一株白色杆菌及其在防治玉米茎基腐病中的应用的制作方法

本发明涉及一株生防菌及其应用，特别是涉及一株白色杆菌及其在防治玉米茎基腐病中的应用。

背景技术：

玉米茎基腐病是为害玉米根和茎基部的一类重要土传真菌病害。发病率一般为10％左右，严重的达30％以上。我国在广西、湖北、四川、山东、山西、陕西、河北、辽宁、吉林、黑龙江、天津、北京等地，均有发生为害，已成为当前玉米生产上的一大病害。真菌型茎基腐病是由多种病原菌单独或复合侵染造成根系和茎基腐烂的一类病害，主要由腐霉菌pythiumaphanidermatum、镰刀菌fusariummoniliforme、炭疽菌colletotrichumgraminicola、炭腐菌macrophominaphasecolina等引起。镰刀菌引起的茎腐在玉米生长后期会比较普遍。

目前被用来防治由镰刀菌引起的玉米茎基腐病的主要生防菌包括：枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)菌株ynm-3cgmccno.6933，产氮假单胞菌(pseudomonasazotoformans)wxcdd51cgmccno.12760，芽胞杆菌(bacillussp.)wxcdd105cgmccno.12496，枯草芽胞杆菌hr15、萎缩芽胞杆菌hr37和所述贝莱斯芽胞杆菌hr55混合菌群，甲基营养型芽孢杆菌nj13，甲基营养型芽孢杆菌ta-1cctccno.m2018362，哈茨木霉(trichodermaharzianum)菌株ltr-2cgmccno.1498，巨大芽孢杆菌bacillusmegateriumbmjbn02、甲基营养型芽孢杆菌bacillusmethylotrophicusknk-1和蜡状芽孢杆菌bacilluscereusbcjb01和希瓦氏菌shewanellasp.a0b14的混合菌剂，产脲节杆菌(arthrobacterureafaciens)fp64等菌种。用来防止镰刀菌引起的玉米茎基腐病的菌种资源十分有限。

但是，以上公开的现有技术存在菌剂使用后菌种在作物使用部位难以定植或者定植后存活时间短，丰度较低，菌种只是在使用菌剂后的短时时间内具有较好的防病效果，持效期短。目前也并没有公开白色杆菌应用于防治玉米茎基腐病的技术。

技术实现要素：

本发明就是针对上述存在的缺陷而提供一株白色杆菌及其在防治玉米茎基腐病中的应用。本发明所提供的白色杆菌leucobactersp.m6560菌株能够有效防治玉米茎基腐病。该菌株及其细胞悬浮液使用方法简单、易于操作，在施用至玉米根部和叶际后能够长期定植存活并且保持较高的丰度，对玉米形成长效保护，并且效果比化学农药多菌更高。本发明生防菌为玉米病害的绿色防控提供了重要的菌种资源，具有重大应用价值。

本发明的一株白色杆菌及其在防治玉米茎基腐病中的应用技术方案为，一株白色杆菌，所述白色杆菌为白色杆菌leucobactersp.m6560，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)保藏，保藏编号为cgmccno.20598，保藏日期为2020年9月4日。

本发明还保护所述白色杆菌在防治玉米茎基腐病中的应用。

所述玉米茎基腐并是由串珠镰刀菌fusariummoniliforme引起的。

一种用于防治玉米茎基腐病的产品，活性成分包括权利要求1所述白色杆菌leucobactersp.m6560的细胞悬浮液，有效活菌数为10^8-10cfu/ml。

所述白色杆菌leucobactersp.m6560的细胞悬浮液制备方法为：

(1)将白色杆菌大豆酪蛋白琼脂培养基培养物接种于大豆酪蛋白培养基中28-32℃、160-200rpm培养12-18h得到培养物；

(2)将培养物转接到大豆酪蛋白培养基中28-32℃、160-200rpm培养65-75h得到培养液；

(3)收集培养液5000-8000rpm离心10-15min，丢弃上清液，使用含有质量浓度为0.05％吐温-80的无菌磷酸盐缓冲液重悬白色杆菌m6560细胞，得到白色杆菌m6560浓度为10⁸-10¹⁰cfu/ml的细胞悬浮液。

优选的，所述白色杆菌leucobactersp.m6560的细胞悬浮液制备方法为：

(1)将白色杆菌大豆酪蛋白琼脂培养基培养物接种于大豆酪蛋白培养基中30℃、180rpm培养12h得到培养物；

(2)将培养物转接到大豆酪蛋白培养基中30℃、180rpm培养72h得到培养液；

(3)收集培养液6000rpm离心10min，丢弃上清液，使用含有质量浓度为0.05％吐温-80的无菌磷酸盐缓冲液重悬白色杆菌m6560细胞，得到白色杆菌m6560的细胞悬浮液。

一种防治玉米茎基腐病的方法，包括以下两个步骤的至少一种：

(1)使用如权利要求1所述白色杆菌leucobactersp.m6560的细胞悬浮液在玉米播种前拌种；

(2)使用如权利要求1所述白色杆菌leucobactersp.m6560的细胞悬浮液在出苗4-5叶后茎基部及叶面喷雾。

所述拌种具体为：使用白色杆菌leucobactersp.m6560的细胞悬浮液稀释至10⁷-10⁹cfu/ml，将待播种的玉米种子浸泡于稀释后的细胞悬浮液中浸泡10-15min，取出后沥干至不再有悬浮液滴下为止，进行播种。

所述出苗4-5叶后茎基部及叶面喷雾具体为：使用白色杆菌leucobactersp.m6560的细胞悬浮液稀释至10⁷-10⁹cfu/ml，玉米4-5叶期整株喷雾，喷雾时要求液体全面浸湿玉米植株为止。

本发明的有益效果为：

本发明所使用的白色杆菌菌株m6560分离自蒜蛆幼虫的肠道，蒜蛆肠道内因蒜蛆取食大蒜形成强烈的抗生环境，因此，该菌株对不利环境具有极强的适应性，在施用至玉米根部和叶际后能够长期定植存活并且保持较高的丰度，对玉米形成长效保护，并且效果比化学农药多菌更高。

本发明所提供的白色杆菌m6560菌株能够有效防治玉米茎基腐病。该菌株及其细胞悬浮液使用方法简单、易于操作，在施用至玉米根部和叶际后能够长期定植存活并且保持较高的丰度，对玉米形成长效保护，并且效果比化学农药多菌更高。本发明生防菌为玉米病害的绿色防控提供了重要的菌种资源，具有重大应用价值。

附图说明

图1所示为本发明菌株m6560的16srdna的pcr产物电泳图；

图2所示为本发明菌株m6560的16srdna的亲缘进化关系分析；

图3所示为本发明菌株m6560对串珠镰刀菌(fusariummoniliforme)的拮抗活性；其中左侧为菌株m6560，右侧为对照；

图4盆栽实验效果；其中左侧为使用m6560处理后的玉米幼苗，右侧为接种病原菌对照组；

图5所示为本发明菌株m6560在玉米根部长期定植情况；

图6所示为本发明菌种m6560在玉米叶际长期定植情况。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。

实施例1

分离和鉴定

菌株分离样品为采集自山东省泰安市范镇蒜田的葱地种蝇幼虫，将采集的幼虫放入封口袋并记录。封口袋置于冰盒保存运送回实验室待用。幼虫带回实验室后，使用75％的乙醇消毒液进行体表消毒15s,随后使用无菌水清洗。消毒过程反复三次。消毒后的幼虫置于解剖镜下，使用眼科手术剪将幼虫头部和尾部交掉，随后从虫体侧面将幼虫剖开，取出肠道。肠道置于1.5ml离心管内，加入100μl磷酸盐缓冲液后充分研磨。10倍梯度稀释至10-8，然后将稀释液涂布于大豆酪蛋白培养基平板，28℃培养箱培养24h后，挑取单菌落划线于新的大豆酪蛋白培养基平板，挑取划线后的单菌落保存在大豆酪蛋白培养基琼脂平板。

将获得的纯菌株使用大豆酪蛋白培养基培养12h后，取25μl加入到pda平板边缘一侧距离平板外缘0.5cm处，随后在接种点对侧一处接种串珠镰刀菌菌饼，对照使用等体积液体大豆酪蛋白培养基代替菌液，每个细菌菌株设置3个平行对照，于26℃黑暗条件下培养5天后，观察串珠镰刀菌的生长情况和抑菌圈情况。挑选对串珠镰刀菌生长有明显抑制作用的细菌菌株进行鉴定。

将所得菌株使用大豆酪蛋白培养基培养12h后，取1ml菌液2000g离心10min收集菌体，使用dna提取试剂盒提取菌株基因组dna。采用细菌16srdna通用引物1492r(5’-ggctcgagcggccgcccgggttaccttgttacgactt-3’)和8f(5’-gcggatccgcggccgctgcagagtttgatcctggctcag-3’)以基因组dna为模板对细菌16srdna序列进行扩增，扩增后pcr产物(见图1)送上海生工生物有限公司测序，并将序列上传至genbank数据库，所得序列号为mt808905，使用genbank数据库进行鉴定时，菌株m6560序列与leucobacter属相似性较高，但与模式菌株存在一定差异(见图2)，最终鉴定为leucobactersp.。该菌株已经保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国，北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2020年9月4日，保藏号：cgmccno.20598。

实施例2

白色杆菌m6560与串珠镰刀菌的对峙培养试验

使用60mm培养皿准备pda平板待用，在pda平板边缘一侧距离平板外缘0.5cm处打孔。将白色杆菌m6560少量平板培养物接种于大豆酪蛋白培养基30℃、180rpm培养12h后，取25μl加入到pda平板边缘一侧孔内，随后在接种点对侧一处接种串珠镰刀菌菌饼，对照使用等体积液体大豆酪蛋白培养基代替菌液，每个细菌菌株设置3个平行对照，于26℃黑暗条件下培养5天后，观察串珠镰刀菌的生长情况和抑菌圈情况。结果表明，白色杆菌m0055对串珠镰刀菌产生显著的抑制作用(见图3)。

实施例3

盆栽实验

少量白色杆菌m6560大豆酪蛋白琼脂培养基培养物接种于1ml大豆酪蛋白培养基中30℃、180rpm培养12h。上述培养物转接到内含150ml大豆酪蛋白培养基的三角瓶中30℃、180rpm培养72h；收集6瓶培养液6000rpm离心10min，丢弃上清液，使用含有质量浓度为0.05％吐温-80的无菌磷酸盐缓冲液100ml重悬白色杆菌m6560细胞，得到白色杆菌m6560细胞悬浮液母液。随后，继续使用上述无菌磷酸盐缓冲液将细胞悬浮液母液稀释至浓度为10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰cfu/ml。

使用上述不同浓度白色杆菌m6560细胞悬浮液稀释液，将一组20颗玉米种子浸泡于稀释后的细胞悬浮液中浸泡10-15min，取出后沥干(不再有悬浮液滴下为止)进行播种。另外一组20颗玉米种子浸泡于无菌的清水进行如上处理，沥干后播种。使用栽培基质进行移栽上述幼苗，基质中每100g添加串珠镰刀菌孢子悬浮液(10²cfu/ml)500ml充分浸湿，充分浸湿的基质装盆后播种上述两组经过处理的玉米种子。玉米品种为郑单958。两组玉米置于两个托盘中培养，避免交叉污染。玉米幼苗置于光照培养箱培养，温度30℃，光周期l:d＝16:8，相对湿度50％。玉米出苗4-5叶后，使用白色杆菌m6560细胞悬浮液不同浓度稀释液，整株喷雾，喷雾时要求液体全面浸湿玉米植株为止。10天后，观察玉米幼苗的发病情况。上述实验重复三次，计算发病率。结果如表1所示，接种白色杆菌m6560显著降低了盆栽实验中玉米茎基腐病的发病率，随着使用剂量的增加，玉米茎基腐病发病率逐渐降低，10⁸、10⁹和10¹⁰cfu/ml浓度下效果较好。

表1盆栽实验结果

实施例4白色杆菌m6560在玉米茎基腐病防治中的应用

于2020年5月-8月在山东省泰安市马庄镇进行田间试验。玉米品种为郑单958。

少量白色杆菌m6560大豆酪蛋白琼脂培养基培养物接种于1ml大豆酪蛋白培养基中30℃、180rpm培养12h。上述培养物转接到内含150ml大豆酪蛋白培养基的三角瓶中30℃、180rpm培养72h；收集培养液6000rpm离心10min，丢弃上清液，使用含有0.05％吐温-80的无菌磷酸盐缓冲液100ml重悬白色杆菌m6560细胞，得到白色杆菌m6560浓度为10⁹cfu/ml的细胞悬浮液。

试验分三组处理。第一组在玉米播种时使用上述10⁹cfu/ml的白色杆菌m6560细胞悬浮液进行拌种处理。10⁹cfu/ml的的细胞悬浮液用量为每公斤玉米种子500ml悬浮液。细胞悬浮液加入种子后充分搅拌混匀，晾干后播种。玉米出苗4-5叶后，使用10⁹cfu/ml的白色杆菌m6560细胞悬浮液1000倍稀释液，整株喷雾，喷雾时要求液体全面浸湿玉米植株为止。第二组使用灭菌水代替白色杆菌m6560细胞悬浮液进行如上的拌种和苗后喷雾处理，作为对照组。第三组使用多菌灵水溶液(多菌灵有效剂量为10mg/ml)代替第一组处理中的白色杆菌m6560细胞悬浮液稀释液进行拌种处理；使用多菌灵水溶液(多菌灵有效剂量为10mg/l)进行苗后喷雾处理。每组分为5个小区进行试验。在玉米吐丝期调查病情指数。

玉米茎基腐病发病程度分级标准如下：0级：无症状，叶片绿色；1级：叶鞘出现1～2个水渍状病斑，病茎不变软，青枯叶片占全株1/4以下；3级：植株茎基部变色，手捏有软感，青枯叶片占全株1/4～1/2；5级：植株茎部明显变软，果穗下垂，青枯叶占全株1/2～2/3；7级：植株茎部松软，甚至折茎倒伏，青枯叶占全株2/3以上。

病情指数＝∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)×100

防效(％)＝(对照组病情指数-实验组病情指数)/对照组病情指数×100

结果表明，白色杆菌m6560处理组的病情指数为0.62％，防效高达63.09％；而多菌灵处理组的病情指数为0.92％，防效为45.23％。两组的病情指数与清水对照组相比显著下降，并且，白色杆菌m6560对串珠镰刀菌引起的玉米茎基腐病防效优于多菌灵。

表2田间试验结果

*此列中数值后不同字母代表差异显著(one-wayanova,p<0.05)

实施例5

白色杆菌m6560在玉米根部和叶际的定植情况

于2020年5月-8月在山东省泰安市马庄镇进行田间试验。玉米品种为郑单958。

少量白色杆菌m6560大豆酪蛋白琼脂培养基培养物接种于1ml大豆酪蛋白培养基中30℃、180rpm培养12h。上述培养物转接到内含150ml大豆酪蛋白培养基的三角瓶中30℃、180rpm培养72h；收集培养液6000rpm离心10min，丢弃上清液，使用含有0.05％吐温-80的无菌磷酸盐缓冲液100ml重悬白色杆菌m6560细胞，得到白色杆菌m6560浓度为10⁹cfu/ml的细胞悬浮液。在玉米播种时使用上述10⁹cfu/ml的白色杆菌m6560细胞悬浮液进行拌种处理。10⁹cfu/ml的的细胞悬浮液用量为每公斤玉米种子500ml悬浮液。细胞悬浮液加入种子后充分搅拌混匀，晾干后播种。玉米出苗4-5叶后，使用10⁹cfu/ml的白色杆菌m6560细胞悬浮液1000倍稀释液，整株喷雾，喷雾时要求液体全面浸湿玉米植株为止。于出苗后的0(未处理)、10、20、30、40、50天分别采集玉米根部样品，使用1g根部样品充分清洗表面后，清洗液提取dna备用。于苗后喷雾的0(未处理)、10、20、30、40、50天分别采集玉米心叶样品，使用50g心叶样品充分清洗表面后，清洗液提取dna备用。使用浓度为10⁹cfu/ml的白色杆菌m6560lb培养液1ml提取dna，还然后使用无菌水进行10倍梯度稀释(10^-1-10^-9)，使用白色杆菌m6560的特异性引物进行荧光定量pcr扩增实验，建立荧光值与细胞数的标准曲线。随后，通过标准曲线确定m6560在黄瓜根际的定植情况。结果表明，在使用白色杆菌m6560悬浮液处理后的第10天，白色杆菌m6560在根际的定植数量达到每克根1.1×10⁷cfu，在使用白色杆菌m6560浮液处理后的50天内，白色杆菌m6560在根际的定植数量稳定在每克根10⁵cfu数量级，能够在玉米根部长期定植(说明书附图图5)。同样，在使用白色杆菌m6560悬浮液喷雾后的50天内，白色杆菌在心叶的定植量达到10³cfu/50g，能够在叶际长期定植(说明书附图图6)。

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