一种化学培养体系及其应用的制作方法

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种化学培养体系及其应用。
背景技术：
：神经退行性疾病是目前常见的老龄化疾病，治疗及护理费用极其昂贵，而且市面上无特效药物可以进行有效的治疗。神经退行性疾病包括肌萎缩侧索硬化症(als)、帕金森病(pd)、阿尔茨海默症(ad)等疾病。世界卫生组织统计，2050年我国神经退行性疾病患者将超过3000万，预期医疗费用将超过1万亿。目前主要以药物去补充或刺激脑内不足的左旋多巴、神经核团毁损术或脑深部电刺激手术等治疗方法，但均不能达到很好的疗效，并且会带来“异动症”或是“药效波动”等严重影响生活质量的不良反应。除神经退行性疾病之外，脊髓损伤(spinalcordinjury，sci)是常见的一种神经系统创伤性疾病，据国外统计sci患者一生的治疗康复费用平均达75万美元以上，美国每年对sci患者的花费超过60亿美元。神经退行性疾病和脊髓损伤的治疗难点在于中枢神经系统的神经细胞具有不可再生性，而这类疾病是由于中枢神经的不可逆损伤造成。目前，神经细胞的移植是最为有效的一种治疗方式。神经细胞包括神经干细胞，成熟神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等不同神经细胞类型。目前，神经干细胞的异体移植已经在临床上取得了一定的效果。部分临床试验采取神经系统细胞系移植方法，但现存的神经细胞系资源有限，多为神经系统肿瘤细胞系，且在建系过程中存在eb病毒带来的不稳定因素；而异体神经细胞由于体外传代不易，且异体神经干细胞由于伦理限制以及获得技术不便，这些因素都进一步阻碍了以上疾病的临床推进。近年来，胚胎干细胞及诱导多能干细胞技术(ipsc)的开展取得了很大的进展，利用这类细胞进行定向分化可以获得多种类型的成体细胞(cell，2006，124(4)pp.663-676；cell，2007，131(5)pp.861-872)。因此，使用包括胚胎干细胞及ipsc在内的全能干细胞或者多能干细胞作为原材料进行神经细胞诱导分化可以作为临床治疗的新思路，大大拓展了神经细胞在临床医学上的应用潜力。从多能干细胞到神经干细胞，目前应用最为广泛的诱导方法有两种，第一种为两步法：首先细胞聚合成团形成拟胚体(embryonicbodies)，之后细胞进一步被诱导成为神经元细胞。这种方法的缺点在于细胞分化不同步，且神经元细胞的纯度不高；此外，动物源性的生长因子的使用也制约了神经元细胞在临床上的使用。第二种为smad途径双重抑制法(dualsmadinhibition)(natbiotechnol，2009，05；27(5)：485)，该方法得到的神经干细胞能够分化为其它类型的神经元细胞，其原理是通过抑制bmp和tgfb途径来模拟胚胎发育早期的信号途径，从而诱导神经干细胞的产生。通过这种方法，可以在血清类成分(knockoutserumreplacement)的存在下得到诱导感觉神经元(natbiotechnol，2009，05；27(5)：485)。虽然可应用于移植的细胞种类大大增加，但是目前神经细胞的体外培养大多依赖血清成分的存在，例如胎牛血清和目前广泛使用的代血清b27系列(thermofisher)，gs21(g0800,sigma-aldrich)，这类代血清含有动物源性成分，因此存在一系列安全隐患，它们的存在大大限制了神经细胞移植的的临床应用。因此，不含有血清成分神经系统基础培养基的开发对于神经系统再生医学的发展至关重要。基于现有技术中存在的技术问题，有必要研究一种新型神经系统无血清培养基，不采用目前广泛使用的使用含有动物源性成分的代血清b27及gs21等。通过使用纯化学分子激活信号途径，使用非动物源性的生长因子替换动物源性的生长因子，成分明确，从而拓展神经细胞移植的临床前景。技术实现要素：鉴于此，本发明的目的在于提供一种化学培养体系，用纯化学分子激活信号途径，使用非动物源性的生长因子替换动物源性的生长因子，避免血清及动物源性成分的存在带来的潜在危险。为解决上述问题，本发明提供了一种化学培养体系，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂包括小分子化合物，所述小分子化合物为：哌啶醇氧化物、木犀草素，d(+)-半乳糖，重组人转铁蛋白中的一种或者多种。进一步地，所述小分子化合物为哌啶醇氧化物、木犀草素、d(+)-半乳糖、重组人转铁蛋白中的至少两种。进一步地，所述小分子化合物为哌啶醇氧化物、木犀草素、d(+)-半乳糖、重组人转铁蛋白。进一步地，所述哌啶醇氧化物的用量为10nm-200um；优选50nm、100nm、500nm、1um、5um、10um、20um、50um、100um、150um或200um。进一步地，所述木犀草素的用量为5um-150um；优选5um、10um、50um、75um、100um或150um。进一步地，所述d(+)-半乳糖的用量为5-25ug/ml；优选5.5ug/ml、7.5ug/ml、10ug/ml、12.5ug/ml、15ug/ml、17.5ug/ml、20ug/ml、22.5ug/ml或25ug/ml。进一步地，所述重组人转铁蛋白的用量为50-200ng/ml；优选55ng/ml、75ng/ml、100ng/ml、125ng/ml、150ng/ml、175ng/ml或200ng/ml。进一步地，所述基础培养基为dmem培养基或者dmem/f12培养基，所述基础培养基包含最低必须培养基非必需氨基酸。进一步地，本发明提供的化学培养体系中所述添加剂还包括生长因子及无机盐。进一步地，所述生长因子包括维生素、黄体酮、腐胺及胰岛素；所述无机盐包括氯化钠、砷酸钠。进一步地，所述维生素包括1ug/ml维生素e，1.2um维生素b12，64mg/l维生素c；所述黄体酮为6.3ng/ml，所述腐胺为23ug/ml，所述胰岛素为22ug/ml；所述氯化钠为0.5g/l，所述砷酸钠为13.6ug/l。本发明的另一个目的在于，提供所述化学培养体系在原代神经细胞培养和神经细胞系培养中的应用。本发明的另一个目的在于，提供所述化学培养体系在多能干细胞向神经干细胞诱导中的应用。本发明的另一个目的在于，提供所述化学培养体系在诱导干细胞神经定向分化及分化细胞培养中的应用。进一步地，所述应用包括星状胶质细胞分化、drg神经元分化培养或皮质神经元分化培养；进一步地，所述drg神经元分化及培养过程加入细胞因子；所述皮质神经元分化培养过程中加入化学小分子抑制剂。本发明的还有一个目的在于，提供所述化学培养体系在类脑器官诱导中的应用。与现有技术相比，本发明的有益效果为：1.本发明使用一种或多种新的化学小分子，结合基础培养基以及无机盐及生长因子的组合，能够支持多种神经元的体外诱导，从而建立了无血清无动物源性物质的感觉神经元细胞诱导培养体系，并且可以表现出更佳的诱导培养效果。2.通过本培养基得到的神经干细胞，具有各项完备的生物学功能，多个批次之间状态稳定，纯度高，解决了细胞类药物生产过程中纯度低，周期长的问题。3.本发明还解决了长久以来动物源性培养方法和滋养细胞污染的问题，能够用于神经系统疾病药物的体外筛选，因此具有巨大的经济效应和社会效应。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为原代细胞及人源神经干细胞系rencellvm在nouvneu中培养的cyquant曲线。图2为使用人源神经细胞系rencellvm在nouvneu中进行核心组分筛选结果示意图。图3为使用nouvneu体系进行神经干细胞定向诱导后获得的神经花环结构及标志物转录分析图。图4为使用nouvneu体系进行神经元及胶质细胞诱导后，使用免疫荧光鉴定感觉神经元特异性分子标记表达情况示意图。图5为使用nouvneu体系下drg神经细胞电生理活性情况示意图。图6为使用nouvneu体系诱导皮质神经元细胞定向分化过程中细胞活性示意图。图7为使用nouvneu体系进行类脑器官诱导，及类脑器官标志物和电生理活性分析示意图。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明的方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。在本发明的具体实施方案中，无血清培养基表示不含有直接从血液中分离的血清。血清为血浆的透明液体部分，其不含纤维蛋白原或血细胞，并且在血液凝固后保持为液体。无血清培养基可以含有血清替代物，血清替代物的实例包括血清白蛋白，转铁蛋白，脂肪酸等纯化物质，这些物质为本领域熟知的可以替代血清的物质。在本发明的具体实施方案中，提供了一种用于多种细胞诱导的培养基，包括基础培养基和添加剂；所述添加剂包括小分子化合物，还包括常见的无机盐以及生长因子；在本发明的具体实施方案中，小分子化合物为哌啶醇氧化物、木犀草素、d(+)-半乳糖、重组人转铁蛋白中的一种或多种；优选两种，更优选为四种。在本发明的具体实施方案中，所述基础培养基为dmem培养基，加入最低必须培养基非必需氨基酸，也可以选择包含最低必须培养基非必需氨基酸的其他培养基。在本发明的具体实施方案中，所述生长因子包括维生素、黄体酮、腐胺及胰岛素；也可以选择常用的其他生长因子替代或新增。在本发明的具体实施方案中，所述无机盐包括氯化钠、砷酸钠；也可以选择常用的其他无机盐替代或新增。实施例1.培养基配方nouvneu培养基的配方，以下简称nouvneu：杜氏改良伊格尔培养基(dmem培养基，也可以选择无血清的dmem-f12)，最低必须培养基非必需氨基酸(minimumessentialmediumnon-essentialaminoacids，货号：11140076，thermofisher)，哌啶醇氧化物(4-hydroxy-tempo，10nm-200um，最佳浓度为50um)，d(+)-半乳糖(d(+)-galactose，5-25ug/ml，最佳浓度为12.5ug/ml)，维生素e(1ug/ml)，维生素b12(1.2um)，维生素c(l-ascorbicacid，64mg/l)，黄体酮(progesterone，6.3ng/ml)，腐胺(putrescine，23ug/ml)，木犀草素(luteolin,5um-150um，最佳浓度为60um)，氯化钠(sodiumchloride，0.5g/l)，砷酸钠(13.6ug/l)，胰岛素(22ug/ml)，重组人转铁蛋白(50-100ng/ml，最佳浓度为100ng/ml)。同时，在其他成分不变的条件下，按照表1标准配置成分比较nouvneu培养基:。表1：nouvneu成分分析培养基成分表tempoluteolind(+)-半乳糖重组人转铁蛋白nouvneu-tl50um60um--nouvneu-tg50um-12.5ug/ml-nouvneu-lt-60um-100ng/mlnouvneu-tet50um--100ng/mlnouvneu-gt--12.5ug/ml100ng/mlnouvneu-lg-60um12.5ug/ml-nouvneu-tlg50um60um12.5ug/ml-nouvneu-tlt50um60um-100ng/mlnouvneu-tgt50um-12.5ug/ml100ng/mlnouvneu-lgt-60um12.5ug/ml100ng/ml对照培养基i为n2b27培养基，以下简称n2b27，其配方为：50％杜氏改良伊格尔f12培养基(dmem-f12)，50％神经基础培养基(neurobasal)，0.1％n2添加剂(n2supplement)，2％b27添加剂(b27supplement)。对照培养基ii为含有10％fbs的杜氏改良伊格尔培养基(dmem培养基)，以下简称fbs。实施例2.原代神经细胞和神经细胞系的培养以及化合物浓度筛选使用50ug/ml多聚赖氨酸(sigma，p6407)包被6孔培养板，铺板后置于37℃恒温箱中孵育3小时以上；然后使用5ug/ml层粘连蛋白(laminin，i2020，sigmaaldrich)进一步包被，铺板后置于37℃恒温箱中孵育3小时以上。将小鼠原代细胞及人神经细胞系rencellvm进行培养，其中小鼠原代细胞分离按照natureprotocols.volume7，pages1741-1754(2012)所述方法进行。细胞培养条件为37℃，5％二氧化碳(panasonic，mco-18ac)，细胞贴壁培养。分别使用本发明培养基、neuralbasal+10％fbs及n2b27培养基进行比较。细胞传代用0.05％胰酶/edta在37℃消化5分钟，使用dmem+10％fbs终止细胞消化。细胞洗涤离心后按照2×105每瓶的比例重新接种于t25培养板中。待细胞传代2后进行cyquant实验。本实施例中第1步到第3步中所述贴壁培养，优选是在有基底膜的情况下进行的。本发明所述基底膜，可以在培养器皿的表面形成一层由胞外基质分子构成的薄膜，可以为细胞的形态，生长分化，以及运动等参数提供与体内环境类似的支持。在具体的实施方案中，所述基底膜为基底胶(matrigel)(stemcelltechnologies)，层粘蛋白(laminin)和玻连蛋白的一种或多种的组合。使用cyquant试验来进行细胞活力定量检测，从而比较不同培养基成分在细胞长期培养过程中对细胞生理状态的影响。包被96孔不透光细胞培养板，包被完成后将细胞按照5×104每孔的细胞数量分别接种，并设置三组平行重复(三组的平均值作为数据进行计算)。培养条件为37℃，5％二氧化碳，每隔2天半换液一次，使用已知方法中的培养基作为对照组。分别在1天，5天，15天及30天取样，细胞活力检测使用cyquantkit(invitrogen，x12223)进行，按照使用说明书操作，使用spectramaxi3multi-modemicroplatereader(vwr，型号id3-std)进行数据读取。结果如图1所示，结果表明，cyquant实验显示，与fbs对照及n2b27对照相比，小鼠原代细胞(图1a)和人源神经干细胞系(图1b)均在nouvneu体系中表现出更好的细胞活力。cyquant单产物实验中所筛选的化合物分别为哌啶醇氧化物，d(+)-半乳糖，木犀草素和重组人转铁蛋白。进行浓度筛选时，仅培养基配方中哌啶醇氧化物，d(+)-半乳糖，重组人转铁蛋白和木犀草素分别变化浓度，其余成分浓度不变。筛选结果如图2a-2d所示，图2a显示木犀草素的使用范围为5um-150um；不难得出可以优选1um、10um、50um、75um、100um和150um中的一种。图2b显示d(+)-半乳糖的使用范围为5-25ug/ml；不难里看出5.5ug/ml、7.5ug/ml、10ug/ml、12.5ug/ml、15ug/ml、17.5ug/ml、20ug/ml、22.5ug/ml和25ug/ml都可以作为较佳的用量选择。图2c显示哌啶醇氧化物的使用范围为10nm-200um；不难看出50nm、100nm、500nm、1um、5um、10um、20um、50um、100um、150um或200um都可以作为较佳的用量选择。图2d显示重组人转铁蛋白使用范围为50-200ng/ml；不难看出55ng/ml、75ng/ml、100ng/ml、125ng/ml、150ng/ml、175ng/ml或200ng/ml都可以作为较佳的用量选择。cyquant筛选单产物组合，培养基使用按照表1中nouvneu成分分析培养基，筛选结果如2e所示。结果表明，对nouvneu中木犀草素，d(+)-半乳糖，哌啶醇氧化物和人重组转铁蛋白进行组合，结果显示含有四种成分的nouvneu在所有组合中具有最好的细胞增殖活性。从以上筛选结果来看(图2a-2e)，nouvneu中各单独组分浓度的增加对于细胞增殖均能起到作用，因此可以判断得出，组合物中含有木犀草素，d(+)-半乳糖，哌啶醇氧化物和人重组转铁蛋白中的一种、多种均可以实现细胞的增殖。表2：四种nouvneu成分组合进行原代细胞培养的cyquant计数(图2e)实施例3.神经干细胞的诱导培养人多能干细胞包括胚性多能干细胞，如h9细胞系和人诱导多能干细胞。其中人诱导多能干细胞按照“重编程培养基及重编程诱导多能干细胞的培养方法”(专利公开号cn109628383a)进行从cd34+细胞重编程获得。人多能干细胞使用matrigel(stemcelltechnologies)包被t25细胞培养瓶，铺板后置于37℃恒温箱中孵育一个小时以上。按照1×106细胞接种于t25培养瓶中进行扩增和传代。进行神经诱导时，使用50ug/ml多聚赖氨酸(sigma，p6407)包被6孔培养板，铺板后置于37℃恒温箱中孵育3小时以上；然后使用5ug/ml层粘连蛋白(laminin，i2020,sigmaaldrich)进一步包被，铺板后置于37℃恒温箱中孵育3小时以上。当多能干细胞达到70％的覆盖率时，用edta在37℃消化5分钟，使用dmem终止细胞消化。细胞洗涤离心后按照2×105每瓶的比例重新接种于t25培养板中。使用本发明培养基及神经诱导化合物组合进行神经诱导，其中神经诱导化合物为100nmldn-193189hcl(selleck，货号：s7507)及10umsb431542(selleck，货号：s1067)，培养条件为37℃，5％的co2(panasonic，mco-18ac)，每天更换培养基直至神经干细胞花环结构形成。神经干细胞用edta在37℃消化5分钟，使用dmem终止细胞消化。细胞洗涤离心后按照2×105每瓶的比例重新接种于50ug/ml多聚赖氨酸及5ug/ml层粘连蛋白包被的t25培养板中，进行扩增培养。培养条件为37℃，5％的co2(panasonic，mco-18ac)。分别取n2b27系统和nouvneu系统诱导完成后传代的神经干细胞进行免疫荧光染色鉴定：采用4％多聚甲醛室温固定细胞40分钟，用dpbs缓冲液清洗两遍；然后用0.1％tritonx-100透化处理5分钟，用dpbs缓冲液清洗两遍；然后用含10％马血清和0.1％tritonx-100的dpbs缓冲液将细胞4℃孵育过夜；然后加入用dpbs缓冲液稀释的抗体，37℃孵育2小时，用dpbs缓冲液清洗三遍后拍照，拍照使用leicadmi8进行。抗体使用细节如表3所示。表3：细胞免疫荧光染色所用抗体使用q-pcr检测从多能干细胞向神经干细胞诱导过程中的不同标志物基因的转录变化。实施例3中的使用的诱导多能干细胞，使用nouvneu和n2b27体系得到的诱导神经干细胞，以及使用nouvneu成分分析培养基传代3代之后的细胞，分别使用rneasyminiormicrokit(qiagen)进行总rna抽提，1mgrna用superscriptiiifirst-strandsynthesissystem(invitrogen)合成cdna。用sybrpremixextaq(takara)和thermalcyclerdicerealtimesystem(takara)来进行quan-titativepcr的标记和反应，beta-actin用来作为内参。所有数据用delta-ctmethod进行分析。每组试验使用三组重复进行试验，并进行方差统计。用于鉴定不同细胞标志物的编码基因的引物序列如表4所示。表4：多能干细胞向神经干细胞诱导过程中的不同标志物基因引物标志物引物序列sox2-fcatgcaggttgacaccgttggsox2-ratggattctcggcagactgattcapax6-ftctttgcttgggaaatccgpax6-rctgcccgttcaacatccttagcasp3-fggaagcgaatcaatggactctggcasp3-rgcatcgacatctgtaccagaccnestin-ftcaagatgtccctcagcctgganestin-rtggcacaggtgtctcaagggtagactin-ftccctggagaagagctacgaactin-ragcactgtgttggcgtacag图3为使用nouvneu与对照组进行神经干细胞诱导结果图。与对照n2b27体系(图3a，图3c)相比，nouvneu在单层诱导阶段(图3b)能够形成均匀平铺的神经花环(rossette)聚集，细胞传代后也能进一步形成神经花环结构(图3d)；nouvneu(图3f)和n2b27(图3e)对照形成的神经花环结构在花环中心部位表达结构蛋白zo1和核转录因子sox2；q-pcr分析神经干细胞rna表达，nouvneu诱导得到的神经干细胞能够表达pax6(图3g)，sox2(图3i)和nestin(图3j)。对nouvneu中木犀草素，d(+)-半乳糖，哌啶醇氧化物和人重组转铁蛋白进行组合，结果显示所有组合在神经干细胞诱导过程中均能诱导表达神经干细胞特异性标志物pax6。在维持诱导神经干细胞生长过程中，培养基中包含木犀草素，d(+)-半乳糖，哌啶醇氧化物和人重组转铁蛋白中的一种或多种组合均能支持神经干细胞的传代和生长，但在超长期培养和传代情况下，会引起caspase3表达(图3k)，结果显示，含有四种化合物的nouvneu能够在较低caspase3表达水平维持神经干细胞传代和生长。实施例4神经干细胞的诱导分化和培养将实施例3中nouvneu系统获得的神经干细胞在nouvneu培养基中进行定向分化。4.1星状胶质细胞分化人诱导星状胶质细胞使用实施例3中获得的神经干细胞，在nouvneu基础培养基中加入10ng/mlpdgfaa(r&dsystems),20ng/mlfibroblastgrowthfactor2(禾元生物)，20ng/ml表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，peprotech)，humanlif(10ng/ml,alomonelabs)，10％胎牛血清(洁特生物)，每隔3天更换新鲜培养基，直至第21天。培养条件为37℃，5％的co2(panasonic，mco-18ac)。对照实验采取n2b27基础培养基进行。图4a-4b表示使用n2b27对照诱导得到的星状胶质细胞，形态呈扁平星状，表达星状胶质细胞标志物gfap；图4c-4d表示使用nouvneu诱导得到的星状胶质细胞，与n2b27对照相比具有同样的细胞形态及标志物表达。实验结果表明nouvneu和n2b27体系均能分化得到星状胶质细胞，得到的星状胶质细胞具有典型形态且表达星状胶质细胞标志物map2(图4a-4d)。4.2drg神经元分化人诱导drg神经元使用将实施例3中获得的神经干细胞，在nouvneu基础培养基中加入3umchir99021(selleck，货号：s2924),10umsu5402(tocris，货号：3300/1)，10umdapt(selleck，货号：s2215)，每隔3天更换新鲜培养基，直至第21天。培养条件为37℃，5％的co2(panasonic，mco-18ac)。对照实验(以下图文简称ck)根据已发表的方法(natbiotechnol.，2013，30(7):715–720)进行，具体操作如下：820ml敲除型杜氏改良伊格尔培养基(knockoutdmem培养基，货号：10829018，thermofisher)，150ml敲除型血清替代物(knockoutserumreplacement，货号：10828028，thermofisher)，1mml型谷氨酰胺(l-glutamine，货号：25030081，thermofisher)，100um最低必须培养基非必需氨基酸(minimumessentialmediumnon-essentialaminoacids，货号：11140076，thermofisher)和0.1mmβ-巯基乙醇(β-mercaptoethanol，货号：21985023，thermofisher)配置基础培养基，在第0天至第5天向基础培养基中添加100nmldn-193189和10umsb431542。添加1％(v/v)n2添加剂(n2supplement，货号：17502045，thermofisher)至神经基础培养基(neurobasal培养基，货号：21103049，thermofisher)中形成n2培养基(以下简称n2体系)。从第4天开始每隔一天以25％的增量添加n2培养基(第10天100％n2)。在第10天加入三种抑制剂3umchir99021(selleck，货号：s2924)，10umsu5402(tocris，货号：3300/1)，10umdapt(selleck，货号：s2215)，每隔3天更换新鲜培养基，直至第31天。培养条件为37℃，5％的co2(panasonic，mco-18ac)。图4e-4f表示使用n2b27诱导得到的drg神经元，表达drg神经元特异标志物钠离子通道1.8和神经细胞标志物tuj；图4g-4h表示使用nouvneu诱导得到的drg神经元，与n2b27对照相比具有同样的细胞形态及标志物表达。实验结果表明nouvneu和n2体系均能分化得到drg神经元，得到的drg神经元具有轴突结构且表达drg神经元标志物kca2.2和神经细胞标志物nestin(图4e-4h)。使用多通道电极对诱导的drg神经元细胞进行细胞自发放电信号检测，细胞分别使用nouvneu成分分析系列培养基，nouvneu培养基，以及n2b27对照培养基进行按照drg神经元分化方法进行培养。取96孔mea系统多通道电极板(axionbiosystem，us)，使用100ng/ml多聚赖氨酸(poly-l-lysine，sigma-aldrich，p4707)进行包被，置于37℃，5％二氧化碳细胞培养箱(panasonic，mco-18ac)中包被12小时；取出多聚赖氨酸包被好的mea多通道电极板，吸走多聚赖氨酸，用灭菌水清洗3次后，使用含有3ug/ml明胶(laminin，i2020,sigmaaldrich)的pbs溶液作为神经细胞包被基质，加入mea多通道电极板中，置于37℃，5％二氧化碳细胞培养箱中包被3小时(panasonic，mco-18ac)。mea多通道电极板包被好后，按照5×105个细胞每孔的数量接种诱导神经元细胞细胞。将接种好的mea多通道电极板放置于mea腔室中，在axisnavigator2.0.2软件中调节，细胞培养条件为37℃，5％二氧化碳，运行10分钟至腔室环境稳定。用axisnavigator2.0.2软件(axionbiosystem，us)记录细胞自发放电信号。实验结果表明nouneu体系诱导的drg神经元展现出良好的电生理活性。图5a-5k显示nouneu体系及n2b27对照诱导的drg神经元在mea电极板中生长形态，进一步使用mea电极板在多通道电极系统检测细胞自发放电时，通过比较细胞单位时间放电数(图5i)和平均放电率(图5m)，nouvneu体系均比n2b27对照活跃。图5n-5o显示，对nouvneu中木犀草素，d(+)-半乳糖，哌啶醇氧化物和人重组转铁蛋白进行组合，结果显示含有四种成分的nouvneu在所以组合中具有最好的细胞电生理活性。4.3皮质神经元分化进行皮质神经元分化时，使用50ug/ml多聚赖氨酸(sigma，p6407)包被6孔培养板，铺板后置于37℃恒温箱中孵育3小时以上；然后使用3ug/ml层粘连蛋白(laminin，i2020,sigmaaldrich)进一步包被，铺板后置于37℃恒温箱中孵育3小时以上。实施例3中得到的诱导神经干按照1×105每瓶的比例重新接种于t25培养板中。使用nouvneu培养基培养神经干细胞，培养条件为37℃，5％的co2(panasonic，mco-18ac)，每三天更换新鲜培养基直至第30天神经元形成。对照实验使用n2b27培养基进行神经元诱导，具体操作步骤同上。图4i-4j表示使用n2b27诱导得到的皮质神经元，表达皮质神经元特异标志物map2和neun；图4k-4l表示使用nouvneu诱导得到的皮质神经元，与n2b27对照相比具有同样的细胞形态及标志物表达。实验结果表明nouvneu和n2b27体系均能分化得到皮质神经元，得到的皮质神经元具有轴突结构且表达皮质神经元标志物neun和map2(图4i-4l)。取诱导完成后的，分别取每组对照两种材料进行免疫荧光染色鉴定：采用4％多聚甲醛室温固定细胞40分钟，用dpbs缓冲液清洗两遍；然后用0.1％tritonx-100透化处理5分钟，用dpbs缓冲液清洗两遍；然后用含10％马血清和0.1％tritonx-100的dpbs缓冲液将细胞4℃孵育过夜；然后加入用dpbs缓冲液稀释的抗体，37℃孵育2小时，用dpbs缓冲液清洗三遍后拍照。抗体使用细节如表5所示。表5：定向分化免疫荧光染色所用抗体使用cyquant试验来进行细胞活力定量检测，从而比较不同培养基成分在细胞长期培养过程中对细胞生理状态的影响。包被96孔不透光细胞培养板，包被完成后将细胞按照5×104每孔的细胞数量分别接种，并设置三组平行重复(三组的平均值作为数据进行计算)。培养条件为37℃，5％二氧化碳，每隔2天半换液一次，使用已知方法中的培养基作为对照组。分别在1天，10天，15天及35天取样，细胞活力检测使用cyquantkit(invitrogen，x12223)进行，按照使用说明书操作，使用spectramaxi3multi-modemicroplatereader(vwr，型号id3-std)进行数据读取。结果如图6所示，图6a-6k显示同一细胞起始浓度下，nouneu体系及n2b27对照诱导的皮质神经元的生长形态，cyquant实验显示，nouvneu能够更好维持诱导皮质神经元细胞定向分化过程中细胞活性。图6l显示哌啶醇氧化物的使用范围为10nm-200um，图6m显示木犀草素的使用范围为5um-150um；图6n显示d(+)-半乳糖的使用范围为5-25ug/ml；图6o显示重组人转铁蛋白的使用范围为50ng/ml-200ng/ml；图6p(数据如表6所示)显示，对nouvneu中木犀草素，d(+)-半乳糖，哌啶醇氧化物和人重组转铁蛋白进行组合，结果表明含有四种成分的nouvneu在所以组合中具有最好的细胞增殖活性。表6：四种成分组合在皮质神经元诱导中的cyquant计数实施例53d类器官的诱导培养类脑器官培养采取人诱导多能干细胞进行，类脑器官诱导培养基配方如下：nouvneu基础培养基中添加10μmsb-431542，100nmldn-193189，还可以选择其他类似效果的抑制剂。诱导多能干细胞使用accutase消化为单细胞，按照每孔中9000个细胞/150ml类脑诱导培养基的比例接种于u-bottom-ultra-lowattachment96孔板中。并加入50μmrockinhibitory27632以及5％(v/v)heat-inactivatedfbs(lifetechnologies)，置于37℃，5％二氧化碳细胞培养箱中培养小时(panasonic，mco-18ac)。次日更换新鲜类脑器官诱导培养基直至第10天。第10天将类脑器官转移至ultra-low-attachmen6孔板里，更换培养基为nouvneu培养基，在37℃，5％二氧化碳细胞培养箱中的水平旋转仪上按照80rpm旋转培养至第30天。对照实验根据已发表的方法(natmethods.2019nov；16(11):1169-1175)进行，类器官培养基础培养基使用n2b27，对照类脑诱导培养基配方为：n2b27基础培养基中添加10umsb-431542,100nmldn-193189,2umxav-939。其余操作同上。使用多通道电极对诱导的类脑器官进行细胞自发放电信号检测。将诱导30天的类脑器官用10％胰酶/edta在37摄氏度消化5-8分钟，取96孔mea系统多通道电极板(axionbiosystem，us)，使用100ng/ml多聚赖氨酸(poly-l-lysine，sigma-aldrich，p4707)进行包被，置于37℃，5％二氧化碳细胞培养箱(panasonic，mco-18ac)中包被12小时；取出多聚赖氨酸包被好的mea多通道电极板，吸走多聚赖氨酸，用灭菌水清洗3次后，使用含有3ug/ml明胶(laminin，i2020,sigmaaldrich)的pbs溶液作为神经细胞包被基质，加入mea多通道电极板中，置于37℃，5％二氧化碳细胞培养箱中包被3小时(panasonic，mco-18ac)。mea多通道电极板包被好后，按照5×105个细胞每孔的数量接种消化过的类脑器官混合细胞。将接种好的mea多通道电极板放置于mea腔室中，在axisnavigator2.0.2软件中调节，细胞培养条件为37℃，5％二氧化碳，运行10分钟至腔室环境稳定。用axisnavigator2.0.2软件(axionbiosystem，us)记录细胞自发放电信号。使用q-pcr检测类脑器官形成后的不同标志物基因的转录变化：不同方法培养获得的18天类脑器官，以及人诱导多能干细胞对照的总rna分别使用rneasyminiormicrokit(qiagen)进行抽提，1mgrna用superscriptiiifirst-strandsynthesissystem(invitrogen)合成cdna。用sybrpremixextaq(takara)和thermalcyclerdicerealtimesystem(takara)来进行quan-titativepcr的标记和反应，beta-actin用来作为内参。所有数据用delta-ctmethod进行分析。每组试验使用三组重复进行试验，并进行方差统计。用于鉴定不同细胞标志物的编码基因的引物序列如表7所示。结果表明，对nouvneu中木犀草素，d(+)-半乳糖，哌啶醇氧化物和人重组转铁蛋白进行组合，结果表明含有四种成分的nouvneu在所以组合中具有最好的细胞增殖活性(图7c)；nouvneu体系和n2b27体系形成的类脑器官均能产生胶质细胞，神经祖细胞和神经元(图7d-7e)。表7.外周神经元及多能干细胞标志物q-pcr所用引物：en1-fggacaatgacgttgaaacgcagcaen1-raaggtcgtaagcggtttggctagasox2-fcatgcaggttgacaccgttggsox2-ratggattctcggcagactgattcagfap-fctggagaggaagattgagtcgcgfap-racgtcaagctccacatggacctcasp3-fggaagcgaatcaatggactctggcasp3-rgcatcgacatctgtaccagaccactin-ftccctggagaagagctacgaactin-ragcactgtgttggcgtacag图7显示：培养30天时，nouvneu(7b)与n2b27对照(7a)均能产生类脑器官；使用多通道电级系统检测细胞自发放电时，通过比较细胞单位时间放电数(图7c)和平均放电率(图7d)，nouvneu体系均比n2b27对照活跃。q-pcr分析类脑器官细胞rna表达，对nouvneu中木犀草素，d(+)-半乳糖，哌啶醇氧化物和人重组转铁蛋白进行组合，结果表明含有四种成分的nouvneu在所以组合中具有最好的细胞增殖活性，而部分组合导致大量细胞凋亡(图7e)。nouvneu诱导得到的类脑器官和n2b27对照相比，均能够表达en1(图7f)，sox2(图7g)和nestin(图7h)。以上结果说明，nouvneu能够维持类脑器官的生长及类脑器官的电生理活性。本发明以上实施例中使用的一种或多种新的化学小分子，结合基础培养基以及无机盐及生长因子的组合，能够支持多种神经元的体外诱导，从而建立了无血清无动物源性物质的感觉神经元细胞诱导培养体系，并且相对现有含动物血清培养基有更好的诱导剂培养效果。通过本发明培养体系得到的神经干细胞，具有各项完备的生物学功能，重复多次试验状态稳定，而且对比现有技术中的培养基具备可缩短周期，有很大的应用前景。本发明不采用含有动物源性成分的代血清b27及gs21，使用纯化学分子激活信号途径，使用非动物源性的生长因子替换动物源性的生长因子，成分明确。解决了长久以来动物源性培养方法和滋养细胞污染的问题，能够用于神经系统疾病药物的体外筛选，因此具有巨大的经济效应和社会效应。本发明并不仅仅限于说明书和实施方式中所描述，因此对于熟悉领域的人员而言可容易地实现另外的优点和改进，故在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念的精神和范围的情况下，本发明并不限于特定的细节、代表性的方案和这里示出与描述的图示示例。当前第1页1 2 3 

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