一种“抗污-杀菌-释放”多功能响应的抗菌表面及其制备方法与流程

本发明涉及抗菌表面的制备技术领域，具体涉及一种具有“抗污-杀菌-释放”多功能响应的抗菌表面及其制备方法。

背景技术：

微凝胶是被溶剂溶解的大分子网络，是一种能够在溶剂中溶胀并且具有三维网状结构的交联软颗粒，一般粒径为50纳米至数微米之间。它们是独特的系统，与常见的胶体(如刚性纳米颗粒，柔性大分子，胶束或囊泡)明显不同,微凝胶网络的大小在几微米到纳米的范围内(有时称为“纳米凝胶”)。在塌陷状态下，它们可能类似于硬胶体，但仍然可以包含大量溶剂；当肿胀时，它们是柔软的，表面有绒毛，悬挂着链子。与线性和(超)支化聚合物不同的是，微凝胶中交联部分的存在提供了结构完整性。而且交联剂的含量可以控制微凝胶的行为更相似“胶体”还是更相似“大分子”。

微凝胶的交联网络使其在柔软且多孔的同时仍具有稳定的结构，因此可以设计具有相同总化学组成而不同结构，并因为不同的结构可以具有不同性质的微凝胶。以两种单体为基础的微凝胶，比如具有统计空间分布的微凝胶，或具有核-壳或空穴-双壳形态的微凝胶，这些微凝胶将显示出非常不同的性质。并且微凝胶可以在不同位置引入化学官能团，或将结构多样性和反应性基团分隔结合在一起，可以实现化学反应性不稳定的组合短距离共存，而开放的微凝胶结构有利于活性物质的摄取释放。特别值得一提的是：微凝胶在水和许多有机溶剂中保持其胶体稳定性和溶胀度的独特能力允许使用不同的化学方法来修饰微凝胶结构。

细菌感染是致病菌或条件致病菌侵入血循环中生长繁殖，产生毒素和其他代谢产物所引起的急性全身性感染，临床上以寒战、高热、皮疹、关节痛及肝脾肿大为特征，部分可能有感染性休克和迁徙性病灶。

尽管在过去的十几年内，抗感染治疗已经取得了巨大的进步，但是感染性疾病仍然是全球第二大致死病因，而传统的抗菌表面主要有“主动杀菌”、“长效抗污”、“抗污-杀菌”以及“杀菌-释放”，但是均具有相应的弊端。“主动杀菌”表面虽然可以杀死细菌，但杀死的细菌无法清除，死菌的产生同样会产生生物膜，且为新的细菌的滋生提供营养，有时会造成更严重的感染。

cn110028614a公开了一种具有蛋白吸附功能的抗菌微纳米凝胶与纤维及其制备方法，所述制备方法包括：将丙烯酸或甲基丙烯酸衍生物可聚合单体、离子基水溶性可聚合单体、可聚合抗菌剂单体溶于去离子水中，将甲基丙烯酸环氧丙酯可聚合单体溶于二甲亚砜中，将两种溶液混合均匀，然后加入交联剂和引发剂，搅拌、溶解得到预聚物溶液；将预聚物溶液中加入四甲基乙二胺，静置成胶，烘干后粉碎即得抗菌微纳米凝胶；将预聚物溶液置于纤维状模板中，通过紫外光照辐照或模板加热引发得到抗菌水凝胶纤维。该纤维具有优异的吸水、蛋白吸附和持久抗菌性能。

但“长效抗污”表面时间长了也会粘附细菌，且细菌无法脱附；而“抗污-杀菌”以及“杀菌-释放”表面虽然结合了两种优势，但是前者仍然不能释放死菌，后者不能长期使用，这些都局限了其使用。因此，同时具有“抗污-杀菌-释放”三重功能的抗菌表面将是目前的研究趋势。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种具有“抗污-杀菌-释放”三重功能响应的微凝胶，能够长效抗细菌粘附，即使粘附后又能杀死并释放死菌的三重功能的抗菌表面，克服现有技术中抗菌表面的细菌无法脱附、死菌无法清除等不足。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种“抗污-杀菌-释放”多功能响应的微凝胶的制备方法，包括如下步骤：

(1)采用响应性单体与抗污单体制备抗污-释放微凝胶球；

(2)将步骤(1)的抗污-释放微凝胶球与儿茶酚类聚合物、fe³⁺溶液共沉淀，得到所述“抗污-杀菌-释放”多功能响应的微凝胶。

所述响应性单体包括n-异丙基丙烯酰胺(nipam)，n-乙烯基己内酰胺(vcl)，n,n-二乙基丙烯酰胺(deaam)，n-异丙基甲基丙烯酰胺(nipmam)等具有最低共熔温度效应的温敏性单体、ph响应性单体甲基丙烯酸(maa)、盐响应性单体二甲基-(4-乙烯苯基)铵丙磺酸内盐(dvbaps)中一种或多种。

所述防污单体包括n-羟乙基丙烯酰胺(heaa)、磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(sbma)、羧基甜菜碱甲基丙烯酸甲酯(cbma)、聚乙二醇甲基丙烯酸酯(poegma)、甲基丙烯酸羟乙酯(hema)等带双键的亲水性单体中一种或几种。

优选地，所述响应性单体为nipam、maa、dvbaps中任一种或多种；所述防污单体为hema、heaa、sbma、cbma、poegma中任一种。

所述响应性单体与抗污单体的质量比为2.3～9:1。如果具有响应性单体过多，抗菌表面的防污性能会严重下降，而如果响应性单体过少，则无法形成微凝胶球，表面的响应性也会很差。

步骤(1)的反应温度为70～80℃，反应时间为4～6h。

步骤(1)中使用交联剂，所述交联剂包括n,n-亚甲基双丙烯酰胺(mbaa),二乙烯基苯、二异氰酸酯中一种或几种，交联剂的质量为所述响应性单体和抗污单体总质量的1～5％。

步骤(1)中使用引发剂，所述引发剂包括过硫酸钾、过硫酸铵，引发剂的质量为所述响应性单体和抗污单体总质量的1～5％。

步骤1)中制备得到的微凝胶还包括透析过程以去除杂质。

所述儿茶酚类聚合物包括单宁酸、多巴胺及其衍生物中一种或多种。优选地，所述的儿茶酚类聚合物为单宁酸，其具有优异的杀菌性能和光热效应。

步骤(2)中，抗污-释放微凝胶球的质量浓度为3～8mg/ml；

所述儿茶酚类聚合物的质量浓度为15～20mg/ml，fe³⁺溶液的质量浓度为2～3mg/ml，两者的质量比例为5～10:1。在避光环境下15～35℃共沉积4～8h。儿茶酚类聚合物的含量太低会使抗菌表面的杀菌性能和光热性能有所下降。

可加入氯化钠以提高儿茶酚类聚合物沉积的厚度，更好的黏附微凝胶球，氯化钠的质量浓度为4～5mg/ml。

步骤(2)中，抗污-释放微凝胶球与儿茶酚类聚合物、fe³⁺溶液共沉淀的基底可为任意基底，包括玻璃、塑料、金属等多种。

本发明还提供一种根据所述的制备方法制备得到的“抗污-杀菌-释放”多功能响应的抗菌表面。该抗菌表面采用双重功能微凝胶球和单宁酸/fe³⁺共沉积制备多功能抗菌涂层，能够能长效地抗细菌黏附并杀死细菌，且当死菌黏附量达到一定程度时改变外界条件可以释放表面黏附的细菌并且实现功能再生，具有非释放性和优异的生物相容性。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明方法采用双重功能微凝胶球和单宁酸/fe³⁺共沉积制备多功能抗菌表面，与现有的多功能抗菌表面制备方法相比，避免了合成方法复杂、制备时间冗长的问题，制备方法更加简单高效，还可以应用于任意基底，大大扩大了抗菌表面的应用范围。

(2)本发明方法制得的多功能抗菌表面具有“抗污-杀菌-释放”三重功能，能长效地抗细菌黏附并杀死细菌，且当死菌黏附量达到一定程度时改变外界条件可以释放表面黏附的细菌并且实现功能再生。

(3)采用光热杀菌，近红外(nir)诱导的光热作用具有非释放性和优异的生物相容性，是一种出色的物理抗菌方法。

附图说明

图1为实施例1的多重功能抗菌表面制备和温度响应测试过程示意图。

图2为实施例1“抗污-释放”微凝胶球的sem图。

图3为实施例1、对比例1和对比例2的杀菌性能对比图，其中a)为对比例1、b)为对比例2、c)为实施例1。

图4为对比例1的基底抗污性能和温度响应释放性能细菌荧光图，其中的a)、b)、c)分别为基底在24h、48h、72h时37℃表面菌体情况，d)是基底在72h时4℃表面菌体情况，e)各个时间段的细菌密度统计图。

图5为实施例1的基底抗污性能和温度响应释放性能细菌荧光图，其中的a)、b)、c)分别为基底在24h、48h、72h时37℃表面菌体情况,d)是基底在72h时4℃表面菌体情况，e)各个时间段的细菌密度统计图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本领域技术人员在理解本发明的技术方案基础上进行修改或等同替换，而未脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围内。

实施例1

将0.8gn-异丙基丙烯酰胺(nipam)加入到250ml圆底烧瓶内，再加入0.2g甲基丙烯酸磺酸甜菜碱(sbma)，用100ml去离子水完全溶解药品，继续加入0.05gn,n’-亚甲基双丙烯酰胺(mbaa)，最后加入0.05g引发剂过硫酸钾(kps)，通n230分钟，整个过程在冰水浴中进行。但其通完后将水浴温度升至75℃，反应5小时，得到纯白色浑浊液即产物nipam/sbma微凝胶，在去离子水水中透析3天，透析去除一些小分子杂质，得到抗污-释放微凝胶球，用电子扫描显微镜(sem)观察其表面形貌，结果如图2所示，颗粒均匀。

将单宁酸(ta)和fe³⁺协同组装配合微凝胶沉积在硅片上，首先配置20ml缓冲溶液中包含100mg微凝胶球，87.7mgnacl，340.2mgta和54mgfe³⁺的溶液，加入硅片，液面没过硅片表面，在阴暗环境下沉积6小时，6小时后将所得功能表面用去离子水洗去，并用氮气流吹净，最终得到修饰多功能抗菌表面的基体。

实施例2

将0.9gn-异丙基丙烯酰胺(nipam)加入到250ml圆底烧瓶内，再加入0.1g甲基丙烯酸磺酸甜菜碱(sbma)，用100ml去离子水完全溶解药品，继续加入0.05gn,n’-亚甲基双丙烯酰胺(mbaa)，最后加入0.05g过硫酸钾(kps)，通n230分钟，整个过程在冰水浴中进行。但其通完后将水浴温度升至75℃，反应5小时，得到纯白色浑浊液即产物nipam/sbma微凝胶，在去离子水水中透析3天，透析去除一些小分子杂质，得到抗污-释放微凝胶球。

将单宁酸(ta)和fe³⁺协同组装配合微凝胶沉积在硅片上，首先配置20ml缓冲溶液中包含100mg微凝胶球，87.7mgnacl，340.2mgta和54mgfe³⁺的溶液，加入硅片，液面没过硅片表面，在阴暗环境下沉积6小时，6小时后将所得功能表面用去离子水洗去，并用氮气流吹净，最终得到修饰多功能抗菌表面的基体。

实施例3

将0.7gn-异丙基丙烯酰胺(nipam)加入到250ml圆底烧瓶内，再加入0.3g甲基丙烯酸磺酸甜菜碱(sbma)，用100ml去离子水完全溶解药品，继续加入0.05gn,n’-亚甲基双丙烯酰胺(mbaa)，最后加入0.05g过硫酸钾(kps)，通n230分钟，整个过程在冰水浴中进行。但其通完后将水浴温度升至75℃，反应5小时，得到纯白色浑浊液即产物nipam/sbma微凝胶，在去离子水水中透析3天，透析去除一些小分子杂质，得到抗污-释放微凝胶球。

将单宁酸(ta)和fe³⁺协同组装配合微凝胶沉积在硅片上，首先配置20ml缓冲溶液中包含100mg微凝胶球，87.7mgnacl，340.2mgta和54mgfe³⁺的溶液，加入硅片，液面没过硅片表面，在阴暗环境下沉积6小时，6小时后将所得功能表面用去离子水洗去，并用氮气流吹净，最终得到修饰多功能抗菌表面的基体。

实施例4

将0.8gn-乙烯基己内酰胺(vcl)加入到250ml圆底烧瓶内，再加入0.2g甲基丙烯酸磺酸甜菜碱(sbma)，用100ml去离子水完全溶解药品，继续加入0.05gn,n’-亚甲基双丙烯酰胺(mbaa)，最后加入0.05g过硫酸钾(kps)，通n230分钟，整个过程在冰水浴中进行。但其通完后将水浴温度升至75℃，反应5小时，得到纯白色浑浊液即产物nipam/sbma微凝胶，在去离子水水中透析3天，透析去除一些小分子杂质，得到抗污-释放微凝胶球。

将单宁酸(ta)和fe³⁺协同组装配合微凝胶沉积在硅片上，首先配置20ml缓冲溶液中包含100mg微凝胶球，87.7mgnacl，340.2mgta和54mgfe³⁺的溶液，加入硅片，液面没过硅片表面，在阴暗环境下沉积6小时，6小时后将所得功能表面用去离子水洗去，并用氮气流吹净，最终得到修饰多功能抗菌表面的基体。

实施例5

将0.8gn,n-二乙基丙烯酰胺(deaam)加入到250ml圆底烧瓶内，再加入0.2g甲基丙烯酸磺酸甜菜碱(sbma)，用100ml去离子水完全溶解药品，继续加入0.05gn,n’-亚甲基双丙烯酰胺(mbaa)，最后加入0.05g过硫酸钾(kps)，通n230分钟，整个过程在冰水浴中进行。但其通完后将水浴温度升至75℃，反应5小时，得到纯白色浑浊液即产物nipam/sbma微凝胶，在去离子水水中透析3天，透析去除一些小分子杂质，得到抗污-释放微凝胶球。

将单宁酸(ta)和fe³⁺协同组装配合微凝胶沉积在硅片上，首先配置20ml缓冲溶液包含100mg微凝胶球，87.7mgnacl，340.2mgta和54mgfe³⁺的溶液，加入硅片，液面没过硅片表面，在阴暗环境下沉积6小时，6小时后将所得功能表面去离子水洗去，并用氮气流吹净，最终得到修饰多功能抗菌表面的基体。

实施例6

将0.8gn-异丙基甲基丙烯酰胺(nipmam)加入到250ml圆底烧瓶内，再加入0.2gn-羟乙基丙烯酰胺(heaa)，用100ml去离子水完全溶解药品，继续加入0.05gn,n’-亚甲基双丙烯酰胺(mbaa)，最后加入0.05g过硫酸钾(kps)，通n230分钟，整个过程在冰水浴中进行。但其通完后将水浴温度升至75℃，反应5小时，得到纯白色浑浊液即产物nipam/sbma微凝胶，在去离子水水中透析3天，透析去除一些小分子杂质，得到抗污-释放微凝胶球。

将单宁酸(ta)和fe³⁺协同组装配合微凝胶沉积在硅片上，首先配置20ml缓冲溶液中包含100mg微凝胶球，87.7mgnacl，340.2mgta和54mgfe³⁺的溶液，加入硅片，液面没过硅片表面，在阴暗环境下沉积6小时，6小时后将所得功能表面用去离子水洗去，并用氮气流吹净，最终得到修饰多功能抗菌表面的基体。

实施例7

将0.8gn-乙烯基己内酰胺(vcl)加入到250ml圆底烧瓶内，再加入0.2gn-羟乙基丙烯酰胺(heaa)，用100ml去离子水完全溶解药品，继续加入0.05gn,n’-亚甲基双丙烯酰胺(mbaa)，最后加入0.05g过硫酸钾(kps)，通n230分钟，整个过程在冰水浴中进行。但其通完后将水浴温度升至75℃，反应5小时，得到纯白色浑浊液即产物nipam/sbma微凝胶，在去离子水水中透析3天，透析去除一些小分子杂质，得到抗污-释放微凝胶球。

将单宁酸(ta)和fe³⁺协同组装配合微凝胶沉积在硅片上，首先配置20ml缓冲溶液中包含100mg微凝胶球，87.7mgnacl，340.2mgta和54mgfe³⁺的溶液，加入硅片，液面没过硅片表面，在阴暗环境下沉积6小时，6小时后将所得功能表面用去离子水洗去，并用氮气流吹净，最终得到修饰多功能抗菌表面的基体。

实施例8

将0.8gn-异丙基丙烯酰胺(nipam)加入到250ml圆底烧瓶内，再加入0.2gn-羟乙基丙烯酰胺(heaa)，用100ml去离子水完全溶解药品，继续加入0.05gn,n’-亚甲基双丙烯酰胺(mbaa)，最后加入0.05g过硫酸钾(kps)，通n230分钟，整个过程在冰水浴中进行。但其通完后将水浴温度升至75℃，反应5小时，得到纯白色浑浊液即产物nipam/sbma微凝胶，在去离子水水中透析3天，透析去除一些小分子杂质，得到抗污-释放微凝胶球。

将单宁酸(ta)和fe³⁺协同组装配合微凝胶沉积在硅片上，首先配置20ml缓冲溶液中包含100mg微凝胶球，87.7mgnacl，340.2mgta和54mgfe³⁺的溶液，加入硅片，液面没过硅片表面，在阴暗环境下沉积6小时，6小时后将所得功能表面用去离子水洗去，并用氮气流吹净，最终得到修饰多功能抗菌表面的基体。

对比例1

以未做任何修饰的纯硅片为对比例1。

对比例2

按照实施例1的工艺，对纯硅片表面不沉积微凝胶，配置20ml缓冲溶液包含100mg微凝胶球，87.7mgnacl，340.2mgta和54mgfe³⁺的溶液，加入硅片，液面没过硅片表面，在阴暗环境下沉积6小时，6小时后将基体表面用去离子水洗去，并用氮气流吹净，最终得到单宁酸和铁修饰的基体。

性能测试

采用大肠杆菌(革兰氏阴性菌)和金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)测试聚合物表面的防污，杀菌和再生性能。两种细菌首先在37℃的luria-bertani(lb)琼脂培养基上孵育过夜，然后将平板上的细菌菌落接种到40mllb培养基中，并在37℃振摇10小时。将细菌溶液用纯lb稀释至od值分别对大肠杆菌为0.1和对金黄色葡萄球菌为0.05的稀菌液。

为了进行抗菌测定，基底用75％的乙醇溶液灭菌，并用pbs冲洗，然后将其放入12孔无菌板中。随后，将3ml细菌悬浮液添加至孔中，并在100rpm转速下于37℃下培养预定时间(对于大肠杆菌为24h，对于金黄色葡萄球菌为12h)。培养结束后，将样品分为两部分。将用于测试释放特性的样品放入1mnacl溶液中并轻轻振摇10分钟，然后将所有样品用无菌pbs洗涤3次并使用live/deadbacklightviabilitykit(thermofisherscientificinc.)在黑暗中放置15分钟，用无菌pbs冲洗，然后使用axioobservera1型倒置荧光显微镜进行观察。

杀菌性能：对实施例1、对比例1和对比例2的基体表面进行测试杀菌性能，先把基底浸泡在上述配制的含有细菌大肠杆菌的磷酸盐缓冲盐(pbs)中，近红外激光(808nm,2.2w/cm²)光照5分钟，随后样品用无菌pbs洗涤3次并使用live/deadbacklightviabilitykit(thermofisherscientificinc.)在黑暗中放置15分钟，用无菌pbs冲洗，然后使用axioobservera1型倒置荧光显微镜进行观察。结果如图3所示，其中a)为对比例1无任何修饰的纯硅片基底，b)为对比例2中仅修饰单宁酸和铁离子的硅片基底，c)为实施例1中修饰多功能抗菌表面的基体。

从图3可以看出，实施例1中同时修饰了微凝胶球、单宁酸和铁离子的基片的细菌贴附量明显低于对比例1和对比例2的基底，可见实施例1的多功能抗菌表面具有良好的杀菌性能。

抗污性能：对实施例1和对比例1的基体表面测试长期防污性能，对大肠杆菌(od值：0.1)培养时间为24h、48h、72h。之后，按照上述染色步骤对基体表面进行染色，并检测其抗菌测定。

以对比例1无任何表面功能化的基体作为对照，测试抗污性能，结果如图4所示，其中a)、b)、c)分别为对比例1的基底在24h、48h、72h时表面菌体情况；实施例1的基底在24h、48h、72h时表面菌体情况分别如图5的a)、b)、c)所示。

从图4和图5对比可见，实施例1制备修饰多重功能响应的基体的长期防污性能非常优异。在长达72h的试验后，基底表面的活菌数量仍非常少。

温度响应释放性能：实施例1的抗菌表面的制备过程和温度响应测试过程如图1所示，对实施例1和对比例1的基底进行温度响应测试，测试基体在不同温度(4℃和37℃)下的细菌密度，结果如图4中d)和图5中d)所示，其中图4的d)为对比例1的基底在4℃时基底表面细菌荧光图，图5的d)为实施例1基底4℃时表面细菌荧光图，对比例1和实施例1不同时间和温度下基底表面细菌密度统计图分别在图4的e)和图5的e)。从图中可以发现实施例1的基底相对于对比例1的基底对大肠杆菌具有良好的温度响应，改变环境温度，可有效释放基底表面的死菌，达到良好的细菌释放性能。

对实施例1-3制备的基底进行大肠杆菌的抗污释放实验，结果发现随着nipam含量的上升，在37℃转变到4℃这个条件下，其细菌释放率上升，分别是90％，92％，88％，但是随着sbma含量的下降，其抗污性能也随之下降，以细菌密度达到～1×10⁶/cm²为临界值,超过这个数值则停止实验，实例1～3达到临界值的时间分别为72h,48h和96h。综上以上结果，认为实例1有着良好的综合效果。

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