1稀释液；再用1ml无菌吸管吸取1ml的10-1稀释液移入第二个装有9ml生理盐水的离心管中，充分混匀后，记为10-2稀释液；以此类推，制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等一系列稀释液，供平板接种用。

3、选择三个适宜的稀释度，在这里我们选择的是10-7稀释液、10-8稀释液。用1ml无菌吸管吸取上述稀释液0.1ml，加至营养琼脂板表面，用无菌玻璃涂布器将菌悬液均匀涂布，每个稀释度做5个平行同时用无菌水作为空白对照。

4、将营养琼脂板置37℃温箱中倒置培养12~18h，观察菌落形态（如附图1所示）与活菌含量（如表1所示）。

其中，活菌含量的计算公式为：

每毫升菌液中活菌含量=菌落平均数×稀释倍数×10。

表1

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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