一株导致广藿香青枯病的病原菌株及其应用的制作方法

本发明属于植物病原菌检测技术领域，特别涉及一株导致广藿香青枯病的病原菌株及其应用。

背景技术：

广藿香青枯病是由细菌引起的一种维管束病害。病原菌从植株根部伤口入侵，在维管束定殖、繁衍，造成植株水分运输困难，引发茎叶萎蔫，直至枯萎死亡。病原菌可在土壤和病残组织中越冬，连作的土地发病更为严重。青枯病在植物整个生长期均可发生，以高温多雨的季节发病最盛。一旦有植株发病，便迅速蔓延，导致大面积的植株死亡。青枯病是广藿香生产中的毁灭性病害。病原菌的分离鉴定对于广藿香青枯病的防治至关重要。

青枯病是最严重的植物病害之一，有50多个科450多种植物遭受青枯病的危害，其中包括药用植物广藿香、木麻黄、罗汉果等。最先报道的青枯病病原菌为劳尔氏菌ralstoniasolanacearum，首先从茄科植物中分离获得，也称为茄科青枯劳尔氏菌(简称青枯菌)。长期以来，人们认为青枯菌属于复合种。通常细菌种内dna-dna同源性应达到70％，但青枯菌低于70％。随着人们对植物病原细菌研究的不断深入和各种分子生物学手段的应用，使得原来彼此有亲缘关系、划归为青枯菌复合种的菌株得以分开，归入不同的菌属。如欧文氏菌属erwinia、科萨克氏菌属kosakonia等的部分菌株均有报道为引起不同寄主植物青枯病的病原菌，这些菌株与劳尔氏菌r.solanacearum的16srdna序列的相似度大于80％。科萨克氏菌属kosakonia能否引起广藿香青枯病并未见报道。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一株导致广藿香青枯病的病原菌株。

本发明的另一目的在于提供上述病原菌株的应用。

本发明对感染青枯病的广藿香植株进行组织浸泡处理，将浸液划线接种于ttc平板。挑取与青枯病病原菌落形态相近的菌株，对广藿香进行致病性回接试验，得到一株强致病性的菌株，经菌落形态、16srdna基因及rpob基因的鉴定，表明该菌株属于科萨克氏菌属(kosakonia)，命名为kosakoniasp.pa82，为广藿香青枯病的新病原菌株。该病原菌株对广藿香具有强致病力，对于广藿香抗病种质的筛选、抗病品种的选育及防治青枯病植物疫苗的研发均有重要意义。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一株导致广藿香青枯病的病原菌株，命名为科萨克氏菌kosakoniasp.pa82，是从具有典型青枯病症状的广藿香植株上分离纯化获得。

所述的菌株kosakoniasp.pa82的保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号：gdmccno：61047，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏日期：2020年7月16日。

所述的菌株kosakoniasp.pa82，以三线法接种至ttc平板，30℃培养24h，该菌在ttc平板上具有明显的流动性，菌落呈红色圆润隆起状，带有白色菌圈，如图1所示。通过革兰氏染色法染色后，菌体呈红色，为革兰氏阴性菌，菌体形态呈短杆状，如图2所示。

所述的菌株kosakoniasp.pa82的16srdna基因序列如seqidno：1所示，序列长度为1538bp。所述的菌株kosakoniasp.pa82的rpob基因序列如seqidno：4所示，序列长度为4029bp。根据其形态特征、16srdna基因序列及rpob基因序列在genbank中的blast结果，鉴定该菌株为科萨克氏菌(kosakonia)。

所述的菌株kosakoniasp.pa82接种至健康的广藿香植株，进行致病性试验，结果如图3所示，该菌株对广藿香具有强致病性，为广藿香青枯病的新病原菌株。

所述的菌株kosakoniasp.pa82在研究青枯病菌的致病机制及挖掘青枯病毒力相关基因中的应用。

所述的菌株kosakoniasp.pa82在广藿香抗病种质的筛选中的应用。

所述的菌株kosakoniasp.pa82在广藿香抗病品种的选育中的应用。

所述的菌株kosakoniasp.pa82在防治广藿香青枯病植物疫苗的研发中的应用。

本发明以广藿香青枯病的强致病力病原菌株kosakoniasp.pa82为材料，利用电击转化法，对其进行tn5转座子插入突变，通过对广藿香植株进行致病性试验筛选获得了致病力减弱的突变株pa82-87-1。对低致病力突变株pa82-87-1的tn5转座子插入位点基因进行克隆，生物信息学分析结果显示，突变株pa82-87-1的转座子插入位点基因的编码蛋白为vi型分泌系统蛋白vgrg。以低致病力突变株pa82-87-1为供试菌株，对广藿香青枯病进行生物防治试验，该突变株对广藿香青枯病的防效可达71.70％。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供的广藿香青枯病新病原菌株kosakoniasp.pa82，为青枯病毒力相关基因及致病机制的研究提供研究材料，为青枯病害的防治研究提供理论基础。

(2)菌株kosakoniasp.pa82对广藿香具有强致病性，以强致病力的病原菌株为胁迫压力筛选抗性植株，研究植株的抗性机制，可以为广藿香抗性品种的培育提供理论依据，并为其他植物青枯病的防治研究提供研究思路。

(3)本发明以广藿香青枯病的强致病力病原菌株kosakoniasp.pa82为材料，采用tn5转座子插入突变技术构建了广藿香青枯病菌pa82的突变株，通过对广藿香的致病性筛选获得了致病力减弱的突变株pa82-87-1。该突变株是由病原菌突变而来，其生长环境和营养需求和致病菌相同，通过竞争及诱导植物潜在抗病性，以发挥植物疫苗的作用。低致病力突变株pa82-87-1对广藿香青枯病的生物防治试验表明，其防效可达71.70％。本发明提供的广藿香青枯病新病原菌株kosakoniasp.pa82对广藿香致病性快且致病力强，对广藿香的亲和性高，为研发防治广藿香青枯病的植物疫苗提供了有价值的菌株材料。

附图说明

图1是菌株pa82在ttc平板上的菌落形态。

图2是菌株pa82在油镜下的菌体形态(1000×)。

图3是菌株pa82对广藿香植株的致病性。

图4是菌株pa82的16srdna(a)及rpob基因(b)的pcr电泳图；其中，m为5000bp的dnamarker。

图5是菌株pa82与相关菌株的16srdna基因的系统发育分析。

图6是菌株pa82与相关菌株的rpob基因的系统发育分析。

图7是抗性克隆的kan^r基因的pcr鉴定；其中，m为2000bpdnamarker；p为tn5转座子(阳性对照)；wt为野生菌株pa82(阴性对照)；1～12为抗性克隆。

图8是突变株pa82-87-1对广藿香植株的致病性。

图9是低致病力突变株pa82-87-1转座子插入位点侧翼序列的扩增；其中，m为2000bp的dnamarker；1为突变株pa82-87-1；2为野生菌株pa82。

图10是低致病力突变株pa82-87-1转座子插入位点基因的pcr扩增；其中，m为5000bp的dnamarker；1为野生菌株pa82；2为突变株pa82-87-1。

图11是重组质粒的双酶切鉴定；其中，m为5000bp的dnamarker；1为nhei单酶切结果；2为nhei及spei双酶切结果。

图12是低致病力突变株pa82-87-1对广藿香青枯病的防治结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1广藿香青枯病菌的分离纯化及致病性测定

(1)分离纯化：从田间采集具有典型青枯病症状的广藿香植株，对发病植株进行组织浸泡处理，将浸液划线接种于ttc平板，30℃培养48h，挑取与青枯病菌菌落形态相似的单菌落进行纯化保种。

其中，ttc平板的培养基为酸水解酪蛋白1.0g/l、葡萄糖5.0g/l、蛋白胨10.0g/l、琼脂粉10g/l及ttc0.05g/l，ph7.2。

(2)菌落形态观察：将纯化保种的菌株以三线法接种至ttc平板，30℃培养24h，观察细菌菌落形态。菌落为光滑的圆形隆起，中央呈红色，带有白色菌圈，具有明显的流动性，如图1所示。

(3)致病性测定：对纯化保种的菌株进行液体培养，所用的培养基是nutrientagar(na)液体培养基，28℃、200r/min恒温振荡培养24h，用无菌水稀释2.5倍，菌液浓度约为5×10⁸cfu/ml；选择苗龄为45d左右、健康的广藿香植株，采用伤根浸泡法，分别将稀释好的菌液接种于广藿香植株，以无菌水处理为空白对照组。将浸泡后的植株转移至温室棚中，维持湿度85％左右、温度28℃～30℃，观察并记录植物1～7d的发病状况。实验重复3次。得到1株强致病性的菌株，记为pa82。pa82的致病性结果如图3，无菌水处理的植株病情指数为0，接种菌株pa82的植株发病速度快，在接种第2d，病情指数即达到63.54％；在接种第7d，病情指数达到73.96％。说明菌株pa82对宿主的亲和性高且致病性强，具有开发为防治广藿香青枯病的植物疫苗的潜力。

实施例216srdna序列鉴定

以菌株pa82基因组dna为模板，对其进行16srdna基因的pcr扩增，引物为：27f：5′-agagtttgatcctggctcag-3′，1541r：5′-aaggaggtgatccagccgca-3′。pcr反应采用25μl体系：27f/1541r(10μm)各1μl，基因组dna1.5μl，ddh2o9.0μl，taq酶12.5μl；反应参数为：94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸100s，35个循环；72℃延伸10min。对pcr样品进行琼脂糖凝胶电泳(图4a)，并对样品进行测序。将16srdna基因的序列结果于ncbi上进行比对，选择相似性较高的菌株及其他植物病原细菌菌株，采用mega5.1软件中的neighbor-joining方法构建16srdna的系统发育树，如图5所示。结果显示：菌株pa82与菌株kosakoniasp.cctccm2018092(genbankaccessionno.cp034225.1)和菌株kosakoniacowaniiesp_z(genbankaccessionno.cp022690.1)聚为一支；blast比对结果显示，菌株pa82的16srdna基因序列与菌株kosakoniasp.cctccm2018092和菌株kosakoniacowaniiesp_z的相似性分别为99.93％和99.80％；推测pa82为科萨克氏菌属(kosakonia)，命名为kosakoniasp.pa82。

所述的菌株pa82的16srdna基因序列如seqidno：1所示，序列长度为1538bp。

实施例3rpob基因序列鉴定

以菌株pa82基因组dna为模板，对其进行rpob基因的pcr扩增，引物为：rpobf：5′-atggtttactcctataccgaga-3′，rpobr：5′-ttactcgtcttccagctcgat-3′。pcr反应采用25μl体系：rpobf/r引物(10μm)各1μl，基因组dna1.5μl，ddh2o9.0μl，taq酶12.5μl；反应参数为：94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸100s，35个循环；72℃延伸10min。对pcr样品进行琼脂糖凝胶电泳(图4b)，并对样品进行测序。将rpob基因的序列结果于ncbi上进行比对，选择相似性较高的菌株及其他植物病原细菌菌株，采用mega5.1软件中的neighbor-joining方法构建rpob基因的系统发育树，如图6所示。结果显示：菌株pa82与菌株kosakoniasp.cctccm2018092(genbankaccessionno.cp034225.1)和菌株kosakoniacowaniiesp_z(genbankaccessionno.cp022690.1)最接近；blast比对结果显示，菌株pa82的rpob基因序列与菌株kosakoniasp.cctccm2018092和菌株kosakoniacowaniiesp_z的相似性均在99％以上。推测pa82为科萨克氏菌属(kosakonia)，命名为kosakoniasp.pa82。

所述的菌株pa82的rpob基因序列如seqidno：4所示，序列长度为4029bp。

因此，根据菌株pa82的形态特征和16srdna基因序列及rpob基因序列在genbank中的blast结果，鉴定pa82为科萨克氏菌属(kosakonia)，命名为kosakoniasp.pa82。

所述的菌株kosakoniasp.pa82的保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号：gdmccno：61047，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏日期：2020年7月16日。

实施例4

(一)菌株kosakoniasp.pa82tn5转座子插入突变株的构建

转座子试剂盒ez-tn5^tm＜kan-2＞tnptransposome^tmkit，购自美国epicentre公司，为tn5转座子(transposon)和转座酶(transposase)复合体，转座子全长1221bp，中间携带卡那霉素抗性(kan^r)基因。

制备菌株kosakoniasp.pa82的感受态细胞(制备方法参照文献“王亚琴,张宇瑶,贺红,等.广藿香青枯病菌tn5转座子插入突变体的构建[j].中国中药杂志,2019,44(01):77-81.”)，分别吸取100μl菌株pa82的感受态细胞悬液与1μltn5转座子充分混匀，转移至0.2cm预冷的电击杯中，冰上放置5min。电击条件为：电压2.5kv，电容25μf和电阻400ω。电击后迅速加入900μl30℃温浴的soc培养基，轻轻混匀，在200r/min，30℃复苏培养1h，将复苏菌液涂布于含有10mg/l卡那霉素的ttc固体培养基上，30℃倒置培养24h。挑取抗性克隆进行kan^r基因的pcr扩增(p1：5'-ggtgcgacaatctatcga-3'和p2：5'-ctcatcgagcatcaaatg-3')，电泳检测结果如图7所示，tn5转座子(阳性对照)与抗性克隆在约700bp处出现特异性条带，而野生菌株未扩增出相应的条带，表明通过电击转化，获得了菌株kosakoniasp.pa82的tn5转座子插入突变株。

(二)菌株kosakoniasp.pa82低致病力突变株的筛选

以(一)中获得的一系列菌株pa82的转座子插入突变株为供试菌株，以野生菌株pa82为对照，进行致病性筛选。分别对菌株进行液体培养，所用的培养基为na液体培养基，在28℃、200r/min条件下恒温振荡培养24h，用无菌水稀释2.5倍，菌液浓度约为5×10⁸cfu/ml；选择苗龄为45d左右、健康的广藿香植株，采用伤根浸泡法，分别将稀释好的菌液接种于广藿香植株，以无菌水处理为空白对照组。将植株转移至温室棚中，维持湿度85％左右、温度28℃～30℃，观察并记录植株1～7d的发病状况。实验重复3次。经致病性筛选，获得1株对广藿香致病力明显减弱的突变株，记为pa82-87-1，如图8所示为突变株pa82-87-1对广藿香的致病性情况。无菌水处理的植株病情指数为0，接种野生菌株pa82的植株病情指数最高，在接种的第7d达到80％以上，而接种突变株pa82-87-1的植株病情指数较野生菌株明显降低。经致病性筛选，获得了低致病力突变株pa82-87-1。

(三)低致病力突变株pa82-87-1转座子插入位点基因的克隆

(1)tn5转座子插入位点侧翼序列的扩增

提取低致病力突变株pa82-87-1的基因组dna，用限制性内切酶hindiii对基因组dna进行酶切，用t4连接酶对酶切产物进行连接。根据tn5转座子序列设计的引物kan-2fp-1(5′-acctacaacaaagctctcatcaacc-3′)及kan-2rp-1(5′-gcaatgtaacatcagagattttgag-3′)，对连接产物进行反向pcr扩增，以获得突变株tn5转座子插入位点的侧翼序列。反应体系：连接产物1.0μl；引物(10μm)各1.0μl；taq预混合酶12.5μl；ddh2o9.5μl。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸7min。对反向pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图9所示，低致病力突变株pa82-87-1扩增出1条条带，而阴性对照菌株pa82未扩增出目的条带。对反向pcr产物进行序列测定，获得tn5转座子插入位点侧翼序列。

(2)tn5转座子插入位点基因的克隆及序列测定

根据tn5转座子插入位点侧翼序列blast比对获得的同源基因序列设计特异性引物：87-1-f：5′-ctagctagcatgttgaacagaattacggtcaag-3′(下划线为nhei酶切位点)，87-1-r：5′-ggactagtttacggtttcgactttttagcatc-3′(下划线为spei酶切位点)。分别以野生菌株及突变菌株基因组dna为模板，以87-1-f及87-1-r为引物对目的基因进行pcr扩增。反应体系：高保真预混合酶45μl；引物(10μm)各2.0μl；dna模板1.0μl。反应条件：98℃预变性2min；98℃变性10s，58℃退火15s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸3min。

取pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图10所示，野生菌株pa82与低致病力突变株pa82-87-1均扩增出特异性条带，条带大小与预期结果一致，转座子全长为1221bp，突变株的条带较野生菌株长1200bp左右。对野生菌株pa82基因组的pcr扩增产物进行切胶回收。将纯化产物与t载体连接，构建重组质粒，采用热激法将重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞，将转化后的菌液涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的lb固体培养基，过夜培养。挑取抗性菌落，进行pcr鉴定，进一步提取阳性克隆质粒进行nhei及spei双酶切鉴定，酶切结果如图11所示，双酶切产物片段大小分别与目的基因及载体的大小基本一致，单酶切产物片段大小约为目的基因与载体的长度之和，表明重组质粒构建成功。经测序，低致病力突变株pa82-87-1转座子插入位点基因的核苷酸序列如seqidno：11所示，全长2613bp，且编码的蛋白为vi型分泌系统蛋白vgrg，tn5转座子插入于该基因的第2144bp与2145bp之间。

所述的低致病力突变株pa82-87-1，命名为科萨克氏菌kosakoniasp.pa82-87-1，其保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号：gdmccno：61048，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏日期：2020年7月16日。

(四)低致病力突变株pa82-87-1对广藿香青枯病的防效试验

以低致病力突变株pa82-87-1为供试菌株，将菌株接种至na液体培养基中，在28℃、200r/min条件下恒温振荡培养24h，用无菌水稀释2.5倍，菌液浓度约为5×10⁸cfu/ml。以苗龄为45d左右、健康的广藿香植株为材料。生防组对广藿香植株灌根预接种低致病力突变株pa82-87-1，3d后再伤根浸泡接种野生菌株pa82。阳性对照组先用无菌水灌根预处理植株，3d后再伤根浸泡接种野生菌株pa82。阴性对照组一直用水处理植株。将试验植株移至适于发病的环境(湿度85％，温度28～30℃)。分别记录接种1～7d的植株发病情况。实验重复3次。生防结果如图12所示，在接种7d后，阳性对照组的病情指数为73.61％，生防组的病情指数为20.83％，低致病力突变株pa82-87-1对广藿香青枯病的防效达到71.70％。

植物病情等级分为5级：0级为植株健康；1级为＜25％的叶片下垂、萎蔫的植株；2级为26％～50％的叶片下垂、萎蔫的植株；3级为51％～75％的叶片下垂、萎蔫的植株；4级为76％～100％的叶片下垂、萎蔫或茎杆弯曲的植株。

植株病情指数＝[∑(各级病株数×相应级数)/(调査总株数×最高级别值)]×100％。

防治效果(％)＝(阳性对照组病情指数-生防组病情指数)/阳性对照组病情指数×100％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>广州中医药大学（广州中医药研究院）

<120>一株导致广藿香青枯病的病原菌株及其应用

<160>13

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1538

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>kosakoniasp.pa82的16srdna核苷酸序列

<400>1

ttgaagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtc60

gaacggtaacaggaagcagcttgctgcttcgctgacgagtggcggacgggtgagtaatgt120

ctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataac180

gtcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcagatgtgcccagatggga240

ttagctagtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagagga300

tgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtgggga360

atattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcg420

ggttgtaaagtactttcagcggggaggaaggcgatgtggttaataaccgcgtcgattgac480

gttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggt540

gcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggat600

gtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatccgaaactggcaggcttgagtctcgta660

gaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggt720

ggcgaaggcggccccctggacgaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaac780

aggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgccctt840

gaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaagg900

ttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcg960

atgcaacgcgaagaaccttacctggtcttgacatccacagaactttccagagatggattg1020

gtgccttcgggaactgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaat1080

gttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggtccggccgg1140

gaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatc1200

atggcccttacgaccagggctacacacgtgctacaatggcgcatacaaagagaagcaatc1260

tcgcgagagctagcggacctcataaagtgcgtcgtagtccggattggagtctgcaactcg1320

actccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtgaatcagaatgtcacggtgaatacgttcc1380

cgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagc1440

ttaaccttcgggagggcgcttaccactttgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaa1500

ggtaaccgtaggggaacctgcggttggatcacctcctt1538

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>27f

<400>2

agagtttgatcctggctcag20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>1541r

<400>3

aaggaggtgatccagccgca20

<210>4

<211>4029

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>kosakoniasp.pa82的rpob基因序列

<400>4

atggtttactcctataccgagaaaaaacgtattcgtaaggattttggtaaacgtccacaa60

gtactggatgttccctatctcctttctatccagcttgactcgttccagaagttcatcgag120

caagatcctgagggccagtacgggctcgaagcggcattccgctccgtgttcccgatcaag180

agctacagcggcaattcggaactgcaatacgtcagctaccgtcttggcgaacccgtattt240

gacgttaaagagtgtcaaatccgtggtgtgacgtactccgccccgctgcgcgtaaaactg300

cgtctggtgatctacgagcgcgaagcgccggaaggcaccgtaaaagacattaaagaacaa360

gaagtctacatgggcgaaattccgctcatgaccgacaacggtacctttgttatcaacggt420

actgagcgtgttatcgtttctcagctgcaccgtagcccgggcgtcttctttgacagcgac480

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