一种原发性小头畸形疾病模型及其构建方法和应用与流程

本发明涉及生物医学领域中的疾病相关基因和脑科学技术领域，具体而言，涉及一种原发性小头畸形疾病模型及其构建方法和应用。

背景技术：

原发性小头症，是指无明显诱因引起的婴儿出生后头围低于同龄同性别同种族水平。目前，对于原发性小头症尚无有效的药物治疗手段，因而发现新基因及揭示其致病机制对于原发性小头症的预测(产前诊断)和诊断以及开发潜在的治疗药物有指导意义。

鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种原发性小头畸形疾病模型及其构建方法和应用。

本发明是这样实现的：

第一方面，实施例提供了一种用于构建原发性小头畸形疾病模型的方法，其包括诱导分化tyw1基因失活的人胚胎干细胞。

第二方面，实施例提供了一种原发性小头畸形疾病模型，其由前述实施例所述的用于构建原发性小头畸形疾病模型的方法构建。

第三方面，实施例提供了如前述实施例所述的原发性小头畸形疾病模型在筛选用于预防或治疗原发性小头畸形疾病的药物中的应用。

第四方面，实施例提供了一种用于诊断或预测原发性小头畸形疾病的生物标志物，所述生物标志物选自tyw1基因突变体。

第五方面，实施例提供了一种前述实施例所述的生物标志物在用于诊断、治疗或预测原发性小头畸形疾病的试剂盒中的应用。

第六方面，实施例提供了一种用于诊断、治疗或预测原发性小头畸形疾病的试剂或试剂盒，其包括用于检测待测样本基因组中tyw1基因突变的核酸组合。

本发明具有以下有益效果：

本发明实施例提供了在筛选用于预防或治疗原发性小头畸形疾病的药物中的应用，该构建方法包括诱导分化tyw1基因失活的人胚胎干细胞，经发明人研究发现，tyw1基因为原发性小头畸形疾病的致病基因，参与苯丙氨酸转运rna修饰。通过构建tyw1基因失活的人胚胎干细胞并诱导分化为类脑，能够获得原发性小头畸形疾病模型，为原发性小头畸形疾病的致病机制以及潜在的药物开发提供了一种新的途径。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1中tyw1敲除的细胞系的检测结果；

图2为实施例1中tyw1敲除型类脑在不同培养阶段的形态大小比较；

图3为实施例1中tyw1敲除型类脑在不同培养阶段的表面积比较；

图4为实施例1中tyw1敲除型类脑在不同培养阶段的脑室带厚度比较；

图5为验证例中临床发现的原发性小头畸形患儿家系图谱；

图6为验证例中外显子组测序分析发现的原发性小头症患儿tyw1突变的基因位点；

图7为验证例中tyw1基因在动物模型小鼠和斑马鱼大脑组织中的表达验证结果；

图8为验证例中tyw1基因在斑马鱼敲除后中枢神经系统发育结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

首先，本发明实施例提供了一种用于构建原发性小头畸形疾病模型的方法，其包括诱导分化tyw1基因失活的人胚胎干细胞。随着类脑技术的发展，类脑已经被用来模拟寨卡病毒引起的小头畸形、基因变异引起的小头畸形。tyw1蛋白的功能为参与苯丙氨酸转运rna修饰，本发明实施例提供的tyw1突变型类脑器官有可能为转运rna以及氨酰转运rna合成酶缺陷导致小头畸形提供研究模型。

tyw1基因失活是指tyw1基因不表达或降低表达活性，从而使tyw1蛋白降低或丧失其蛋白功能。在一些实施方式中，所述tyw1基因失活包括对人胚胎干细胞中的tyw1基因进行突变、插入或敲除。

优选地，tyw1基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

在一些实施方式中，所述方法包括将tyw1基因失活的人胚胎干细胞诱导分化为人源化类脑器官。

需要说明的是，上述人胚胎干细胞选自现有的人胚胎干细胞细胞系，对细胞系的选择不做具体的限制。在一些实施方式中，上述人胚胎干细胞选自现有的任一人胚胎干细胞细胞系，包括但不限于h1、h7、h9、h13和h14。

优选地，所述诱导分化包括：将人胚胎干细胞经胚层分化和神经外胚层分化后得到初始的神经组织进行神经上皮组织分化，以形成3d结构的人源化类脑器官。

在一些实施方式中，对于人胚胎干细胞经胚层分化、神经外胚层分化和神经上皮组织分化的具体过程不作限制，过程中可以采用任何现有的胚层分化培养基和神经诱导培养基，也可以采用现有的诱导分化方法进行培养，只要是能实现将人胚胎干细胞最终诱导分化为类脑器官，则属于本申请的保护范围。

优选地，所述胚层分化包括：采用培养基a培养人胚胎干细胞至出现胚层分化特征；对获得的拟胚体采用培养基b培养至拟胚体形成边界清晰的结构。需要说明的是，培养基a和培养基b均为用于诱导胚层分化的培养基。

优选地，所述培养基a的组分包括：含15％～25％kosr的dmem/f12、0.5％～1.5％glutmax、0.5％～1.5％非必需氨基酸neaa、10～30μmy27632以及2～6ng/mlfgf；

培养基b的组分包括：15％～25％kosr的dmem/f12、0.5％～1.5％glutmax、0.5％～1.5％非必需氨基酸neaa以及0.5％～1.5％抗生素。

优选地，采用培养基a的培养时间为3～5天，采用培养基b的培养时间为1～3天。人胚胎干细胞培养基中含有高水平的bfgf用于维持其干性，没有bfgf则干细胞会自我分化。在诱导分化的培养基a中含有低水平的bfgf，b中不含bfgf，是为了逐步降低bfgf水平，在维持细胞活力的同时达到分化的目的。在分化的时候人胚胎干细胞要从克隆生长的状态被消化成单细胞，添加y27632可以促进细胞在单细胞状态下的活力。在细胞形成拟胚体之后，可以不依赖y27632而存活，因而在培养基a中需要y27632，而在b中不需要y27632。

在一些实施方式中，所述神经外胚层分化包括：采用神经诱导培养基对经培养基b培养后获得的拟胚体进行培养，以获得初始的神经组织。

优选地，神经诱导培养基以dmem/f12为基础培养基，其组分为(1)或(2)：

(1)0.1％～1.0％n-2(minusvitamina)、0.5％～1.5％glutmax、0.5％～1.5％非必需氨基酸neaa、5～15μg/ml肝素、0.5～1.5μma83-01、0.05～0.15μmldn-193189以及0.5％～1.5％抗生素；需要说明的是，n-2是一种用于培养神经细胞的添加剂。

(2)0.1％～1.0％n-2(minusvitamina)、0.5％～1.5％glutmax、0.5％～1.5％非必需氨基酸neaa、5～15μg/ml肝素、8～12μmsb431542、1～4μmdorsomorphin以及0.5％～1.5％抗生素；

优选地，所述神经外胚层分化的培养时间为5～8天。

在一些实施方式中，所述神经上皮组织分化包括：采用神经组织分化培养基对所述初始的神经组织进行培养；

优选地，神经组织分化培养基的组分包括：40％～60％dmem/f12、40％～60％神经基础培养基、0.1％～1.0％n-2(minusvitamina)、0.5％～1.5％b27、0.5％～1.5％glutmax、0.5％～1.5％非必需氨基酸neaa、1.5～3.5ng/ml胰岛素和0.5％～1.5％抗生素；

优选地，神经上皮组织分化的时间为3～5天。

优选地，所述方法还包括将神经上皮组织分化后的类脑进行长期培养。随着培养时间的延长，类脑的体积也不断增加，可根据实际需要选择长期培养的时长。

优选地，长期培养的培养基为含1.5～3.5ng/ml胰岛素的神经分化培养基。

在一些实施方式中，所述方法包括通过基因编辑技术对人胚胎干细胞中的tyw1基因进行突变、插入或敲除。对于基因编辑技术的选择不作限制，只要能实现tyw1基因的失活，以用于制备原发性小头畸形疾病模型的构建，则属于本申请的保护范围。

在一些实施方式中，所述基因编辑技术选自：crispr/cas9技术、zfn技术、talens技术和cre-loxp基因敲除技术中的任意一种。

本发明实施例还提供一种原发性小头畸形疾病模型，其由如前述任一实施方式所述的用于构建原发性小头畸形疾病模型的方法构建。

本发明实施例还提供如前述实施例所述的原发性小头畸形疾病模型在筛选用于预防或治疗原发性小头畸形疾病的药物中的应用。

本发明实施例还提供了一种用于诊断或预测原发性小头畸形疾病的生物标志物，所述生物标志物选自tyw1基因突变体。

优选地，所述突变体的突变位点包括tyw1基因c.616c>t和/或c.1166g>a。

本发明实施例还提供了前述任一实施方式所述的生物标志物在制备用于诊断、治疗或预测原发性小头畸形疾病的试剂盒中的应用。

优选地，所述试剂盒包括用于检测所述生物标志物的试剂。

优选地，所述试剂包括引物对和/或探针。

此外，本发明实施例还提供了一种用于诊断、治疗或预测原发性小头畸形疾病的试剂或试剂盒，其包括用于检测待测样本基因组中tyw1基因突变的核酸组合。

优选地，所述tyw1基因突变包括至少一个突变位点：c.616c>t和c.1166g>a。经研究发现，上述2个突变位点与原发性小头畸形疾病相关。具体地，c.616c>t突变位点的信息为：nm_018264：c.616c>t，p.arg206cys。c.1166g>a突变位点的信息为：c.1166g>a，p.arg389gln。

优选地，所述核酸组合包括引物对和/或探针。

优选地，引物对包括序列如seqidno.2～3所示的引物对1和/或序列如seqidno.4～5所示的引物对2。

引物对1的序列：

tyw1-r206c-f:tttcctcttccttagcggca(seqidno.2)；

tyw1-r206c-r：caatcctcccaactccacct(seqidno.3)；

引物对2的序列：

tyw1-r389q-f:ctccaggatgcattccctta(seqidno.4)；

tyw1-r389q-r：tcgatcaccatgacctttca(seqidno.5)。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种用于构建原发性小头畸形疾病模型的方法，其包括诱导分化tyw1敲除型人胚胎干细胞；tyw1基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

(1)基因敲除

采用crispr/cas9技术对人胚胎干细胞h1细胞系进行基因编辑，获得tyw1敲除型人胚胎干细胞。通过基因组测序证明敲除细胞系产生移框突变(如图1中a所示)，通过westernblot验证蛋白表达(如图1中b所示)。

对获得的tyw1敲除型人胚胎干细胞依次经胚层分化、神经外胚层分化以及神经上皮组织分化，参照附图2中a，具体如下。

(2)胚层分化

配置培养基a和培养基b。其中，所述培养基a的组分包括：含20％kosr的dmem/f12、1％glutmax、1％非必需氨基酸neaa、20μmy27632以及4ng/mlfgf；培养基b的组分包括：20％kosr的dmem/f12、1％glutmax、1％非必需氨基酸neaa以及1％抗生素；

采用培养基a以90000细胞每毫升重悬tyw1敲除型人胚胎干细胞，以每孔100微升细胞悬液接种于超低黏附v形底96孔板。用平板离心机以150g离心2分钟，在显微镜下拍照记录细胞聚集情况(如图2中bday0所示)。置于37℃常氧培养箱培养。48小时后观察拟胚体形成情况，每孔加入100微升新鲜培养基a，分化第4天，将96孔板每孔培养基a吸出150微升，然后加入150微升新配置培养基b，注意不要吸出拟胚体，培养3天。

(3)神经外胚层分化

配置神经诱导培养基。具体地，神经诱导培养基以dmem/f12为基础培养基，包括以下组分：0.5％n-2(minusvitamina)、1％glutmax、1％非必需氨基酸neaa、10μg/ml肝素、1μma83-01、0.1μmldn-193189以及1％抗生素。

分化的第7天(天数从最开始培养起计算)，将形成的细胞球转移到超低黏附6孔板，采用神经诱导培养基，以40转每分钟的速度在摇床上摇动培养。注意用宽口径枪头转移拟胚体，隔天换液，培养5天。更换培养基时应注意避免反复碰触拟胚体。

(4)神经上皮组织分化

配置神经组织分化培养基，其包括以下组分：50％dmem/f12、50％神经基础培养基、0.5％n-2(minusvitamina)、1％b27、1％glutmax、1％非必需氨基酸neaa、2.5ng/ml胰岛素和1％抗生素。

在分化的第12天后，采用神经组织分化培养基进行培养4天。4天后，对类脑进行长期培养，长期培养时采用的培养基为含2.5ng/ml胰岛素的n2b27培养基。培养时，注意观察类脑周围有无坏死的细胞碎屑，及时将类脑分开培养，避免类脑互相粘连。培养至第30天和第60天时，类脑如图2中b所示。

(5)观察并检测诱导分化得到的类脑

类脑培养至第6周时，取类脑固定做免疫荧光染色。取类脑用4％多聚甲醛室温固定30min，用oct包埋剂包埋后，用冰冻切片机以10μm厚度切片。用pax6抗体标记神经前体细胞，用neun抗体标记成熟的神经元，用荧光显微镜拍照，如图2中c所示，可以看到pax6阳性的细胞形成一个圈状的结构，即相当于发育中的大脑的脑室带(ventricularzone，vz)。neun阳性的细胞处于最外圈，为发育成熟的神经元，相当于发育中的大脑的皮质板结构(corticalplate，cp)，而位于两层之间的是pax6和neun部分阳性的细胞，相当于发育中的大脑的脑室旁带(subventricularzone，svz)。

比较类脑大小：在类脑培养不同阶段，用显微镜拍照，用nis-elementd软件测量类脑直径，并用imagej分析计数类脑的表面积(如图3所示)。图3中，c5和c45为两组tyw1敲除型胚胎干细胞(如图1所示)，c5为-1bp的基因突变体，c45为+1bp的基因突变体。

比较类脑vz区厚度：在类脑培养第6周，取tyw1敲除型和野生型类脑各6个，用4％多聚甲醛室温固定30分钟，然后用oct包埋剂包埋后用冰冻切片机以10μm厚度切片。用pax6抗体标记神经前体细胞，即脑室带，用荧光显微镜拍照，用imagej软件分析类脑的脑室带厚度(如图4所示)。

实施例2

类脑器官在原发性小头畸形药物筛选中的应用。

依据tyw1导致原发性小头畸形的潜在机制，使用药物a干预，观察类脑发育情况。实验设置野生型组，tyw1敲除型组，tyw1敲除型加药物干预组，类脑培养方法与上述实施例1相同。

比较类脑大小：在类脑培养不同阶段，用显微镜拍照，用nis-elementd软件测量类脑直径，并用imagej分析计数类脑的表面积。

比较类脑vz区厚度：在类脑培养第4、6周，取野生型类脑、tyw1敲除型和tyw1敲除型加药物处理类脑各6个，用4％多聚甲醛室温固定30分钟，然后用oct包埋剂包埋后用冰冻切片机以10μm厚度切片。用pax6抗体标记神经前体细胞，即脑室带，用荧光显微镜拍照，用imagej软件分析类脑的脑室带厚度。

验证例

验证twy1基因为原发性小头畸形的患病基因。

1、原发性小头畸形的患者中存在tyw1基因的突变。

请参照附图5，为临床发现的原发性小头畸形患儿家系图谱，对其进行外显子组测序分析，结果参照附图6，得到tyw1突变的基因位点，包括：tyw1c.616c>t，p.arg206cys，以及c.1166g>a，p.arg389gln。

2、动物模型小鼠和斑马鱼大脑组织中tyw1的表达。

采用常规方法验证tyw1在动物模型小鼠和斑马鱼大脑组织中的表达，图7为tyw1在动物模型小鼠和斑马鱼大脑组织中的表达验证结果。其中，图7中a为斑马鱼整体原位杂交实验结果，其表明tyw1主要富集在中枢神经系统；图7中b为小鼠脑组织冰冻切片免疫荧光染色结果，其显示tyw1大部分在神经元表达并且在皮质、海马和小脑均有广泛表达。图8为tyw1基因在斑马鱼敲除后导致中枢神经系统发育异常。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>广州市妇女儿童医疗中心（广州市妇幼保健院、广州市儿童医院、广州市妇婴医院、广州市妇幼保健计划生育服务中心）

<120>一种原发性小头畸形疾病模型及其构建方法和应用

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