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您当前的位置： 一种提高稳转细胞株细胞池形成率的方法与流程
2021-02-02 18:02:34|
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起点商标网 本发明属于细胞培养
技术领域：
，具体涉及一种提高稳转细胞株细胞池形成率的方法。
背景技术：
：随着生物技术的发展，抗体、疫苗的表达和生产在生物制药中占据着重要地位，细胞株筛选可获得稳定高产的细胞株，稳转细胞株的构建是表达抗体疫苗的重要手段之一。目前细胞株筛选流程主要为：构建表达质粒，宿主细胞转染，细胞池加压筛选，单克隆筛选，获得高表达细胞株。merck的cho-k1表达系统，在细胞筛选时时添加谷氨酸合成酶(glutaminesythetase，gs)抑制剂氨基亚砜蛋氨酸(methioninesulfoximine，msx)，使gs基因及与之相连的目的基因一起扩增，达到提高目的基因表达水平的目的。从而大大提高了转染的效率和阳性克隆的筛选率。评估高表达细胞株的主要指标有蛋白表达量、蛋白质质量、细胞稳定性，这些指标与筛选出的细胞池密切相关。常规细胞池筛选方法为宿主细胞转入质粒后，进行多轮加压筛选，经过漫长的加压筛选后以获得高表达细胞池。目前cho-k1存在着细胞池筛选生长缓慢，克隆形成率低，阳性率低等问题，这严重的影响了稳转细胞株筛选的进程。因此如何利用工艺提高稳转细胞株细胞池的克隆率，缩短筛选时间，提高筛选通量，是亟需解决的问题。中国专利201910831248.5中公开了一种ndufs3基因敲低和/或过表达的稳转株及其构建方法，其中通过将目的基因导入细胞株，采用8-10μg/ml嘌呤霉素对转染后的细胞株进行至少一次筛选，得到ndufs3基因敲低和/或过表达的稳转株。该方法方法操作简单、用时短、转染率高，但更适用于ndufs3基因敲低和/或过表达的a875细胞、a375细胞和/或sk-mel-110细胞。中国专利201610173410.5公开了一种gs表达系统细胞株的高通量筛选方法，其中包括在25-100μm氨基亚砜蛋氨酸加压后，选择细胞活力在25％-35％的细胞池进行单克隆化筛选。其中gs表达系统为携带gs基因的并且gs基因下游插入了外源基因的表达载体转染至ns0细胞或者敲除了gs基因的cho细胞。但该筛选步骤中选用的是半固体培养基，与细胞悬液混匀时操作不便，有待进一步改进。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明提供了一种提高稳转细胞株细胞池形成率的方法。首先，本申请优化了培养稳转细胞的培养基，由传统培养基优化为混合三维培养基；其次，本申请优化了包括细胞接种密度及msx加压浓度在内的培养条件。根据本申请提供的方法，可以显著提高稳转细胞株细胞池的形成率。一方面，本发明提供了一种用于稳转细胞株培养中细胞池加压筛选的混合三维培养基。所述的培养基由三种基础培养基cdfusion，chocloningmedium，growtha组成。所述的培养基为l1-l10中的一种，l1-l10中各基础培养基的组成比例如表1所示。表1.改良培养基组成成分表cdfusionchocloningmediumgrowthal1100l20.500.5l30.750.250l40.50.50l50.50.250.25l60.7500.25l70.670.1650.165l80.80.10.1l90.60.30.1l100.60.10.3在一些实施例中，所述的cdchofusion为ex-cell®cdchofusion，购自sigma，货号为24365c；所述的chocloningmedium为excellchocloningmedium，购自sigma，货号为c6366；所述的growtha为balancdchogrowtha，购自irvine，货号为91128。优选地，所述的培养基为l3。优选地，所述的稳转细胞株为cho-k1。另一方面，本发明提供了一种提高稳转细胞株细胞池加压筛选时细胞池形成率的方法。所述的稳转细胞株在细胞池加压筛选时采用前述混合三维培养基进行培养。所述的培养过程中，培养基筛选压力（msx）为10-50μm。所述的培养过程中，铺板细胞密度为5000-20000个/孔。所述的培养过程中对混合培养基、铺板细胞密度、培养基筛选压力进行doe设计如表2所示。表2.混合培养基/铺板细胞密度/培养基筛选压力doe分组表格cells（个/孔）msx（um）basal12000010l12500025l131000050l141000010l105500025l1062000050l107500010l281000025l292000050l2101000010l3112000025l312500050l313500010l4141000025l4152000050l416500010l5171000025l5182000050l5191000010l6202000025l621500050l622500010l7232000025l7241000050l7252000010l8261000025l827500050l8282000010l929500025l9301000050l9优选地，所述的稳转细胞株细胞池加压筛选时的培育条件为l3培养基，msx压力为25μm，该条件下的铺板细胞密度为20000个/孔。优选地，所述的稳转细胞株细胞池加压筛选时的培育条件为l3培养基，msx压力为10μm，该条件下的铺板细胞密度为10000个/孔。优选地，所述的稳转细胞株细胞池加压筛选时的培育条件为l8培养基，msx压力为10μm，该条件下的铺板细胞密度为20000个/孔。优选地，所述的稳转细胞株细胞池加压筛选时的培育条件为l9培养基，msx压力为10μm，该条件下的铺板细胞密度为20000个/孔。优选地，所述的稳转细胞株为cho-k1。再一方面，本发明提供了一种稳转细胞株的培养方法。所述的培养方法包括以下步骤：1)细胞准备：电转前一天，将宿主细胞取样计数后接种于摇瓶中；2)电染当天：i、取步骤1中处于对数生长期的宿主细胞计数后，计算每个电转反应所需细胞体积。将细胞悬液以800rpm，4℃离心5min。弃上清，用cdfusion培养基重悬细胞，加入待转染质粒，吹打混匀，电转体积共800μl，将混合物加入电转杯中并冰浴1min；ii、将cdfusion培养基加入10cm平皿中，放入培养箱预热；iii、用bio-rad电转仪进行电转；iv、电击结束后，将电转后细胞转移至预热的培养基中，置于37℃，5%co2培养箱中静置培养；3)电染48h后：将转染后细胞计数，根据表2所示，每组按对应的细胞密度，对应的培养基将细胞离心重悬后接种于96孔板中，每组接种4块96孔板，培养体积为200μl；4）培养18天后统计每个培养条件下细胞池的形成率，以汇合度为20%为阳性克隆孔，计算每个条件阳性克隆孔个数。所述的步骤2）的第iii步中，设置点击参数如下：voltagetimepulse：300v；capacitance：950μf，4mm进行电击。优选地，所述的稳转细胞株为cho-k1。本发明的有益效果：1、在稳转细胞培养过程中，单独使用任意单种类基础培养基，在细胞池加压筛选时克隆形成率低，细胞恢复缓慢。本发明利用混料设计，将几种基础培养基按不同比例进行三维混合，能够显著提高细胞池克隆率。2、cho-k1gs（merck）表达系统通过msx加压筛选，使用用三维混合改良培养基相比基础优化细胞密度使96孔板中细胞池克隆形成率提升至20.8%，筛选周期显著降低。具体实施方式下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1一种稳转细胞株的培养方法本实施例中：ex-cell®cdchofusion购自sigma，货号为24365c；excellchocloningmedium购自sigma，货号为c6366；balancdchogrowtha购自irvine，货号为91128。待转染质粒的空载体为pcgs3，来自merck；待转染质粒表达fc融合蛋白。（1）细胞准备电转前一天，将宿主细胞chozn®chok1cells（购自safc）取样计数后，以0.8×106cells/ml细胞密度接种于摇瓶中。（2）电染i、取步骤（1）中处于对数生长期的宿主细胞计数后，以1×107cells/transfection计算每个电转反应所需细胞体积。将细胞悬液以800rpm，4℃离心5min；弃上清，用cdfusion培养基重悬细胞，加入待转染质粒60μg，吹打混匀，电转体积共800μl，将混合物加入电转杯中并冰浴1min；ii、将10mlcdfusion培养基加入10cm平皿中，放入培养箱预热；iii、用bio-rad电转仪进行电转，设置点击参数如下：voltagetimepulse：300v；capacitance:950μf，4mm进行电击；iv、电击结束后，将电转后细胞转移至预热的培养基中，置于37℃，5%co2培养箱中静置培养。（3）电染48h后将转染后细胞计数，根据表2所示每组按对应的细胞密度和培养基将细胞离心重悬后接种于96孔板中，每组接种4块96孔板，培养体积为200μl；培养18天后统计每个培养条件下细胞池的形成率，以汇合度为20%为阳性克隆孔，计算每个条件阳性克隆孔个数。结果如下表3所示：表3.96孔板中混料培养基/铺板细胞密度/培养基筛选压力对细胞池克隆形成的影响runcellsmsxbasal板号pool数量克隆率%备注12000010l111313.512000010l121515.612000010l1366.312000010l141111.52500025l1100.02500025l1200.02500025l1300.02500025l1400.031000050l1100.031000050l1200.031000050l1300.031000050l1400.041000010l10199.441000010l10266.341000010l10355.2克隆形成小，多41000010l1041616.7克隆形成小，多5500025l10100.05500025l10200.05500025l10300.05500025l10400.062000050l10111.062000050l10211.062000050l10300.062000050l10400.07500010l2100.07500010l2200.07500010l2300.07500010l2400.081000025l2100.081000025l2200.081000025l2300.081000025l2400.092000050l2100.092000050l2200.092000050l2300.092000050l2400.0101000010l312020.8克隆形成小，多101000010l321111.5101000010l331414.6101000010l3433.1克隆形成小，多112000025l3199.4112000025l321717.7112000025l3300.0克隆形成小，多112000025l3444.2克隆形成小，多12500050l3100.012500050l3200.012500050l3300.012500050l3400.013500010l4100.013500010l4211.013500010l4300.013500010l4400.0141000025l4100.0141000025l4200.0141000025l4300.0141000025l4411.0152000050l4100.0152000050l4200.0152000050l4300.0152000050l4400.016500010l5100.016500010l5200.016500010l5300.016500010l5400.0171000025l5100.0171000025l5200.0171000025l5300.0171000025l5400.0182000050l5100.0182000050l5200.0182000050l5300.0182000050l5400.0191000010l611212.5克隆形成小，多191000010l621111.5191000010l631818.8191000010l6444.2克隆形成小，多202000025l6100.0202000025l6200.0202000025l6300.0202000025l6400.021500050l6100.021500050l6200.021500050l6300.021500050l6400.022500010l7160.0克隆形成小，多22500010l7277.322500010l7311.022500010l7444.2232000025l711111.5232000025l7290.0克隆形成小，多232000025l7399.4232000025l7444.2241000050l7100.0241000050l7200.0241000050l7300.0241000050l7400.0252000010l81110.0克隆形成小，多252000010l82180.0克隆形成小，多252000010l831010.4252000010l841717.7261000025l8100.0261000025l8200.0261000025l8300.0261000025l8400.027500050l8100.027500050l8200.027500050l8300.027500050l8400.0282000010l911818.8282000010l9266.3282000010l931111.5282000010l941313.529500025l9100.029500025l9200.029500025l9300.029500025l9400.0301000050l9100.0301000050l9200.0301000050l9300.0301000050l9400.0备注：如表3数据所示，96孔板最终统计克隆率是以形成细胞整体团块且团块汇合度＞20%作为统计标准，因此组10-l10-3，10-l10-4，10-l3-1，10-l3-4，25-l3-3，25-l3-4，10-l6-1，10-l6-4，10-l7-1，25-l7-2，10-l8-1，10-l8-2，虽然其细胞生长情况较好，有很多分散的小克隆，但没纳入统计中。如上表3所示，经培养基混料优化后，使用l3混料配方75%cdfusion（sigma，24365c）+25%chocloningmedium（sigma，c6366）在msx压力为10μm和25μm时，均有较多阳性克隆形成；msx压力为10μm时，相比其他基础培养基组或其余混料组，用l3培养基组克隆形成由0提高至20.8%；msx压力为25μm时，相比其他基础培养基组或其余混料组，用l3培养基组克隆形成由0提高至17.7%。需要说明的是，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。当前第1页1 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，具体涉及一种提高稳转细胞株细胞池形成率的方法。
背景技术：
：随着生物技术的发展，抗体、疫苗的表达和生产在生物制药中占据着重要地位，细胞株筛选可获得稳定高产的细胞株，稳转细胞株的构建是表达抗体疫苗的重要手段之一。目前细胞株筛选流程主要为：构建表达质粒，宿主细胞转染，细胞池加压筛选，单克隆筛选，获得高表达细胞株。merck的cho-k1表达系统，在细胞筛选时时添加谷氨酸合成酶(glutaminesythetase，gs)抑制剂氨基亚砜蛋氨酸(methioninesulfoximine，msx)，使gs基因及与之相连的目的基因一起扩增，达到提高目的基因表达水平的目的。从而大大提高了转染的效率和阳性克隆的筛选率。评估高表达细胞株的主要指标有蛋白表达量、蛋白质质量、细胞稳定性，这些指标与筛选出的细胞池密切相关。常规细胞池筛选方法为宿主细胞转入质粒后，进行多轮加压筛选，经过漫长的加压筛选后以获得高表达细胞池。目前cho-k1存在着细胞池筛选生长缓慢，克隆形成率低，阳性率低等问题，这严重的影响了稳转细胞株筛选的进程。因此如何利用工艺提高稳转细胞株细胞池的克隆率，缩短筛选时间，提高筛选通量，是亟需解决的问题。中国专利201910831248.5中公开了一种ndufs3基因敲低和/或过表达的稳转株及其构建方法，其中通过将目的基因导入细胞株，采用8-10μg/ml嘌呤霉素对转染后的细胞株进行至少一次筛选，得到ndufs3基因敲低和/或过表达的稳转株。该方法方法操作简单、用时短、转染率高，但更适用于ndufs3基因敲低和/或过表达的a875细胞、a375细胞和/或sk-mel-110细胞。中国专利201610173410.5公开了一种gs表达系统细胞株的高通量筛选方法，其中包括在25-100μm氨基亚砜蛋氨酸加压后，选择细胞活力在25％-35％的细胞池进行单克隆化筛选。其中gs表达系统为携带gs基因的并且gs基因下游插入了外源基因的表达载体转染至ns0细胞或者敲除了gs基因的cho细胞。但该筛选步骤中选用的是半固体培养基，与细胞悬液混匀时操作不便，有待进一步改进。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明提供了一种提高稳转细胞株细胞池形成率的方法。首先，本申请优化了培养稳转细胞的培养基，由传统培养基优化为混合三维培养基；其次，本申请优化了包括细胞接种密度及msx加压浓度在内的培养条件。根据本申请提供的方法，可以显著提高稳转细胞株细胞池的形成率。一方面，本发明提供了一种用于稳转细胞株培养中细胞池加压筛选的混合三维培养基。所述的培养基由三种基础培养基cdfusion，chocloningmedium，growtha组成。所述的培养基为l1-l10中的一种，l1-l10中各基础培养基的组成比例如表1所示。表1.改良培养基组成成分表cdfusionchocloningmediumgrowthal1100l20.500.5l30.750.250l40.50.50l50.50.250.25l60.7500.25l70.670.1650.165l80.80.10.1l90.60.30.1l100.60.10.3在一些实施例中，所述的cdchofusion为ex-cell®cdchofusion，购自sigma，货号为24365c；所述的chocloningmedium为excellchocloningmedium，购自sigma，货号为c6366；所述的growtha为balancdchogrowtha，购自irvine，货号为91128。优选地，所述的培养基为l3。优选地，所述的稳转细胞株为cho-k1。另一方面，本发明提供了一种提高稳转细胞株细胞池加压筛选时细胞池形成率的方法。所述的稳转细胞株在细胞池加压筛选时采用前述混合三维培养基进行培养。所述的培养过程中，培养基筛选压力（msx）为10-50μm。所述的培养过程中，铺板细胞密度为5000-20000个/孔。所述的培养过程中对混合培养基、铺板细胞密度、培养基筛选压力进行doe设计如表2所示。表2.混合培养基/铺板细胞密度/培养基筛选压力doe分组表格cells（个/孔）msx（um）basal12000010l12500025l131000050l141000010l105500025l1062000050l107500010l281000025l292000050l2101000010l3112000025l312500050l313500010l4141000025l4152000050l416500010l5171000025l5182000050l5191000010l6202000025l621500050l622500010l7232000025l7241000050l7252000010l8261000025l827500050l8282000010l929500025l9301000050l9优选地，所述的稳转细胞株细胞池加压筛选时的培育条件为l3培养基，msx压力为25μm，该条件下的铺板细胞密度为20000个/孔。优选地，所述的稳转细胞株细胞池加压筛选时的培育条件为l3培养基，msx压力为10μm，该条件下的铺板细胞密度为10000个/孔。优选地，所述的稳转细胞株细胞池加压筛选时的培育条件为l8培养基，msx压力为10μm，该条件下的铺板细胞密度为20000个/孔。优选地，所述的稳转细胞株细胞池加压筛选时的培育条件为l9培养基，msx压力为10μm，该条件下的铺板细胞密度为20000个/孔。优选地，所述的稳转细胞株为cho-k1。再一方面，本发明提供了一种稳转细胞株的培养方法。所述的培养方法包括以下步骤：1)细胞准备：电转前一天，将宿主细胞取样计数后接种于摇瓶中；2)电染当天：i、取步骤1中处于对数生长期的宿主细胞计数后，计算每个电转反应所需细胞体积。将细胞悬液以800rpm，4℃离心5min。弃上清，用cdfusion培养基重悬细胞，加入待转染质粒，吹打混匀，电转体积共800μl，将混合物加入电转杯中并冰浴1min；ii、将cdfusion培养基加入10cm平皿中，放入培养箱预热；iii、用bio-rad电转仪进行电转；iv、电击结束后，将电转后细胞转移至预热的培养基中，置于37℃，5%co2培养箱中静置培养；3)电染48h后：将转染后细胞计数，根据表2所示，每组按对应的细胞密度，对应的培养基将细胞离心重悬后接种于96孔板中，每组接种4块96孔板，培养体积为200μl；4）培养18天后统计每个培养条件下细胞池的形成率，以汇合度为20%为阳性克隆孔，计算每个条件阳性克隆孔个数。所述的步骤2）的第iii步中，设置点击参数如下：voltagetimepulse：300v；capacitance：950μf，4mm进行电击。优选地，所述的稳转细胞株为cho-k1。本发明的有益效果：1、在稳转细胞培养过程中，单独使用任意单种类基础培养基，在细胞池加压筛选时克隆形成率低，细胞恢复缓慢。本发明利用混料设计，将几种基础培养基按不同比例进行三维混合，能够显著提高细胞池克隆率。2、cho-k1gs（merck）表达系统通过msx加压筛选，使用用三维混合改良培养基相比基础优化细胞密度使96孔板中细胞池克隆形成率提升至20.8%，筛选周期显著降低。具体实施方式下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1一种稳转细胞株的培养方法本实施例中：ex-cell®cdchofusion购自sigma，货号为24365c；excellchocloningmedium购自sigma，货号为c6366；balancdchogrowtha购自irvine，货号为91128。待转染质粒的空载体为pcgs3，来自merck；待转染质粒表达fc融合蛋白。（1）细胞准备电转前一天，将宿主细胞chozn®chok1cells（购自safc）取样计数后，以0.8×106cells/ml细胞密度接种于摇瓶中。（2）电染i、取步骤（1）中处于对数生长期的宿主细胞计数后，以1×107cells/transfection计算每个电转反应所需细胞体积。将细胞悬液以800rpm，4℃离心5min；弃上清，用cdfusion培养基重悬细胞，加入待转染质粒60μg，吹打混匀，电转体积共800μl，将混合物加入电转杯中并冰浴1min；ii、将10mlcdfusion培养基加入10cm平皿中，放入培养箱预热；iii、用bio-rad电转仪进行电转，设置点击参数如下：voltagetimepulse：300v；capacitance:950μf，4mm进行电击；iv、电击结束后，将电转后细胞转移至预热的培养基中，置于37℃，5%co2培养箱中静置培养。（3）电染48h后将转染后细胞计数，根据表2所示每组按对应的细胞密度和培养基将细胞离心重悬后接种于96孔板中，每组接种4块96孔板，培养体积为200μl；培养18天后统计每个培养条件下细胞池的形成率，以汇合度为20%为阳性克隆孔，计算每个条件阳性克隆孔个数。结果如下表3所示：表3.96孔板中混料培养基/铺板细胞密度/培养基筛选压力对细胞池克隆形成的影响runcellsmsxbasal板号pool数量克隆率%备注12000010l111313.512000010l121515.612000010l1366.312000010l141111.52500025l1100.02500025l1200.02500025l1300.02500025l1400.031000050l1100.031000050l1200.031000050l1300.031000050l1400.041000010l10199.441000010l10266.341000010l10355.2克隆形成小，多41000010l1041616.7克隆形成小，多5500025l10100.05500025l10200.05500025l10300.05500025l10400.062000050l10111.062000050l10211.062000050l10300.062000050l10400.07500010l2100.07500010l2200.07500010l2300.07500010l2400.081000025l2100.081000025l2200.081000025l2300.081000025l2400.092000050l2100.092000050l2200.092000050l2300.092000050l2400.0101000010l312020.8克隆形成小，多101000010l321111.5101000010l331414.6101000010l3433.1克隆形成小，多112000025l3199.4112000025l321717.7112000025l3300.0克隆形成小，多112000025l3444.2克隆形成小，多12500050l3100.012500050l3200.012500050l3300.012500050l3400.013500010l4100.013500010l4211.013500010l4300.013500010l4400.0141000025l4100.0141000025l4200.0141000025l4300.0141000025l4411.0152000050l4100.0152000050l4200.0152000050l4300.0152000050l4400.016500010l5100.016500010l5200.016500010l5300.016500010l5400.0171000025l5100.0171000025l5200.0171000025l5300.0171000025l5400.0182000050l5100.0182000050l5200.0182000050l5300.0182000050l5400.0191000010l611212.5克隆形成小，多191000010l621111.5191000010l631818.8191000010l6444.2克隆形成小，多202000025l6100.0202000025l6200.0202000025l6300.0202000025l6400.021500050l6100.021500050l6200.021500050l6300.021500050l6400.022500010l7160.0克隆形成小，多22500010l7277.322500010l7311.022500010l7444.2232000025l711111.5232000025l7290.0克隆形成小，多232000025l7399.4232000025l7444.2241000050l7100.0241000050l7200.0241000050l7300.0241000050l7400.0252000010l81110.0克隆形成小，多252000010l82180.0克隆形成小，多252000010l831010.4252000010l841717.7261000025l8100.0261000025l8200.0261000025l8300.0261000025l8400.027500050l8100.027500050l8200.027500050l8300.027500050l8400.0282000010l911818.8282000010l9266.3282000010l931111.5282000010l941313.529500025l9100.029500025l9200.029500025l9300.029500025l9400.0301000050l9100.0301000050l9200.0301000050l9300.0301000050l9400.0备注：如表3数据所示，96孔板最终统计克隆率是以形成细胞整体团块且团块汇合度＞20%作为统计标准，因此组10-l10-3，10-l10-4，10-l3-1，10-l3-4，25-l3-3，25-l3-4，10-l6-1，10-l6-4，10-l7-1，25-l7-2，10-l8-1，10-l8-2，虽然其细胞生长情况较好，有很多分散的小克隆，但没纳入统计中。如上表3所示，经培养基混料优化后，使用l3混料配方75%cdfusion（sigma，24365c）+25%chocloningmedium（sigma，c6366）在msx压力为10μm和25μm时，均有较多阳性克隆形成；msx压力为10μm时，相比其他基础培养基组或其余混料组，用l3培养基组克隆形成由0提高至20.8%；msx压力为25μm时，相比其他基础培养基组或其余混料组，用l3培养基组克隆形成由0提高至17.7%。需要说明的是，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。当前第1页1 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