一种鉴定白皮松种质资源的SNP位点引物组合及应用的制作方法

本发明属于分子标记及其检测领域，具体涉及一种鉴定白皮松种质资源的核心snp位点、引物组合，基于snp位点的dna指纹数据库、数据库构建方法，以及基于snp位点的白皮松种质资源的鉴定方法、应用。

背景技术：

白皮松，拉丁学名pinusbungeanazucc.exendl，又名白骨松、三针松、白果松、虎皮松、蟠龙松，是我国特有的乡土树种，栽培历史悠久。其属于松属中针叶树种，天然分布在山西、陕西、甘肃、河南、四川、湖北等地。白皮松具有很高的生态价值和经济价值。其抗寒性、抗旱性和耐贫瘠性强，木材质地优良，树形优美。已成为我国生态环境林和城市园林绿化建设的优良树种。同时，白皮松具有抗臭氧、烟尘、so2作用；花粉松脂含量较高，具有保健功效。最新研究表明，白皮松在受试树种中，吸附pm2.5能力最强，其净化环境的能力也将使白皮松成为城市园林建设的明星树种。

由于生态环境的破坏、人为的干扰、白皮松本身更新困难等诸多因素，白皮松数量较少，其天然群体逐渐退化至悬崖或者山顶，多样性的保存面临较大的挑战。白皮松前期生长非常缓慢，通过长期进化得来的变异来之不易，因此，对白皮松遗传资源进行有效保护意义重大。由于白皮松如今大多数呈零星分布，原生种质资源缩减，多样性相对贫乏，目前绝大部分种质资源的鉴定工作与保护处于空白状态。因此，对白皮松遗传多样性、群体遗传结构、种质资源鉴定评价等急需开发一套适用于白皮松种质资源的dna快速检测技术，促进白皮松种质资源的保护利用与良种选育工作。

近年来，人们通过在分子水平对白皮松群体多样进行了研究，比如aflp、issr、scar、srap、sts等各类分子标记。snp作为第三代分子标记，以其数量多、分布广、遗传稳定等优点受到广泛重视。随着高通量测序技术的不断发展和测序成本的不断降低，基于分析白皮松的变异组信息，可以挖掘更加稳定高效的snp位点。目前，仍然未有关于利用snp位点来鉴定白皮松的种质资源的报道。科研和实践中需要构建出基于核心snp位点的白皮松dna指纹数据库，以及一种基于核心snp位点来鉴定白皮松种质资源的方法和应用。

技术实现要素：

本发明提供了一种鉴定白皮松种质资源的核心snp位点、引物组合，以及基于snp位点的dna指纹数据库、数据库构建方法，基于snp位点的白皮松种质资源的鉴定方法、应用。

本发明是通过以下的技术方案实现的：

鉴定白皮松种质资源的snp位点，所述snp位点选自如下第一snp位点到第三十六snp位点中的任1到36种：第一snp位点，所述第一snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：109所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为t或c；第二snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：110所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g或t；第三snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：111所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g或a；第四snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：112所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为a或c；第五snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：113所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为a或g；第六snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：114所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g或t；第七snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：115所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g或a；第八snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：116所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g或a；第九snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：117所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g或c；第十snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：118所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为a或g；第十一snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：119所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g或a；第十二snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：120所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g或t；第十三snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：121所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g或a；第十四snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：122所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为a或t；第十五snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：123所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g或a；第十六snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：124所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为c或t；第十七snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：125所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为c或a；第十八snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：126所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为c或g；第十九snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：127所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为t或a；第二十snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：128所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为c或a；第二十一snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：129所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为c或t；第二十二snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：130所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为t或g；第二十三snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：131所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为c或a；第二十四snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：132所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为c或t；第二十五snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：133所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为a或g；第二十六snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：134所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g或t；第二十七snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：135所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g或c；第二十八snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：136所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为a或g；第二十九snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：137所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为t或g；第三十snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：138所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为a或g；第三十一snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：139所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g或t；第三十二snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：140所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g或a；第三十三snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：141所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为c或g；第三十四snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：142所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为t或c；第三十五snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：143所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为a或g；第三十六snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：144所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为t或g。

在一些实施方式中，所述的snp位点：所述第一snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：109所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：109的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第二snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：110所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：110的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第三snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：111所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：111的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第四snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：112所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：112的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第五snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：113所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：113的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第六snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：114所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：114的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第七snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：115所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：115的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第八snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：116所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：116的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第九snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：117所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：117的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第十snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：118所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第十一snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：119所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：119的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第十二snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：120所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：120的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第十三snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：121所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：121的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第十四snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：122所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：122的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第十五snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：123所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：123的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第十六snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：124所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：124的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第十七snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：125所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：125的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第十八snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：126所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：126的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第十九snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：127所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：127的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第二十snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：128所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：128的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第二十一snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：129所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：129的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第二十二snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：130所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：130的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第二十三snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：131所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：131的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第二十四snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：132所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno132：的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第二十五snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：133所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：133的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第二十六snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：134所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：134的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第二十七snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：135所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：135的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第二十八snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：136所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：136的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第二十九snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：137所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：137的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第三十snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：138所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：138的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第三十一snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：139所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：139的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第三十二snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：140所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：140的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第三十三snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：141所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：141的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第三十四snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：142所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：142的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第三十五snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：143所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：143的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；所述第三十六snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：144所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：144的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％。

鉴定白皮松种质资源的snp引物组，于分别扩增所述的snp位点，包括：第一snp引物组，用于扩增所述第一snp位点；第二snp引物组，用于扩增所述第二snp位点；第三snp引物组，用于扩增所述第三snp位点；第四snp引物组，用于扩增所述第四snp位点；第五snp引物组，用于扩增所述第五snp位点；第六snp引物组，用于扩增所述第六snp位点；第七snp引物组，用于扩增所述第七snp位点；第八snp引物组，用于扩增所述第八snp位点；第九snp引物组，用于扩增所述第九snp位点；第十snp引物组，用于扩增所述第十snp位点；第十一snp引物组，用于扩增所述第十一snp位点；第十二snp引物组，用于扩增所述第十二snp位点；第十三snp引物组，用于扩增所述第十三snp位点；第十四snp引物组，用于扩增所述第十四snp位点；第十五snp引物组，用于扩增所述第十五snp位点；第十六snp引物组，用于扩增所述第十六snp位点；第十七snp引物组，用于扩增所述第十七snp位点；第十八snp引物组，用于扩增所述第十八snp位点；第十九snp引物组，用于扩增所述第十九snp位点；第二十snp引物组，用于扩增所述第二十snp位点；第二十一snp引物组，用于扩增所述第二十一snp位点；第二十二snp引物组，用于扩增所述第二十二snp位点；第二十三snp引物组，用于扩增所述第二十三snp位点；第二十四snp引物组，用于扩增所述第二十四snp位点；第二十五snp引物组，用于扩增所述第二十五snp位点；第二十六snp引物组，用于扩增所述第二十六snp位点；第二十七snp引物组，用于扩增所述第二十七snp位点；第二十八snp引物组，用于扩增所述第二十八snp位点；第二十九snp引物组，用于扩增所述第二十九snp位点；第三十snp引物组，用于扩增所述第三十snp位点；第三十一snp引物组，用于扩增所述第三十一snp位点；第三十二snp引物组，用于扩增所述第三十二snp位点；第三十三snp引物组，用于扩增所述第三十三snp位点；第三十四snp引物组，用于扩增所述第三十四snp位点；第三十五snp引物组，用于扩增所述第三十五snp位点；第三十六snp引物组，用于扩增所述第三十六snp位点。

在一些实施方式中，所述snp引物组：所述第一snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第二snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第三snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第四snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：10、seqidno：11、seqidno：12的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第五snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：13、seqidno：14、seqidno：15的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第六snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：16、seqidno：17、seqidno：18的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第七snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：19、seqidno：20、seqidno：21的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第八snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：22、seqidno：23、seqidno：24的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第九snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：25、seqidno：26、seqidno：27的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第十snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：28、seqidno：29、seqidno：30的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第十一snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：31、seqidno：32、seqidno：33的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第十二snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：34、seqidno：35、seqidno：36的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第十三snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：37、seqidno：38、seqidno：39的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第十四snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：40、seqidno：41、seqidno：42的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第十五snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：43、seqidno：44、seqidno：45的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第十六snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：46、seqidno：47、seqidno：48的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第十七snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：49、seqidno：50、seqidno：51的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第十八snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：52、seqidno：53、seqidno：54的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第十九snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：55、seqidno：56、seqidno：57的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第二十snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：58、seqidno：59、seqidno：60的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第二十一snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：61、seqidno：62、seqidno：63的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第二十二snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：64、seqidno：65、seqidno：66的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第二十三snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：67、seqidno：68、seqidno：69的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第二十四snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：70、seqidno：71、seqidno：72的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第二十五snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：73、seqidno：74、seqidno：75的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第二十六snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：76、seqidno：77、seqidno：78的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第二十七snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：79、seqidno：80、seqidno：81的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第二十八snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：82、seqidno：83、seqidno：84的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第二十九snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：85、seqidno：86、seqidno：87的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第三十snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：88、seqidno：89、seqidno：90的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第三十一snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：91、seqidno：92、seqidno：93的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第三十二snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：94、seqidno：95、seqidno：96的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第三十三snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：97、seqidno：98、seqidno：99的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第三十四snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：100、seqidno：101、seqidno：102的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第三十五snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：103、seqidno：104、seqidno：105的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；所述第三十六snp引物组中，第一上游引物的特异性部分、第二上游引物的特异性部分和下游引物分别与序列表中的seqidno：106、seqidno：107、seqidno：108的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；优选地，每组所述引物中的第一上游引物和第二上游引物连接有不同的荧光分子，更优选，所述荧光分子选自fam、hex。

鉴定白皮松种质资源的snp试剂盒，其特征在于：所述snp试剂盒配制为竞争性等位基因特异性pcr反应体系；所述反应体系包括：所述snp引物组，优选地，所述snp引物组中，每个引物组的第一上游引物、第二上游引物、下游引物在所述体系中浓度之比为2:2:5。

一种基于snp标记的白皮松种质资源dna指纹数据库，其特征在于：所述dna指纹数据库包括：标准白皮松种质资源的、所述snp位点的基因型。

在一些实施方式中，所述标准白皮松种质资源选自以下137个白皮松种质资源：京系1号，京系11号，京系12号，京系13号，京系14号，京系15号，京系2号，京系3号，京系4号，京系5号，京系6号，京系7号，京系8号，京系9号，盆仙，瑞王，九号树，甘净1号，甘净10号，甘净11号，甘净12号，甘净13号，甘净14号，甘净15号，甘净2号，甘净3号，甘净4号，甘净5号，甘净6号，甘净7号，甘净8号，甘净9号，甘两1号，甘两10号，甘两11号，甘两12号，甘两13号，甘两14号，甘两15号，甘两2号，甘两3号，甘两4号，甘两5号，甘两6号，甘两7号，甘两8号，甘两9号，晋临1号，晋临10号，晋临11号，晋临12号，晋临13号，晋临14号，晋临15号，晋临2号，晋临3号，晋临4号，晋临5号，晋临6号，晋临8号，晋临9号，甘天1号，甘天10号，甘天11号，甘天12号，甘天13号，甘天14号，甘天15号，甘天2号，甘天3号，甘天4号，甘天5号，甘天6号，甘天7号，甘天8号，甘天9号，晋孝13号，晋孝14号，晋孝15号，陕洛1号，陕洛10号，陕洛11号，陕洛12号，陕洛13号，陕洛14号，陕洛15号，陕洛2号，陕洛3号，陕洛4号，陕洛5号，陕洛6号，陕洛7号，陕洛8号，陕洛9号，陕蓝1号，陕蓝10号，陕蓝11号，陕蓝12号，陕蓝13号，陕蓝14号，陕蓝15号，陕蓝16号，陕蓝2号，陕蓝3号，陕蓝5号，陕蓝6号，陕蓝8号，陕蓝9号，陕陇1号，陕陇10号，陕陇11号，陕陇12号，陕陇13号，陕陇14号，陕陇15号，陕陇2号，陕陇3号，陕陇4号，陕陇5号，陕陇6号，陕陇7号，陕陇8号，陕陇9号，郑系1号，郑系10号，郑系11号，郑系12号，郑系13号，郑系14号，郑系15号，郑系2号，郑系4号，郑系5号，郑系6号，郑系7号，郑系8号，郑系9号。

所述dna指纹数据库的构建方法，包括：pcr反应步骤：采用所述pcr反应体系，对标准白皮松种质资源进行竞争性等位基因特异性pcr扩增反应，得到pcr反应产物；snp位点基因型获得步骤：对所述pcr反应产物进行检测，得到所述snp位点的基因型；优选地，所述检测为荧光信号检测或直接测序。

一种鉴定白皮松种质资源的检测方法，包括以下步骤：步骤一：检测待测白皮松的所述snp位点的基因型；步骤二：所述待测白皮松的种质资源判定：如果所述待测白皮松基于所述36个snp位点的基因型，和所述数据库中标准白皮松种质资源中的某指定种质资源的基于所述36个snp位点的基因型的差异位点数为0-2，则待测白皮松与该指定种质资源判定为相似的种质资源；如果所述待测白皮松基于所述36个snp位点的基因型，和所述数据库中标准白皮松种质资源中的某指定种质资源的基于所述36个snp位点的基因型的差异位点数为2个以上，则待测白皮松与该指定种质资源判定为不同的白皮松种质资源；优选地，所述判定的结果是根据聚类分析得到的。

所述snp位点，或所述snp引物组合，或所述snp试剂盒，或所述dna指纹数据库，或所述构建方法得到的dna指纹数据库，或所述检测方法，在以下x1或x2中的应用：x1：鉴定待测白皮松的种质资源是否属于标准白皮松种质资源中的某一种；x2：鉴定待测白皮松的种质资源具体为标准白皮松种质资源中的哪一种。

本发明相比现有技术具有以下有益效果：

1、本发明建立了基于高通量测序鉴定白皮松种质资源的dna指纹数据库，可用于对白皮松种质资源在种子、幼苗、叶片等组织或器官进行早期鉴定，切实保护育种家的权益，为白皮松种质资源保护提供技术支持。

2、本发明提供的方法既可以对未知白皮松种质资源进行鉴定，也可以对已知白皮松种质资源进行鉴定。本发明提供的方法具有高通量、准确、低成本、操作简单、节约人力、物力等优点，具有十分广阔的应用前景。

3、本发明基于137份白皮松种质资源的slaf测序数据，进行大数据挖掘白皮松种质资源的snp，为白皮松种质资源鉴定提供了候选位点，并采用等位基因竞争性特异pcr法，开发其特异性引物，进行高通量、低成本、自动化快速检测，最终获得白皮松种质资源的snp基因型。

附图说明

图1：为实施案例1中本发明中36个snp和随机36个snp对150份种质资源的鉴定能力图。其中，圆形标记的曲线为本申请中36个snp鉴定150份白皮松种质资源的鉴定能力；三角形标记的曲线为随机选取的36个snp鉴定150份白皮松种质资源的鉴定能力。

图2：为实施例2中36个snp位点检测137份供试白皮松种质资源基因型的96孔样品板snp分型结果示意图。

图3：为实施例2中建立在36个snp引物组上的137个供试白皮松种质资源的聚类图。

图4：为实施例2中36个snp位点鉴定137份供试白皮松种质资源的鉴定能力曲线图。

具体实施方式

本发明的定义如下：

白皮松种质资源鉴定：实质上是指一个白皮松种质资源与其遗传背景的对应性；在实际工作中，某供检白皮松种质资源是否与白皮松种质资源数据库中的一种白皮松种质资相似，是该指供检种质资源与文件记录(如种质资源说明书、标签等)是否相符。

种质资源间同源基因组片段：是指一个物种的不同种质源(比如，包括但不限于本发明所述137个标准种质资源的白皮松)中相同染色体的相同区段的非重复(单拷贝)同源基因组片段。非重复指在一个种质资源中该基因组片段只在一个基因组位置存在，对于多倍体，可以是纯合的，也可以是杂合的，一个种植资源的基因组其他位置没有高度同源的基因组片段，但在不同的种质资源中普遍存在高度同源的基因组片段，比如，seqidno：109示出了白皮松种质资源间同源基因组片段之一。

种质资源间同源基因组片段上的相应位点：是指以一个物种中的一个种质资源(比如，包括但不限于本发明所述137个标准种质资源的白皮松之一)为参考种质资源，该参考种质资源上具有特定的多态性基因组片段，在该多态性基因组片段中特定位点的碱基(比如，seqidno：109所示序列第21位)在不同种质资源之间是高度多态的(比如，seqidno：109所示序列第21位主要是t或c，还有可能是其他碱基)，而其上下游的一段序列(比如，seqidno：109所示序列第1-20,22-41位)在不同种质资源之间是高度保守的(该区域可能会发生小的突变，该突变是随机的，没有扩散到群体当中，其不具有一个种质资源内的普遍性，而忽略了该突变后考察该snp，则该snp具备该种质资源内的普遍性)，则在该物种的种质资源间同源基因组片段中，该高度保守的基因组片段中的该高度多态的碱基即种质资源间同源基因组片段上的相应位点。

本发明早期基于slaf测序(specific-locusamplifiedfragmentsequencing)，完成了150白皮松种质资源的测序。由于白皮松基因组高度杂合，且基因组较大，近年来才公布了scaffold水平的基因组。本发明的150份种质资源重测序分析基于无参考基因组方法，获得了多态性高的snp位点，进一步经过kaspar平台验证。由于参考基因组的不完整，36个snp中5个snp可确定到基因组的scaffold上。本发明利用上述36个snp，构建出基于核心snp位点的白皮松dna指纹数据库，以及一种基于核心snp位点来鉴定白皮松种质资源的方法和应用。

第一方面，本发明提供鉴定白皮松种质资源的核心snp位点(核心snp位点的定义为：一组能鉴定目标种质资源的最少snp组合，且能尽可能代表全基因组snp；核心位点与非核心位点的区别为：核心位点多态性更高，能使用最少的标记区分目标种质资源)，选自如下第一snp位点到第三十六snp位点中的任1到36种，参见表1：

第一snp位点，所述第一snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：109所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为t或c；

第二snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：110所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g或t；

第三snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：111所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g或a；

第四snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：112所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为a或c；

第五snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：113所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为a或g；

第六snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：114所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g或t；

第七snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：115所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g或a；

第八snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：116所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g或a；

第九snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：117所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g或c；

第十snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：118所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为a或g；

第十一snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：119所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g或a；

第十二snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：120所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g或t；

第十三snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：121所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g或a；

第十四snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：122所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为a或t；

第十五snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：123所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g或a；

第十六snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：124所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为c或t；

第十七snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：125所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为c或a；

第十八snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：126所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为c或g；

第十九snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：127所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为t或a；

第二十snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：128所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为c或a；

第二十一snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：129所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为c或t；

第二十二snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：130所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为t或g；

第二十三snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：131所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为c或a；

第二十四snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：132所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为c或t；

第二十五snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：133所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为a或g；

第二十六snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：134所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g或t；

第二十七snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：135所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g或c；

第二十八snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：136所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为a或g；

第二十九snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：137所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为t或g；

第三十snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：138所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为a或g；

第三十一snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：139所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g或t；

第三十二snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：140所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为g或a；

第三十三snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：141所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为c或g；

第三十四snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：142所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为t或c；

第三十五snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：143所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为a或g；

第三十六snp位点，所述第snp位点位于白皮松基因组中如序列表中的seqidno：144所述序列第21位，或其种质资源间同源基因组片段上的相应位点，该位点的核苷酸碱基为t或g。

所述第一snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：109所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：109的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第二snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：110所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：110的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第三snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：111所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：111的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第四snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：112所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：112的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第五snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：113所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：113的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第六snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：114所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：114的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第七snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：115所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：115的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第八snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：116所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：116的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第九snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：117所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：117的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第十snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：118所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第十一snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：119所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：119的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第十二snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：120所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：120的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第十三snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：121所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：121的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第十四snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：122所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：122的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第十五snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：123所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：123的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第十六snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：124所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：124的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第十七snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：125所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：125的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第十八snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：126所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：126的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第十九snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：127所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：127的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第二十snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：128所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：128的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第二十一snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：129所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：129的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第二十二snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：130所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：130的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第二十三snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：131所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：131的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第二十四snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：132所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno132：的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第二十五snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：133所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：133的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第二十六snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：134所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：134的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第二十七snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：135所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：135的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第二十八snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：136所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：136的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第二十九snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：137所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：137的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第三十snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：138所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：138的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第三十一snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：139所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：139的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第三十二snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：140所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：140的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第三十三snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：141所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：141的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第三十四snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：142所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：142的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第三十五snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：143所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：143的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％；

所述第三十六snp位点及其上下游碱基的序列为序列表中的seqidno：144所述序列的片段或其种质资源间同源基因组片段，更优选与序列表中的seqidno：144的核苷酸序列的同一性大于等于95％、96％、97％、98％或99％。

第二方面，本发明提供鉴定白皮松种质资源的snp引物组的组合，所述snp引物组包括：

第一snp引物组，用于扩增所述第一snp位点；第二snp引物组，用于扩增所述第二snp位点；第三snp引物组，用于扩增所述第三snp位点；第四snp引物组，用于扩增所述第四snp位点；第五snp引物组，用于扩增所述第五snp位点；第六snp引物组，用于扩增所述第六snp位点；第七snp引物组，用于扩增所述第七snp位点；第八snp引物组，用于扩增所述第八snp位点；第九snp引物组，用于扩增所述第九snp位点；第十snp引物组，用于扩增所述第十snp位点；第十一snp引物组，用于扩增所述第十一snp位点；第十二snp引物组，用于扩增所述第十二snp位点；第十三snp引物组，用于扩增所述第十三snp位点；第十四snp引物组，用于扩增所述第十四snp位点；第十五snp引物组，用于扩增所述第十五snp位点；第十六snp引物组，用于扩增所述第十六snp位点；第十七snp引物组，用于扩增所述第十七snp位点；第十八snp引物组，用于扩增所述第十八snp位点；第十九snp引物组，用于扩增所述第十九snp位点；第二十snp引物组，用于扩增所述第二十snp位点；第二十一snp引物组，用于扩增所述第二十一snp位点；第二十二snp引物组，用于扩增所述第二十二snp位点；第二十三snp引物组，用于扩增所述第二十三snp位点；第二十四snp引物组，用于扩增所述第二十四snp位点；第二十五snp引物组，用于扩增所述第二十五snp位点；第二十六snp引物组，用于扩增所述第二十六snp位点；第二十七snp引物组，用于扩增所述第二十七snp位点；第二十八snp引物组，用于扩增所述第二十八snp位点；第二十九snp引物组，用于扩增所述第二十九snp位点；第三十snp引物组，用于扩增所述第三十snp位点；第三十一snp引物组，用于扩增所述第三十一snp位点；第三十二snp引物组，用于扩增所述第三十二snp位点；第三十三snp引物组，用于扩增所述第三十三snp位点；第三十四snp引物组，用于扩增所述第三十四snp位点；第三十五snp引物组，用于扩增所述第三十五snp位点；第三十六snp引物组，用于扩增所述第三十六snp位点。

在一些实施方式中，所述第一snp引物组，包括所述第一snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第一snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第一snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第二snp引物组，包括所述第二snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第二snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第二snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第三snp引物组，包括所述第三snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第三snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第三snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第四snp引物组，包括所述第四snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第四snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第四snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：10、seqidno：11、seqidno：12的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第五snp引物组，包括所述第五snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第五snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第五snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：13、seqidno：14、seqidno：15的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第六snp引物组，包括所述第六snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第六snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第六snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：16、seqidno：17、seqidno：18的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第七snp引物组，包括所述第七snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第七snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第七snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：19、seqidno：20、seqidno：21的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第八snp引物组，包括所述第八snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第八snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第八snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：22、seqidno：23、seqidno：24的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第九snp引物组，包括所述第九snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第九snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第九snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：25、seqidno：26、seqidno：27的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第十snp引物组，包括所述第十snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第十snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第十snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：28、seqidno：29、seqidno：30的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第十一snp引物组，包括所述第十一snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第十一snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第十一snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：31、seqidno：32、seqidno：33的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第十二snp引物组，包括所述第十二snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第十二snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第十二snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：34、seqidno：35、seqidno：36的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第十三snp引物组，包括所述第十三snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第十三snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第十三snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：37、seqidno：38、seqidno：39的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第十四snp引物组，包括所述第十四snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第十四snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第十四snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：40、seqidno：41、的seqidno：42的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第十五snp引物组，包括所述第十五snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第十五snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第十五snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：43、seqidno：44、seqidno：45的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第十六snp引物组，包括所述第十六snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第十六snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第十六snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：46、seqidno：47、seqidno：48的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第十七snp引物组，包括所述第十七snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第十七snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第十七snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：49、seqidno：50、seqidno：51的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第十八snp引物组，包括所述第十八snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第十八snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第十八snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：52、seqidno：53、seqidno：54的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第十九snp引物组，包括所述第十九snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第十九snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第十九snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：55、seqidno：56、seqidno：57的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第二十snp引物组，包括所述第二十snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第二十snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第二十snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：58、seqidno：59、seqidno：60的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第二十一snp引物组，包括所述第二十一snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第二十一snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第二十一snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：61、seqidno：62、seqidno：63的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第二十二snp引物组，包括所述第二十二snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第二十二snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第二十二snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：64、seqidno：65、seqidno：66的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第二十三snp引物组，包括所述第二十三snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第二十三snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第二十三snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：67、seqidno：68、seqidno：69的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第二十四snp引物组，包括所述第二十四snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第二十四snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第二十四snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：70、seqidno：71、seqidno：72的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第二十五snp引物组，包括所述第二十五snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第二十五snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第二十五snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：73、seqidno：74、seqidno：75的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第二十六snp引物组，包括所述第二十六snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第二十六snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第二十六snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：76、seqidno：77、seqidno：78的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第二十七snp引物组，包括所述第二十七snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第二十七snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第二十七snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：79、seqidno：80、seqidno：81的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第二十八snp引物组，包括所述第二十八snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第二十八snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第二十八snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：82、seqidno：83、seqidno：84的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第二十九snp引物组，包括所述第二十九snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第二十九snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第二十九snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：85、seqidno：86、seqidno：87的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第三十snp引物组，包括所述第三十snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第三十snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第三十snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：88、seqidno：89、seqidno：90的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第三十一snp引物组，包括所述第三十一snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第三十一snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第三十一snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：91、seqidno：92、seqidno：93的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第三十二snp引物组，包括所述第三十二snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第三十二snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第三十二snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：94、seqidno：95、seqidno：96的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第三十三snp引物组，包括所述第三十三snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第三十三snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第三十三snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：97、seqidno：98、seqidno：99的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第三十四snp引物组，包括所述第三十四snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第三十四snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第三十四snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：100、seqidno：101、seqidno：102的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第三十五snp引物组，包括所述第三十五snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第三十五snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第三十五snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：103、seqidno：104、seqidno：105的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％；

所述第三十六snp引物组，包括所述第三十六snp引物组的第一上游引物(f1)的特异性部分、所述第三十六snp引物组的第二上游引物(f2)的特异性部分、所述第三十六snp引物组的下游引物(r)，分别与序列表中的seqidno：106、seqidno：107、seqidno：108的核苷酸序列的同一性大于等于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选为100％。

在优选的实施方式中，上述snp引物组合选自引物组01-36中的一组或多组；上述引物组01-36的dna序列信息如序列表seqid：108所示，参见表2。

上述引物组中，上游引物的5′端可带有荧光标签序列以便荧光pcr检测，每组所述引物中的第一上游引物和第二上游引物连接有不同的荧光分子，更优选，所述荧光分子选自fam、hex，进一步优选地，组所述引物中的第一上游引物连接有fam，第二上游引物连接有hex；例如fam荧光标签序列的荧光信号为蓝色，hex荧光标签序列的荧光信号为红色。

第三方面，本发明提供鉴定白皮松种质资源的核心snp试剂盒，该试剂盒配制为竞争性等位基因特异性pcr反应体系，该体系优选包括：上述snp引物组中，每个引物组的第一上游引物、第二上游引物、下游引物在上述体系中浓度之比为2:2:5；

该反应体系中的试剂、耗材和仪器均由lgc公司提供，包括试剂用量、用法、以及整个实验步骤按照lgc公司的操作指南kaspuserguideandmanual(www.lgcgenomics.com)进行，kaspar反应在384孔板(partno.kbs-0750-001)或96孔板(partno.kbs-0751-001)中进行，反应体系为3ul或1ul，如下表所示。

表：384孔板或96孔板的kasp反应体系

*由lgc公司提供或其它具有as-pcr检测能力的试剂盒

上述试剂盒的制备方法包括将上述任一引物组中各条引物分别单独包装。

第四方面，本发明提供上述基于核心snp标记的白皮松种质资源dna指纹数据库，上述dna指纹数据库包括：标准白皮松种质资源在上述36个snp位点的基因型。

上述标准白皮松种质资源选自以下137个白皮松种质资源：

京系1号，京系11号，京系12号，京系13号，京系14号，京系15号，京系2号，京系3号，京系4号，京系5号，京系6号，京系7号，京系8号，京系9号，盆仙，瑞王，九号树，甘净1号，甘净10号，甘净11号，甘净12号，甘净13号，甘净14号，甘净15号，甘净2号，甘净3号，甘净4号，甘净5号，甘净6号，甘净7号，甘净8号，甘净9号，甘两1号，甘两10号，甘两11号，甘两12号，甘两13号，甘两14号，甘两15号，甘两2号，甘两3号，甘两4号，甘两5号，甘两6号，甘两7号，甘两8号，甘两9号，晋临1号，晋临10号，晋临11号，晋临12号，晋临13号，晋临14号，晋临15号，晋临2号，晋临3号，晋临4号，晋临5号，晋临6号，晋临8号，晋临9号，甘天1号，甘天10号，甘天11号，甘天12号，甘天13号，甘天14号，甘天15号，甘天2号，甘天3号，甘天4号，甘天5号，甘天6号，甘天7号，甘天8号，甘天9号，晋孝13号，晋孝14号，晋孝15号，陕洛1号，陕洛10号，陕洛11号，陕洛12号，陕洛13号，陕洛14号，陕洛15号，陕洛2号，陕洛3号，陕洛4号，陕洛5号，陕洛6号，陕洛7号，陕洛8号，陕洛9号，陕蓝1号，陕蓝10号，陕蓝11号，陕蓝12号，陕蓝13号，陕蓝14号，陕蓝15号，陕蓝16号，陕蓝2号，陕蓝3号，陕蓝5号，陕蓝6号，陕蓝8号，陕蓝9号，陕陇1号，陕陇10号，陕陇11号，陕陇12号，陕陇13号，陕陇14号，陕陇15号，陕陇2号，陕陇3号，陕陇4号，陕陇5号，陕陇6号，陕陇7号，陕陇8号，陕陇9号，郑系1号，郑系10号，郑系11号，郑系12号，郑系13号，郑系14号，郑系15号，郑系2号，郑系4号，郑系5号，郑系6号，郑系7号，郑系8号，郑系9号。

第五方面，本发明提供上述白皮松种质资源dna指纹数据库的构建方法，包括以下步骤：

s1：kasp反应：采用上述反应体系，对上述标准白皮松种质资源进行竞争性等位基因特异性pcr扩增反应，得到pcr反应产物；

pcr反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touchdown程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环；终延伸：72℃10min。形成的扩增产物电泳前于4℃保存。

s2：snp位点基因型获得：对上述pcr反应产物进行检测，得到所述snp位点的基因型。

上述检测的方法可选自：为荧光信号检测，直接测序，限制性内切酶酶切。

第六方面，本发明提供鉴定白皮松种质资源的资源检测方法，包括以下步骤：

s1、检测待测白皮松的上述snp位点的基因型：

分别以待测白皮松的基因组dna为模板，分别采用上述snp引物组合中的引物组的进行竞争性等位基因特异性pcr扩增反应，得到pcr扩增产物；

s2、所述待测白皮松的种质资源判定：将待测白皮松的snp位点的基因型与上述dna指纹数据库比对，通过聚类分析得到结果并进行判断，其判断标准为：

如果待测白皮松种质资源与某标准白皮松种质资源(供试白皮松种质资源)的差异位点数为2个以上，则待测白皮松种质资源和该标准白皮松种质资源判定为不同的白皮松种质资源；差异位点数越多，遗传亲缘关系越远。

如果待测白皮松种质资源与某标准白皮松种质资源(供试白皮松种质资源)的差异位点数为0-2，则待测白皮松种质资源和该标准白皮松种质资源判定为相似的白皮松种质资源。

第七方面，本发明提供上述snp位点，snp引物组合，snp试剂盒，dna指纹数据库检测方法，在以下x1或x2中的应用：

x1：鉴定待测白皮松的种质资源是否属于标准白皮松种质资源中的某一种；

x2：鉴定待测白皮松的种质资源具体为标准白皮松种质资源中的哪一种；

x1、x2均属于鉴定白皮松种质资源资源的应用，其中包括鉴定白皮松种质资源资源的真伪性。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买得到的。

实施例1

用于鉴定白皮松种质资源的位点和引物组合的获得

一、36个核心snp位点的发现

本发明采用illumina测序仪，基于150份白皮松种质资源的slaf测序(specific-locusamplifiedfragmentsequencing)数据，最终获得36个snp位点。这150份白皮松种质资源来自中国不同省份，遗传多样性高，极具有遗传代表性。

snp位点筛选标准如下：(1)slaf测序，基于无参考基因组方法，获得20,911snp，去除maf<0.05，缺失率>0.3，杂合率大于0.3的snp位点，获得7,795snp。(2)提取侧翼序列，去除snp位于两个reads头和尾20bp内，根据实际情况截取上下游各截取20-40bp，获得3,843snp。(3)设计kaspar平台引物，将1,629snp设计成kaspar引物。(4)为了筛选出一组具有代表性的snp，根据候选snp位点计算的遗传距离与7,795snp计算的遗传距离皮尔森相关系数大于0.9；同时，任何两个种质资源之间至少有1个snp基因型不同。利用java编程进行数据处理，最终筛选出鉴定白皮松种质资源的36个snp位点。

本发明利用blast软件，将上述36个snp侧翼各20bp序列比对到scaffold水平的参考基因组，36个snp中5个snp可确定到scaffold水平。这是由于白皮松基因组较大，且复杂，组装出来的基因组不完整。本发明中的36个snp是经过slaf测序和kaspar平台双重验证得到的，确定真实可靠。上述36个snp位点的基本信息详见表1。

表1.36个snp位点的基本信息

二、36个snp对150份白皮松种质资源效率评价

图1表明，圆形标记的曲线为本发明中36个snp鉴定150份白皮松种质资源的鉴定能力；三角形标记的曲线为随机选取的36个snp(选自上述20,911个snp)鉴定150份白皮松种质资源的鉴定能力。以至少2个snp位点不一样为样本鉴定的阈值，本发明中的16个snp可100％鉴定150份白皮松种质资源，但本发明中的全部的36个snp，为了更多鉴定其他种质资源；随机36个snp仅能鉴定97.3％的snp。故本发明中的36个snp对150份白皮松种质资源鉴定能力更好。

三、用于鉴定白皮松种质资源的引物组合的获得

根据以上发现的36个snp位点，开发出能代表全基因组snp且适合用等位基因竞争性特异pcr(kasp)法鉴定白皮松种质资源的引物组合。

snp引物组合由48个引物组组成，每个引物组的名称见表(表2)。每个引物组由3条引物序列组成，包括第一上游引物、第二上游引物、下游引物，用于扩增一个snp位点。48个引物组中各个引物的核苷酸序列见表2。表2的第2-4列中，单下划线为fam荧光标签序列(gaaggtgaccaagttcatgct)，双下划线为hex荧光标签序列(gaaggtcggagtcaacggatt)，无下划线为特异性部分的序列。

表2：36个snp位点的snp引物核酸序列统计表

实施例2

本实施例为实施例1开发的snp引物组合的有效性检验，同时也是基于上述36个核心snp标记的白皮松种质资源dna指纹数据库的构建。

本实施例的137个供试白皮松种质资源均为常见的优良种质资源，具体情况如下表3：

表3：种质资源来源

1、供试白皮松种质资源的基因组dna的获得

采用ctab法分别提取137个供试白皮松种质资源资源的针叶的基因组dna，得到供试白皮松种质资源资源的基因组dna。

上述ctab法的操作具体为：

(1)分别摘取成熟期的上述137个白皮松种质资源资源的针叶，置于冷冻干燥仪(coolsafe55-4)中脱水；加入5mg左右的vc(维生素c)粉末，研磨粉碎。

(2)向粉碎的样品中加入800μlctab提取液(2w/v％ctab，1.4mmnacl，100mmtris-hclph8.0，20mmedtaph8.0，1w/v％pvp-40，0.2v/v％β-巯基乙醇)，震荡混匀后放入65℃的水浴锅水浴30min，其间震荡3-5次。

(3)将样品取出水浴锅，加入700μl氯仿异戊醇(体积比24:1)，颠倒混匀，12000rpm离心5min，取上清液转移至新的离心管中。重复此步骤，直至上清液透明。

(4)在上清液中加入0.7倍体积的预冷的异丙醇，颠倒混匀，并将混匀后的样品放入-20℃冰箱冷藏30min。取出试管，12000rpm离心5min，将dna沉淀在样品管底部，倒掉所有液体。

(5)此时管底的沉淀即为dna，然后使用75％的乙醇水溶液冲洗获得的沉淀；再次12000rpm离心5min回收沉淀，弃掉液体；再将样品管晾干(或者通风橱吹干)，使残留酒精挥发。

供试白皮松种质资源的基因组dna的质量和浓度均须满足pcr要求，达标标准为：琼脂糖电泳显示dna条带单一，没有明显弥散；紫外分光光度计nanodrop2000(thermo)检测a260/a280比值在1.8左右，a260/a230比值大于1.8；供试白皮松种质资源的基因组dna的浓度在30-50ng/μl。

2、分别以137个供试白皮松种质资源的基因组dna为模板，分别采用36个引物组进行竞争性等位基因特异性pcr扩增，得到pcr扩增产物。各个pcr反应体系中，第一上游引物、第二上游引物、下游引物的浓度比为2:2:5。

该反应体系中的试剂、耗材和仪器均由lgc公司提供，包括试剂用量、用法、以及整个实验步骤按照lgc公司的操作指南kaspuserguideandmanual(www.lgcgenomics.com)进行，kaspar反应在384孔板(partno.kbs-0750-001)或96孔板(partno.kbs-0751-001)中进行，反应体系为3ul或1ul，如下表4所示。

表4：384孔板或96孔板的kasp反应体系

*由lgc公司提供或其它具有as-pcr检测能力的试剂盒

反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touchdown程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环；终延伸：72℃10min。形成的扩增产物电泳前于4℃保存。

3、荧光信号检测：完成步骤2后，待pcr扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的fam、hex光束扫描读取荧光值(fam荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，hex荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，根据荧光信号颜色判断137个供试白皮松种质资源的基于每个snp位点的基因型。

具体的判断原则如下：

如果某供试白皮松种质资源的基于某snp位点显示蓝色荧光信号，则该供试白皮松种质资源的基于该snp位点的基因型为“扩增该snp位点的第一上游引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；

如果某供试白皮松种质资源的基于某snp位点显示红色荧光信号，则该供试白皮松种质资源的基于该snp位点的基因型为“扩增该snp位点的第二上游引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；

如果某供试白皮松种质资源的基于某snp位点显示绿色荧光信号，则该供试白皮松种质资源的基于该snp位点的基因型为杂合型，一个碱基为“扩增该snp位点的第一上游引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”，另一个碱基“扩增该snp位点的第二上游引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”。

上述137个供试白皮松种质资源中，每个种质资源在上述36个snp位点中每个位点的基因型，即构成了基于上述36个核心snp标记的白皮松种质资源dna指纹数据库，该数据库可以用于鉴定某种未知的白皮松种质资源是否属于上述137个供试种质资源，或具体属于上述137个供试种质资源中的哪一种。

需要说明的是，若pcr扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环)，直至结果满意为止。

部分结果见图2。结果表明，各个引物组在供试白皮松种质资源的中可以得到很好的分型效果。如图所示，每个snp位点在137个供试白皮松种质资源(137个样本)的pcr扩增产物的荧光信号清晰地呈现为3种形式：1)聚合在接近x轴的样本显示为蓝色，基因型为连接hex荧光标签序列的等位基因型；2)聚合在接近y轴的样本显示为红色，基因型为连接fam荧光标签序列的等位基因型；3)x轴和y轴的样本显示为绿色，基因型为两种等位基因的杂合型。还有很少样本无荧光信号或无法判定，显示为粉色，可能由于dna质量不好或浓度过低，扩增产物没有被明确分型。由此可见，各个引物的扩增效果很好，均可以将137个供试白皮松种质资源的基因型作出明显的区分。

4、聚类分析

根据137个供试白皮松种质资源的基于36个snp位点的基因型，利用mega7软件对137个供试白皮松种质资源的进行聚类分析。

建立在36个引物组上的137个供试白皮松种质资源的聚类图如图3所示。结果表明，36个引物组可以完全区分表中的137个供试白皮松种质资源。由此可见，实施例1开发的snp引物组合可以应用于白皮松种质资源dna指纹数据库构建和种质资源资源鉴定。

5、效率评价

种质资源资源鉴定可以采用序贯分析方式减少工作量。本发明的发明人比较了snp标记个数(即引物组数)与区分137个供试白皮松种质资源区分率的关系。

实验结果表明(图4)，以至少2个snp位点不同为种质资源资源鉴定阈值，其中18个snp标记可以完全鉴定137个白皮松种质资源，鉴定能力达100％，同时，另18个snp标记作为扩展位点，以期鉴定更多的白皮松种质。

实施例3

本实施例是检测待测白皮松种质资源是否属于137个供试白皮松种质资源中的种质资源的方法，该待测白皮松的种质资源未知，需要经过本实施例的检测方法得到该待测白皮松的种质资源是否是这137个种质资源之一。本实施例的待测白皮松种质资源实际为京系20号，不属于上述137个白皮松种质资源；在已知待测白皮松种质资源的情况下，利用本发明的方法验证该待测白皮松种质资源是否属于上述137个中的一种。如果验证结果和实际相符，那么就证明本发明的方法能够用于检测未知的白皮松种质资源是否为上述137个之一。本实施例的检测方法包括：

1、待测白皮松种质资源的基因组dna的获得

待测白皮松种质资源——京系20号的叶片取自针叶。

按照实施例2中的步骤1的方法，将“供试白皮松种质资源的叶片”替换为“待测白皮松种质资源的叶片”，其它步骤均不变，得到待测白皮松种质资源的基因组dna。

2、snp引物及pcr反应体系的配置

按照实施例2中的步骤2的方法，将“供试白皮松种质资源的基因组dna”替换为“待测白皮松种质资源的基因组dna”，其它步骤均不变，进行竞争性等位基因特异性pcr反应，得到待测白皮松种质资源的pcr产物。

3、荧光信号检测

取待测白皮松种质资源的pcr产物，按根据荧光信号颜色判断待测白皮松种质资源的基于上述48个snp位点中每个位点的基因型，具体的判断原则如实施例2步骤3所述，将“供试白皮松种质资源”替换为“待测白皮松种质资源”。

4、待测白皮松种质资源的具体种质资源判定

将待测白皮松种质资源的36个snp位点的基因型与实施例2中的由137个供试白皮松种质资源构成的白皮松种质资源dna指纹数据库进行比对，统计待测白皮松种质资源和各个供试白皮松种质资源的差异位点数，然后进行如下判断：

如果待测白皮松种质资源与某标准白皮松种质资源(供试白皮松种质资源)的差异位点数为2个以上，则待测白皮松种质资源和该标准白皮松种质资源判定为不同的白皮松种质资源；差异位点数越多，遗传亲缘关系越远。

如果待测白皮松种质资源与某标准白皮松种质资源(供试白皮松种质资源)的差异位点数为0-2，则待测白皮松种质资源和该标准白皮松种质资源判定为相似的白皮松种质资源。

结果表明，待测白皮松种质资源在36个snp位点上与137个供试白皮松种质资源的差异位点数均为6个以上，因此，待测白皮松种质资源不属于137个供试白皮松种质资源中的任何一个种质资源，即待测白皮松种质资源并不是上述137个供试白皮松种质资源之一。该结果与实际相符，该待测白皮松种质资源为京系1号，并不是上述137个供试白皮松种质资源之一。

最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110>中国林业科学研究院林业研究所

<120>一种鉴定白皮松种质资源的snp位点引物组合及应用

<130>c1cncn200904

<141>2020-07-30

<150>202010757560.7

<151>2020-07-31

<160>144

<170>siposequencelisting1.0

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