一种含有NK细胞的药物组合物及其治疗癌症的用途的制作方法

本发明涉及生物制药领域，更具体的涉及一种含有nk细胞的药物组合物及其治疗癌症的用途。
背景技术：
：多发性骨髓瘤(multiplemyeloma，mm)是b淋巴细胞来源的血液系统恶性增殖性疾病，以骨髓中单克隆浆细胞异常增殖为特征，临床上主要表现为贫血、高钙血症、肾功能不全、骨破坏等。近年来随着蛋白酶体抑制剂(pis)、免疫调节剂(imids)等药物的广泛应用，mm患者的预后得到了明显改善，但复发在所难免。据统计，难治/复发mm(rrmm)患者的中位总生存(os)仅15个月。近十年来，mm的免疫治疗已取得突破性的进展。应用异基因造血干细胞移植(allogeneichematopoieticstemcelltransplantation，allo-hsct)和供者淋巴细胞输注(donorlymphocyteinfusion，dli)治疗，可使得一部分mm患者受益，其原因是供者淋巴细胞的移植物抗肿瘤(graftversustumor，gvt)效应。然而，供者淋巴细胞不具有骨髓瘤的特异性免疫活性，介导的是非特异性的免疫反应，移植物抗宿主病(graftversushostdisease，gvhd)的存在增加了患者接受移植后的死亡率，限制了allo-hsct和dli在临床上的广泛应用。因而，目前正在积极地寻求更有效的免疫疗法，以诱导更特异、更稳定和更有效的抗骨髓瘤免疫反应应答，同时降低治疗相关的风险。随着分子生物学和肿瘤免疫学的迅速发展和交叉渗透，催生了一系列极具应用前景的mm治疗方法，如单克隆抗体(monoclonalantibodies，mabs)、免疫检查点抑制剂(immunecheckpointinhibitors)、树突状细胞疫苗(dendriticcellvaccines)及嵌合抗原受体t细胞(chimericantigenreceptortcells，car-t)等免疫疗法在治疗mm中取得了令人可喜的成效。单克隆抗体通过与mm细胞表面相应靶抗原结合，诱发抗体依赖细胞介导的细胞毒性(adcc)、抗体依赖的细胞吞噬作用(adcp)、补体依赖的细胞毒性(cdc)等，最终达到杀伤肿瘤细胞的目的。目前为止，已报道的免疫治疗的靶抗原有：b细胞成熟抗原(bcma)，cd19，cd38，cd56，cd138，slamf7，il-6受体，vegf受体，免疫球蛋白，整合素β以及g蛋白偶联受体家族成员5d(gprc5d)等。比如埃罗妥珠单抗是slamf7的特异性人源化抗体，它通过直接激活nk细胞和触发adcc两条途径诱发骨髓瘤细胞死亡。isatuximab(isa)是由赛诺菲公司开发的igg1单克隆抗体，可与造血细胞和肿瘤细胞[包括多发性骨髓瘤(mm)细胞]表面表达的cd38结合，通过多种生物学机制发挥抗肿瘤作用，如抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用和补体依赖的细胞毒作用等。2020年3月2日，美国食品和药物管理局(fda)批准isa联合泊马度胺和地塞米松(isa-pom-dex)用于治疗既往至少接受过2种药物(包括来那度胺和1种蛋白酶体抑制剂)治疗的mm成人患者。最新研究表明，接受isa-pom-dex治疗的mm患者中位无进展生存期为11.5个月，客观缓解率为60.4％(93/154)，常见不良反应有中性粒细胞减少、血小板减少和贫血等。单克隆抗体治疗为mm患者带来了新的希望，但是单一的抗体治疗仍然存在着疗效不稳定、耐药等多种问题，因此，探讨单克隆抗体与其他免疫治疗及靶向治疗策略的有效联合，最大程度地提高治疗有效率，降低毒副作用，延缓和逆转耐药的发生是研究的中药方向。nk细胞又称自然杀伤细胞，是一类大颗粒淋巴细胞，是执行非mhc限制性杀伤功能的主要细胞，也是体内天然防御功能中的重要组分。nk细胞无须抗原刺激，可非特异直接杀伤肿瘤和病毒感染的靶细胞，在机体免疫监视和早期抗感染和免疫过程中起重要作用。nk细胞来源于骨髓造血干细胞，其发育成熟依赖于骨髓及胸腺微环境，占淋巴细胞总数的9％～25％。自然杀伤(nk)细胞是高细胞毒性的免疫细胞，杀死他们的目标是非特异性的，因此，将nk细胞用于癌细胞的杀伤变得尤为有力。但是目前，针对多发性骨髓瘤的治疗还没有涉及nk细胞与抗体联合使用的报道。技术实现要素：本发明克服了现有技术的缺陷，提供了一种有效治疗多发性骨髓瘤方法。所述方法，包括使用发明人优化得到的nk细胞以及新制备的靶向cd38的抗体组合制备的药物组合物来治疗多发性骨髓瘤。本发明一方面提供了一种药物组合物，其包含nk细胞以及靶向cd38的抗体。本发明另外一方面，提供一种高活性nk细胞的制备方法，包括以下步骤:收集全血，用ficoll密度梯度离心法分离pbmcs，用巴氏吸管吸取界面层单个核细胞，洗涤两次，备用诱导nk细胞。制备缓冲液，提前倒取冲洗液40ml。用0.2um单向滤孔膜过滤缓冲液和冲洗液。cd1610ul+pbs2ml提前24小时包培养皿。将pbmcs计数，每1×107个细胞加40ul缓冲液，抗体10ul。混匀，4℃放置5分钟。加入30ul缓冲液，磁珠20ul每107个细胞用缓冲液配细胞悬液至500ul，混匀，每500ul液体中最多含108个细胞。4℃静置10分钟。准备磁场，将分选柱置于磁场中，用500ul缓冲液冲洗分选柱。待液体停止流动。加细胞悬液至分离柱中，进行分选，然后加缓冲液500ul洗涤分离柱3次。收集洗下的细胞，再用新的分选柱重复上述步骤1次，纯化收集到的细胞。将所述细胞加入ifn-γ750u/ml，il-2800u/ml,il-15150u/ml，20％fbs。置于37℃，5％co2的培养箱中培养3天。3天后加入新鲜培养液和800u/mlil-2,250u/mlil-15，及20％fcs，调细胞浓度至2x106/ml，每天晃动细胞培养瓶，使细胞处于分散悬浮状态，每3天进行一次计数，每3天补充新的800u/mlil-2,250u/mlil-15，及20％fcs培养基。培养18天即收获所述的高活性nk细胞。本发明对用来扩增活化nk细胞的来源个体不作限制，只要输血传染病筛查合格就可以。根据本发明的一个实施例，所述hank细胞是通过体外活化至少以下一种来自体内的nk细胞获得的：所述患者的nk细胞、所述患者的半相合的nk细胞和无关异体的nk细胞。所称的患者的半相合nk细胞指来自患者亲属的nk细胞。例如，采集患者自身的pbmc制备nk细胞，最好是在常规治疗前；或者采集患者亲属的，即半相合的pbmc制备nk细胞；或者是无关个体的pbmc制备nk细胞或脐带血制备nk细胞，则不受这种限制。本发明另外一方面，提供一种特异性结合cd38的单克隆抗体，所述抗体为通过文库经过多轮筛选获得的。其中抗体的重链可变区为seqidno：1所示，轻链可变区为seqidno：2所示。所述的抗体药物为单抗或者为多克隆抗体。一个抗体分子上的两个抗原结合部位可以是相同的，也可以是不同的，即双特异性抗体，位于两臂末端称抗原结合片段(antigen-bindingfragment，fab)。根据本发明的一个实施例，所称的抗体药物为包括fc段的完整单抗。根据本发明的一个较佳实施例，所述药物组合物中的nk细胞中的nk细胞和抗体药物的比例为1×106至5×107个：10mg/kg)。抗体药物给药时，医生或者药物说明书会根据患者情况给出使用量，体外试验以及动物试验表明，给药时联合给予该特定比例的nk细胞，能够显著的增强治疗癌症的效果。有益效果本发明提供了一种高活性的治疗多发性骨髓瘤的药物组合物，其中组合物包含发明人优化得到的nk细胞以及新制备的靶向cd38的抗体。所述nk细胞的制备方法通过磁珠筛选以及特异性的诱导优化获得了高活性、高纯度的nk细胞，所述靶向cd38的单抗也具有较好的结合特性以及特异性。该组合物能够有效的抑制多发性骨髓瘤移植瘤的生成，具有极佳的应用价值。附图说明图1nk细胞培养天数对应的扩增数量结果图图2抗体抑制细胞实验结果图图3抗体+nk细胞抑制细胞实验结果图图4组合物抑制小鼠移植瘤体积变化图具体实施方式下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1高活性nk细胞的制备将肝素化的新鲜血液用无菌生理盐水稀释一倍，在15ml离心管内加入4ml淋巴细胞分离液将离心管倾斜，沿管壁缓慢注入稀释后全血8ml，使血液均匀分布在上层并与分离液形成明显界面。用ficoll密度梯度离心法分离pbmcs，在20℃下，离心力1800转/min，离心20min,分离液与血清交界面层为pbmcs，用巴氏吸管吸取界面层单个核细胞，洗涤两次，备用诱导nk细胞。制备缓冲液(含pbs900ul，fbs100ul，macsrs液19ml)，提前倒取冲洗液40ml。用0.2um单向滤孔膜过滤缓冲液和冲洗液。cd1610ul+pbs2ml提前24小时包培养皿。将1份pbmcs计数，每1×107个细胞加40ul缓冲液，抗体10ul。混匀，4℃放置5分钟。加入30ul缓冲液，磁珠20ul每107个细胞。用缓冲液配细胞悬液至500ul，混匀，每500ul液体中最多含108个细胞。4℃静置10分钟。准备磁场，将分选柱置于磁场中，用500ul缓冲液冲洗分选柱。待液体停止流动。加细胞悬液至分离柱中，进行分选，然后加缓冲液500ul洗涤分离柱3次。收集洗下的细胞，再用新的分选柱重复上述步骤1次，纯化收集到的细胞。将所述细胞加入ifn-γ750u/ml，il-2800u/ml,il-15150u/ml，20％fbs。置于37℃，5％co2的培养箱中培养3天。3天后加入新鲜培养液和800u/mlil-2,250u/mlil-15，及20％fcs，调细胞浓度至2x106/ml，每天晃动细胞培养瓶，使细胞处于分散悬浮状态，每3天进行一次计数，每3天补充新的800u/mlil-2,250u/mlil-15，及20％fcs培养基。培养18天。用直接免疫荧光标记法进行流式细胞仪分析。将nk细胞悬液密度调至1×107/ml，取50ul细胞悬液，加20ulcd3-fitc，20ulpe-cd56，涡旋2秒，避光，4℃保存30分钟。hanks缓冲液洗涤两次，立即上机检测，每个样本数>5×104个。获取样本中细胞表面决定簇cd3、cd56阳性表达率，用fitc标记同型小鼠抗人igg作为相应的阴性对照。检测培养18天nk细胞，确定细胞所占比例。结果如图1所示，培养第0天细胞体积小，镜下多散在，圆形透亮，通过前期的磁珠筛选使得nk细胞更加纯净，通过特异性的诱导方法诱导培养到第18天，细胞数目达到了1.15×1010个，具有较好的扩增效果，比现有技术的培养方法得到的细胞数量均要高得多。流式细胞术检测结果显示，第0天的nk细胞cd3-cd56+阳性率为(12.33±2.41)％，而培养18d的nk细胞cd3-cd56+阳性率(98.79±4.52)％，差异有统计学意义(p＜0.01)。所述纯度已经相当高，可以用于相应的临床试验。实施例2nk细胞的杀伤实验将u266接种于含有10％胎牛血清的rpmi1640培养液中，37℃、5％co2、湿度饱和的恒温培养箱中培养，每1-2天传代1次，取对数生长期细胞为实验对象。ldh释放法测定细胞杀伤活性:取对数生长期的u266细胞用含10％fcs的rpmi1640调整细胞密度为1×104/ml，在96孔培养板中，每孔加100μlu266细胞(靶细胞)，其中靶细胞自然释放孔不加效应细胞nk细胞，只加100μl培养液；最大释放孔加100μl1％np40；实验孔分别按实验孔分别1：1、5：1、10：1、20：1的体积比加入等浓度的nk细胞100μl，每种均做3个复孔，37℃、5％co2培养4～6h，加入显色反应体系，490nm波长(参考波长650nm)测定其吸光度a值，按照ldh释放法计算杀伤活性:杀伤活性(％)＝[(实验组a值－总自然释放a值)/(最大释放组a值－总自然释放a值)]×100％。结果如下表1所示。表1nk细胞毒活性测定结果nk细胞/u266细胞比例杀伤活性(％)1:1(43.8±2.1)％5∶1(55.2±3.7)％10：1(66.8±4.5)％20：1(73.1±5.2)％从表1可以看出，nk细胞毒活性测定效靶比为1：1、5：1、10：1、20：1时，nk细胞对u266细胞对杀伤率分别为(43.8±2.1)％、(55.2±3.7)％、(66.8±4.5)％、(73.1±5.2)％，随效靶比增加，杀伤活性增强(p＜0.05)。从最佳的使用条件来看，选择10:1的靶效比的nk细胞进行杀伤实验是比较有利的。实施例3靶向cd38单克隆抗体的制备按照wo2012009568的方法或者本领域常规的人工酵母库合成方法生成天然人合成酵母库，繁殖表达单克隆抗体的酵母细胞系并对其进行高通量筛选和择取。以市售的生物素化的人cd38抗原蛋白进行筛选。在室温下，将酵母细胞(约1010个细胞/文库)与3ml的100nm生物素化的单体人cd38抗原蛋白在含0.1％bsa的facs洗涤缓冲液pbs中一起培育15分钟。在用50ml冰冷的洗涤缓冲液洗涤一次之后，使细胞团块重悬于40ml洗涤缓冲液中，并将500μl链霉亲和素微珠添加至酵母细胞中并在4℃下培育15分钟。接下来，使酵母细胞沉淀，重悬于5ml洗涤缓冲液中，并将其装载至macsls柱上。在装载5ml之后，用3mlfacs洗涤缓冲液洗涤柱3次。从磁场中移出柱，用5ml生长培养基洗脱酵母细胞，然后使其生长过夜。在两轮macs之后，使用流式细胞术(facs)进行五轮分选。对于第一轮facs选择，使约4×107个酵母细胞沉淀，用洗涤缓冲液洗涤三次，并分别与100nm生物素化单体人cd38抗原蛋白一起在室温下培育10分钟。接着，洗涤酵母细胞两次，并在4℃下，用以1:100稀释的山羊抗人f(ab')2κ-fitc以及二抗，即以1:500稀释的链霉亲和素-alexafluor633染色15分钟。在用冰冷的洗涤缓冲液洗涤两次之后，使细胞团块重悬于0.4ml洗涤缓冲液中并将其转移至滤网封盖的分选管中。使用facsaria分选仪(bdbiosciences)执行分选并确定分选门(sortgate)仅选择cd38结合。使用食蟹猕猴cd38蛋白作为反筛。接着，针对人cd38结合对这些池进行分选以在第二轮facs中鉴别交叉反应性结合物，由此减少试剂的多特异性结合物。第四轮facs主要由使用100nm生物素化单体cd38作为抗原进行的阳性选择组成。来自第四轮facs分选输出的重链被用来制备轻链多样化文库以用于额外的四轮选择。第一轮选择涉及了miltenyimacs珠粒与作为抗原的100nm生物素化单体人cd38或200nm生物素化单体鼠类cd38缀合。在mac珠粒选择之后，执行三轮facs分选。第一轮facs涉及100nm或10nm的人cd38。在进行上述第二轮facs的同时，用75-100nm的竞争剂igg进行了竞争选择。在选择之后，用1或10nm的人cd38抗原蛋白进行第三次阳性分选，并随后涂板。使酵母克隆生长至饱和，然后在振荡中于30℃下诱导48小时。诱导之后，使酵母细胞沉淀并收集上清液进行纯化。使用蛋白质a柱纯化igg并用ph2.0的乙酸洗脱。将分选得到的纯化后的抗体进行抗cd38抗体的亲和力(affinity)测量。用fortebio测量cd38抗体的kd来测定这些抗体的亲和力。结合能力较强的前7个的数据展示如下表2所示。表2mab抗体的kd值从表2可以看出，本发明通过筛选获得了7个具有较好结合特性的单克隆抗体。其中2b4和4d6的结合特性最好。并且，经过检测，2b4和4d6只和人cd38蛋白结合，不与重组食蟹猕猴和小鼠的cd38胞外蛋白结合，具有较好的特异性。以下实验针对2b4单抗进行了研究。通过轻重链可变区序列进行分析，获得2b4单抗重链可变区序列为seqidno：1；轻链可变区序列为seqidno：2。实施例42b4抗体抑制细胞实验将u266接种于含有10％胎牛血清的rpmi1640培养液中，37℃、5％co2、湿度饱和的恒温培养箱中培养，每1-2天传代1次，取对数生长期细胞为实验对象。收集对数生长期的细胞，以5×103个/孔接种于96孔板，设4个重复孔，各组加2b4单抗至终质量浓度分别为0、6.25、12.5、25、50、100μg/ml，于37℃、5％co2培养箱中孵育24h。每孔加入10μlmtt溶液，在细胞培养箱内继续孵育4h。每孔加入100μlformazan溶解液，适当混匀，在细胞培养箱内继续孵育。直至在普通光学显微镜下观察发现formazan全部溶解，在570nm测定吸光度，计算细胞存活率和抑制率。96孔板上无细胞只有营养液和mtt反应试剂的孔为空白组，有u266细胞而未添加单抗的孔为阴性对照组，计算细胞存活率和抑制率。细胞存活率＝(a实验－a空白)/(a对照－a空白)100％。结果如图2所示。从图2的结果可以看出，2b4单抗对骨髓瘤u266细胞的体外增殖有明显的抑制作用。与对照组相比，随着抗体浓度的增高，骨髓瘤u266细胞存活率逐渐降低，在100μg/ml浓度时，细胞生存率只有(20.2±1.1)％。实施例52b4抗体联合nk细胞抑制细胞实验将u266接种于含有10％胎牛血清的rpmi1640培养液中，37℃、5％co2、湿度饱和的恒温培养箱中培养，每1～2天传代1次，取对数生长期细胞为实验对象。收集对数生长期的细胞，以1×104个/孔接种于96孔板，设4个重复孔，各组加2b4单抗50μg/ml，nk细胞分别为1×103/ml、5×103/ml、1×104/ml、5×104/ml、1×105/ml，于37℃、5％co2培养箱中孵育24h。每孔加入10μlmtt溶液，在细胞培养箱内继续孵育4h。每孔加入100μlformazan溶解液，适当混匀，在细胞培养箱内继续孵育。直至在普通光学显微镜下观察发现formazan全部溶解，在570nm测定吸光度，计算细胞存活率。96孔板上无细胞只有营养液和mtt反应试剂的孔为空白组，细胞存活率＝(a实验－a空白)/(a对照－a空白)100％。结果如图3所示。从图3可以看出，本发明采用抗体与nk细胞的组合使用后，具有显著的系统增效的治疗效果，能够显著的抑制癌细胞的增殖，在浓度为1×105/mlnk+2b450微克/ml的治疗下，癌细胞的生存率只有5％，具有较好的效果。实施例6多发性骨髓瘤小鼠模型的治疗实验随机等数量将25只裸鼠分为五组：a组：未移植组；b组：u266移植组；c组：单抗+nk细胞移植组；d组：nk细胞移植组；e组：单抗移植组。用胰蛋白酶消化对数生长期的u266，离心，计数，配制成每1ml含1×107个u266无血清dmem/f12悬液。a组注射等量的生理盐水于裸鼠背部皮下作为对照；b组只注射0.1mlu266(1×106个细胞)悬液注射于balb/c裸鼠背部皮下。c组：将10mg/kg的治疗剂量2b4单抗和0.2mlnk细胞悬液(5×107个细胞)+0.1mlu266(1×106个细胞)悬液经尾静脉注射裸鼠背部皮下。d组：0.2mlnk细胞悬液(5×107个细胞)+0.1mlu266(1×106个细胞)悬液经尾静脉注射裸鼠背部皮下。e组：10mg/kg的治疗剂量2b4单抗+0.1mlu266(1×106个细胞)悬液经尾静脉注射裸鼠背部皮下。监测肿瘤生长情况：自移植之日起，每天定时观察裸鼠体内肿瘤细胞的生长情况，待肿瘤出现后用游标卡尺测量肿瘤的长、宽(长与宽垂直)最大值，分别记为a、b，计算肿瘤体积。肿瘤出现后第3周处死裸鼠，整块取下肿瘤，测体积。结果如下图4所示。在裸鼠体内，移植的无论是nk细胞还是2b4单抗均能够能有效抑制移植的u266移植瘤的生长。生长曲线显示在21d，采用2b4单抗和nk细胞的组合治疗能够显著的降低移植瘤的体积生长，在第21d，体积只有(211±3.5)mm3，显著小于对照的(3005±3.5)mm3。序列表<110>北京广未生物科技有限公司<120>一种含有nk细胞的药物组合物及其治疗癌症的用途<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>120<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvallysglnglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyglualasersertyrpro202530metiletrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalser354045seraspserglyglyserasntyrilevalseralaaspservalasp505560alaargphethrileserargaspasnalalysasnserleutyrleu65707580sermetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcysval859095leugluproiletyrthrseralathrpropheaspsertrpglygln100105110glyargmetvalilevalserser115120<210>2<211>107<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gluilevalleuthrglnserproalathraspserleuserprogly151015gluargalathrleusercysglualaserglnsermetasnsertyr202530leusertrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleuile354045tyrvalalaserglyargalaserglyileproalaargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleugluser65707580gluaspphealavaltyrtyrcysserserhisvalglyphepropro859095asnpheglyglyglythrglyvalgluilelys100105当前第1页1 2 3 

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