一种高效联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的多菌混合转化体系及建立方法与流程

本发明属于生物工程
技术领域：
，具体涉及一种高效联产3-羟基丙酸和1,3丙二醇的多菌混合转化体系及建立方法。
背景技术：
：3-羟基丙酸和1,3-丙二醇是工业上两种重要的平台化合物，作为生物可降解性聚合物的前体物质和食品添加剂广泛使用。3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的生产有化学合成法和生物法两种。化学法多以不可再生资源作为原料，其生产过程能耗大，产物副产物多难以分离纯化，生产过程产生不可估量的环境污染。生物法合成3-羟基丙酸和/或1,3-丙二醇多以葡萄糖和甘油作为底物，其中以甘油作为底物生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇步骤简单，研究充分，原料廉价，且能解决甘油过剩的问题。目前，由于生物合成3-羟基丙酸的过程需要消耗辅酶nad+产生nadh，1,3-丙二醇的生产恰恰相反，将nadh转变为nad+，只能将3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的生产分开进行，否则会造成微生物体内辅酶的不平衡，影响反应持续进行，导致最终产量低。罗伊氏乳杆菌具有强大的甘油代谢潜力，但其代谢甘油生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的过程中会产生具有细胞和酶毒性的3-羟基丙醛，且3-羟基丙醛的产生速率远大于1,3-丙二醇。3-羟基丙醛的快速积累对细胞和酶系造成毒害，反应也随之停止。只有解除罗伊氏乳杆菌转化甘油过程中间代谢物3-羟基丙醛抑制问题，才能提升3-羟基丙酸和1,3-丙二醇最终产量。因此，亟需设计出一种多菌混合转化体系来提升3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的产量。技术实现要素：针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种高效联产3-羟基丙酸和1,3丙二醇的多菌混合转化体系及建立方法。本发明中，采用多菌混合转化体系来代谢甘油，并对该体系进行优化，通过引入高效代谢3-羟基丙醛的基因工程菌，快速代谢罗伊氏乳杆菌生成的毒性中间代谢产物3-羟基丙醛。运用此策略成功解除毒性中间代谢产物3-羟基丙醛的积累，使得反应持续进行，最大限度地将甘油转化成最终产物3-羟基丙酸和1,3-丙二醇。本发明是通过以下技术手段实现上述技术目的的。本发明首先提供了一种高效联产3-羟基丙酸和1,3丙二醇的多菌混合转化体系，该体系中包括罗伊氏乳杆菌和基因工程大肠杆菌；以质量分数计，所述体系中，罗伊氏乳杆菌25%-75%，基因工程大肠杆菌25%-75%。进一步的，所述基因工程大肠杆菌为琥珀酸半醛脱氢酶工程大肠杆菌e.colibl21/pany-gabd4（简称e.coligabd4）、1,3-丙二醇氧化还原酶工程大肠杆菌e.colibl21/pany-pduq（简称e.colipduq）以及联合表达琥珀酸半醛脱氢酶和1,3-丙二醇氧化还原酶的工程大肠杆菌e.colibl21/pany-gabd4-pduq（简称e.coligabd4-pduq）中的一种或多种。进一步的，所述体系中菌体总浓度为10-30g/l细胞干重。进一步的，以质量分数计，所述体系为50%罗伊氏乳杆菌和50%联合表达琥珀酸半醛脱氢酶和1,3-丙二醇氧化还原酶的工程大肠杆菌，其中菌体总浓度为20g/l细胞干重。本发明还提供了上述高效联产3-羟基丙酸和1,3丙二醇的多菌混合转化体系的构建方法，具体包括如下步骤：（1）静息细胞的制备：将罗伊氏乳杆菌fxz014（lactobacillusreuterifxz014）在含40mm甘油的mrs培养基中生长12h，然后在8000rpm、4℃、5min离心收集菌体，经0.1m磷酸钾缓冲液（ph7.0）洗涤2次后，得到罗伊氏乳杆菌静息细胞，备用；将基因工程大肠杆菌分别在37℃、220rpm摇床培养至od600为0.4-0.6之间时加入终浓度为0.5mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（iptg），25℃、120rpm过夜诱导目标蛋白表达，然后经8000rpm、4℃、5min离心分别收集菌体，经0.1m磷酸钾缓冲液（ph7.0）洗涤2次后，得到基因工程大肠杆菌静息细胞；备用。其中，罗伊氏乳杆菌fxz014参照文献zabedhm,zhangy,guoq,etal.co-biosynthesisof3-hydroxypropionicacidand1,3-propanediolbyanewlyisolatedlactobacillusreuteristrainduringwholecellbiotransformationofglycerol[j].journalofcleanerproduction,2019,226(432-42.中所述方法进行筛选。（2）高效联产3-羟基丙酸和1,3丙二醇的多菌混合转化体系的建立：将上述制备的罗伊氏乳杆菌静息细胞分别与基因工程大肠杆菌混合，即得多菌混合转化体系。在体系中，以质量分数计，罗伊氏乳杆菌25%-75%，基因工程大肠杆菌25%-75%。本发明还提供了上述多菌混合转化体系的应用，所述应用为代谢甘油高效联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明采用多菌混合转化策略，解决了罗伊氏乳杆菌单菌转化过程中毒性中间代谢物3-羟基丙醛抑制问题。通过整合能高效转化3-羟基丙醛为3-羟基丙酸或\和1,3-丙二醇的基因工程菌，建立6个双菌和三菌混合转化体系，缓解了中间代谢物抑制问题。本发明对最优混合转化体系中联合表达琥珀酸半醛脱氢酶和1,3-丙二醇氧化还原酶的基因工程大肠杆菌进行utr工程修饰，使得其中琥珀酸半醛脱氢酶和1,3-丙二醇氧化还原酶高效平衡表达，解决了3-羟基丙醛转化为3-羟基丙酸和1,3-丙二醇过程中的辅酶nad+和nadh供应问题，使得基因工程大肠杆菌自身能够实现辅酶nad+和nadh的循环再生。本发明还开发出适配上述最优转化体系的两步法以及分批补料生物转化技术，进一步解决了目前技术存在的中间产物抑制和辅酶nad+和nadh供应问题，使得反应持续高效进行，最终3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的总产量达到214.39g/l，为迄今为止最高水平，具有广阔的应用前景与实际意义。附图说明图1为本发明所述不同混合转化体系（cs）生产能力对比结果。图2为双菌混合转化体系cs-2的转化条件优化结果。图3为不同utr修饰的双菌混合转化体系cs-2的比较结果。图4为最优双菌混合转化体系cs-2-v3在不同甘油负载下的生产能力。图5为使用一步法以及两步法转化技术在不同甘油浓度下的产量。图6为采用两种分批补料生物转化技术进行生产的结果。图7为单菌、双菌以及三菌转化体系的生产能力对比。图8为使用不同生物转化技术的最优产量对比。具体实施方式下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。实施例1：基因工程大肠杆菌的构建：（1）琥珀酸半醛脱氢酶工程大肠杆菌e.colibl21/pany-gabd4（简称e.coligabd4）：根据钩虫贪铜菌编码琥珀酸半醛脱氢酶的基因gabd4序列和载体pany1上基因元件特征，利用oligo7.0软件设计引物：pany-f:5’-atgtatatctccttcttaaagt-3’、pany-r:5’-cctccatgggagctcctg-3’、gabd4-f1：5’-taactttaagaaggagatatacatatgtaccaagatctggcactgt-3’和gabd4-r1：5’-tgcaggagctcccatggaggttacgcttgggtgatgaact-3’。使用pany-f和pany-r引物对扩增pany1载体骨架（不包含6×histag和ccdb表达盒），pcr反应参数：预变性，98℃1min；变性，98℃10s；退火，55℃10s；延伸，72℃30s；终止延伸，72℃5min；32个循环后得到pany1载体骨架。使用gabd4-f1和gabd4-r1引物对扩增含有同源臂的gabd4基因片段，pcr反应参数：预变性，98℃1min；变性，98℃10s；退火，55℃10s；延伸，72℃30s；终止延伸，72℃5min；32个循环后得到gabd4基因。将上述两个基因片段按无缝克隆试剂盒说明方法进行重组连接，将pany1载体骨架与gabd4基因按1:3（mol/mol）混合，加入一倍体积的2×multifseamlessassemblymix，50℃连接30min；通过热激转化法将重组载体转化e.colibl21感受态细胞中，将连接产物加入感受态细胞并混匀，冰上放置30min，42℃热激60s，冰上冷却2min后加入900µllb培养基，37℃孵育1h后涂布含50µg/ml的卡那霉素平板；使用质粒小提试剂盒提取质粒验证其大小是否正确；最终将质粒送苏州金唯智生物公司进行基因测序；结果成功筛选获得重组工程菌株，命名为e.colibl21/pany-gabd4，简称e.coligabd4。（2）1,3-丙二醇氧化还原酶工程大肠杆菌e.colibl21/pany-pduq（简称e.colipduq）：利用罗伊氏乳杆菌编码1,3-丙二醇氧化还原酶的基因pduq序列和载体pany1构建1,3-丙二醇氧化还原酶工程大肠杆菌e.colibl21/pany-pduq，其方法与步骤（1）基本相同，仅有如下区别：引物：pduq-f1：5’-taactttaagaaggagatatacatatggaaaaatttagtatgccaac-3’和pduq-r1：5’-tgcaggagctcccatggaggttaacgaattattgcttcgtaaat-3’。（3）联合表达琥珀酸半醛脱氢酶和1,3-丙二醇氧化还原酶的工程大肠杆菌e.colibl21/pany-gabd4-pduq（简称e.coligabd4-pduq）：利用步骤（1）和（2）中得到的载体pany-gabd4和pany-pduq设计引物：gabd4-f2：5’-cctccatgggagctcctg-3’、gabd4-r2：5’-ttacgcttgggtgatgaactt-3’、pduq-f2：5’-agttcatcacccaagcgtaatggccttttgctgg-3’和pduq-r2：5’-tgcaggagctcccatggaggttaacgaattattgcttc-3’。其他步骤与步骤（1）中基本相同，得到联合表达琥珀酸半醛脱氢酶和1,3-丙二醇氧化还原酶的工程大肠杆菌e.colibl21/pany-gabd4-pduq。实施例2：（1）静息细胞的制备：将罗伊氏乳杆菌fxz014在mrs培养基（10g/l胰蛋白胨、10g/l牛肉浸膏、5g/l酵母粉、2g/l磷酸氢二钾、5g/l乙酸钠、2g/l柠檬酸氢二铵、0.1g/l硫酸镁、0.15g/l硫酸锰、1g/l吐温80和20g/l葡萄糖）中37℃静置过夜活化，接着在含40mm甘油的mrs培养基中37℃厌氧条件下扩大培养12h；然后经8000rpm、4℃冷冻离心菌液5min，收集细胞，弃上清；最后用0.1m磷酸钾缓冲液（ph7.0）洗涤，离心，得到罗伊氏乳杆菌fxz014静息细胞，备用。将e.coligabd4、e.colipduq以及e.coligabd4-pduq三种菌株分别经过夜活化于lb培养基（10g/l胰蛋白胨、10g/l氯化钠和5g/l酵母粉）中，然后以1%（v/v）接种量在37℃、220rpm条件下扩大体积培养，当od600为0.4-0.6时iptg，使得iptg的终浓度为0.5mm，接着25℃、150rpm下过夜诱导蛋白表达；然后经8000rpm、4℃冷冻离心菌液5min，收集细胞，弃上清；最后用0.1m磷酸钾缓冲液（ph7.0）洗涤，离心，分别得到e.coligabd4静息细胞、e.colipduq静息细胞以及e.coligabd4-pduq静息细胞，备用。（2）静息细胞干重的测量与换算：将过夜活化的菌种，分别以1%接种量接种于5瓶含50ml对于培养基的锥形瓶中，在适宜条件下进行培养；每隔3小时测量其中一瓶培养物的od600，记录后，离心收集菌体，并使用0.1m磷酸钾缓冲液（ph7.0）洗涤细胞两次，弃上清后于烘箱烘干水分，至细胞重量不变为止；最终得到5个不同od600值以及对应的细胞干重（cdw），通过线性拟合工具，得到od600与cdw的近似关系：1od600≈0.34g/lcdw。实施例3：多菌混合转化体系的建立及筛选本实施例中考察了添加了不同菌后的多菌混合转化体系代谢甘油联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的产量，以此来筛选出最优的多菌混合转化体系。将不同种类和含量的菌混合，获得多菌混合转化体系，试验组1~6中分别添加了不同种类、含量的菌，具体配方如表1所示。表1.多菌混合转化体系的配方编号配方150%罗伊氏乳杆菌fxz014+25%e.coligabd4+25%e.colipduq250%罗伊氏乳杆菌fxz014+50%e.coligabd4-pduq375%罗伊氏乳杆菌fxz014+12.5%e.coligabd4+12.5%e.colipduq475%罗伊氏乳杆菌fxz014+25%e.coligabd4-pduq525%罗伊氏乳杆菌fxz014+37.5%e.coligabd4+37.5%e.colipduq625%罗伊氏乳杆菌fxz014+75%e.coligabd4-pduq将试验组1~6中不同配方的多菌混合转化体系（细胞干重为15g/l）分别转化30g/l的甘油溶液，4h后分别取样采用高效液相色谱法测定其中3-hp和1,3-pd浓度，其测定条件为：aminexhpx-87h(300×7.8mm)色谱柱，示差折光检测器，流速0.6ml/min，柱温65℃。图1为测定结果，从图1中可以看出双菌混合转化体系（cs-2、cs-4、cs-6）中3-hp和1,3-pd总产量显著高于相同条件下的三菌混合转化体系（cs-1、cs-3、cs-5），其中以混合转化系cs-2的3-hp和1,3-pd产量最高，分别达到14.73g/l和10.38g/l。实施例4：双菌混合转化体系cs-2的条件优化本实施例中分别考察了不同细胞干重（20、25和30g/l）、底物浓度（40、50和60g/l）以及转化时间（3、4和5h）对混合转化体系cs-2的影响，进一步优化实施例3中所得的混合转化体系cs-2。图2为试验结果，结果表明，在4h之前，所有条件下3-hp和1,3-pd产量都明显提升，4h之后几乎不再变化；当细胞干重为20g/l和甘油浓度为60g/l时，混合转化体系产量达到最大值45.15g/l，其中3-hp和1,3-pd浓度分别为26.33和18.82g/l。实施例5：utr工程优化双菌混合转化体系（1）utr修饰的双菌混合体系建立与筛选：本实施例中分别采用5种具有不同gabd4表达量的utr工程菌代替e.coligabd4-pduq来进一步优化实施例3中筛选得到的双菌混合转化体系cs-2，5种utr工程菌分别为e.coliv1、e.coliv2、e.coliv3、e.coliv4和e.coliv5，通过utr工程和基因工程手段得到，其gabd4表达量由弱到强。静息细胞制备参照实施例2，将l.reuterifxz014静息细胞分别和e.coliv1、e.coliv2、e.coliv3、e.coliv4以及e.coliv5静息细胞按1:1的比例混合，进而得到如下体系cs-2-v1、cs-2-v2、cs-2-v3、cs-2-v4和cs-2-v5。试验按实施例4中的最优条件进行：细胞干重为20g/l，甘油浓度60g/l，ph8.5，转化时间4h。试验结果如图3所示，相较双菌体系cs-2，所有经utr修饰的双菌体系均表现出更高的产量（图3a），其中由e.coliv3组成的双菌体系cs-2-v3表现最佳，其几乎消耗完60g/l甘油（图3c），且产生的中间代谢物3-hpa也最少（图3b），终产物3-hp和1,3-pd产量高达32.37和22.64g/l。（2）高底物负载下的产量对比：本步骤中考察了步骤（1）中的得到的最优双菌体系cs-2-v3在更高甘油负载时的表现，比较了在高甘油负载时一步法和两步法转化甘油联产3-羟基丙酸和1，3-丙二醇的能力。一般来说，高的底物浓度是高产的先决条件，且上述最优双菌体系cs-2-v3几乎可以完全消耗60g/l甘油，因此对于双菌体系cs-2-v3进行高浓度底物转化试验，使用更高浓度甘油（70、85、100和120g/l）在ph8.5，细胞干重20g/l，30℃条件下进行转化试验。试验结果如图4，更高的甘油负载下3-hp和1,3-丙二醇产量更高（图4a），但随之也导致更多的甘油残余（图4c）；在高浓度甘油负载下中间代谢物3-hpa积累较多，但差异不显著（图4b）；有趣的是，通过对ph的测定，发现随着反应的进行，ph逐渐降低，单ph降低至6时，反应几乎停止（图4d）。实施例6：一步法和两步法生物转化一步法：将双菌混合体系cs-2-v3运用于高的底物甘油浓度（120、140和160g/l）,细胞干重20g/l，ph8.5，30℃，180rpm下转化4h后测定各组分浓度。两步法：收集一步法转化反应液，调节ph至8.5，再次添加20g/l新鲜静息细胞（50%l.reuterifxz014+50%e.coliv3）,再次反应4h后测定各组分浓度。试验结果如图5所示，双菌混合体系cs-2-v3一步法转化不能完全利用120g/l以及更高浓度的甘油，且随着底物浓度增大，底物抑制效应和中间代谢物抑制效应越大；在一步法基础上进行的二步法转化可以完全利用120g/l的甘油，最终产生69.36和47.58g/l的3-hp和1,3-pd，未检测到中间产物3-hpa。使用两步法转化140g/l甘油时，虽然产量较120g/l甘油有所提升，但仍然有12.56g/l甘油未能转化。使用更高浓度的甘油160g/l时，由于底物和中间产物抑制作用，产量甚至低于使用140g/l底物的产量。实施例7：连续分批补料生物转化本实施例为了完全解除底物和中间产物抑制作用，针对双菌混合体系cs-2-v3开发了2种分批补料生物转化技术，极大提升了其联产3-hp和1,3-pd的能力。（1）连续补加甘油初始条件为细胞干重20g/l，甘油20g/l，ph8.5,30℃，180rpm。转化2h后，收集样品分析其组分，补加20g/l的甘油，然后调节ph至8.5；每2小时重复以上步骤，直至最终产量不再变化为止。试验结果如图6a所示，采用分批补加低浓度底物的策略，反应持续进行直至18h停止，共生成3-hp94.56g/l和1,3-pd64.13g/l。（2）连续补加甘油和静息细胞初始条件为细胞干重10g/l，甘油20g/l，ph8.5,30℃，180rpm。转化2h后，收集样品分析其组分，补加20g/l的甘油以及细胞干重为3g/l的静息细胞，然后调节ph至8.5；每2小时重复以上步骤，直至最终产量不再变化为止。试验结果如图6b所示，在初始低浓度静息细胞和低浓度底物情况下，几乎解除了中间代谢物和低温抑制现象，新鲜添加的静息细胞也使得反应持续时间更长，最终经24h反应，消耗240g/l甘油，产生3-hp和1,3-pd共计214.39g/l，其中3-hp产量125.93g/l，1,3-pd产量88.46g/l。生产3-hp和1,3-pd强度高达8.93g/l/h，为迄今为止最高水平。对比例1：单菌、双菌和三菌混合转化甘油产量对比本实施例中分别考察单菌、双菌、三菌转化甘油产量的差异，分别设定了单一l.reuterifxz01420g/l，双菌l.reuterifxz01410g/l和e.colibl21/pany-gabd4-pduq10g/l以及三菌l.reuterifxz01410g/l、e.colibl21/pany-gabd45g/l和e.colibl21/pany-pduq5g/l转化体系。分别与40g/l底物甘油在30℃、180rpm下反应6h，随后测定3-羟基丙酸、1,3-丙二醇以及甘油残余浓度。如图7所示，使用单菌进行转化积累了大量中间代谢物3-hpa，仅产生了8.9g/l的3-羟基丙酸和6.2g/l的1,3-丙二醇，；相对单菌转化，采用多菌混合转化策略，显著缓解了中间产物的抑制作用，提高了3-羟基丙酸和1,3-丙二醇产量。其中，双菌转化的策略效果最佳，产，产生3-羟基丙酸15.3g/l和1,3-丙二醇11.9g/l。对比例2：一步法、两步法以及连续分批补料生物转化的产量对比本实施例中分别考察了双菌体系cs-2-v3运用不同转化技术联产3-hp和1,3-pd的差异，一步法、两步法分别按前文实施例中的方式进行，分别增加底物甘油浓度，直至产量不再增加为止，结果如图8所示，普通一步法转化，总产量最低，仅有85.2g/l；而本发明开发的两步法，使得总产量提升了36%；此外，本发明开发的两种分批补料生物转化技术更是具有无与伦比的优势，总产量近乎是普通一步法的两倍多，达到214.39g/l，这也是迄今为止的最优水平。所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。当前第1页1 2 3 

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