一种固定化微生物制剂及其对石油污染土壤修复的方法与流程

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种固定化微生物制剂及其对石油污染土壤修复的方法。

背景技术：

当今社会，随着石油需求量的不断提高，石油行业的不断发展，其中土壤石油污染成为当今倍受关注的问题。所述石油主要是由正烷烃、环烷烃、支链烷烃和杂原子化合物等组成的复杂混合物。在油田开采、和贮藏、加工等过程中造成的石油污染现象尤为突出。目前油田的高含水开采方式使油田外排水增加，其中含有的难降解、脂溶性等有机污染物对作业区土壤造成严重污染。落地原油和含油污水是开采过程中的主要污染物，通过横向扩散和纵向迁移对土壤造成污染，破坏土壤原有的营养结构，致使土壤板结和盐碱化，孔隙度、通气性和持水能力降低，影响微生物的生存和植物生长。石油烃及其衍生物在环境中经过挥发、扩散、氧化和微生物降解等过程，其组成及含量发生变化。

用土著微生物的降解作用去除土壤中石油烃类污染物是石油污染土壤修复的方式之一，通过微生物的新陈代谢作用对石油烃进行降解，使其转化为二氧化碳和水。正常条件下，自然土壤中微生物数量很大，而石油烃降解菌数量则较少，一旦土壤环境受到污染，土壤中具有石油烃降解功能的微生物进行繁殖且数量逐步增加，而非石油烃降解菌数量急剧减少。

根据土壤的污染程度，可通过投加高效石油烃优势降解菌或刺激土壤中的土著微生物增长的方式降解土壤中的石油烃。土壤中石油烃含量较低时，通过生物刺激的方式可强化土著菌的优势，达到降解石油烃的目的。当土壤中石油烃含量较高时，土著微生物的降解作用受到抑制，降解过程缓慢，需要添加优势降解菌加快石油烃的利用效率。通过载体的固定化作用，使加入土壤中的降解菌抗逆性增强，经过生长和繁殖使其数量增加，进而提高石油烃的降解效率。

现有土壤修复产品设计较为单一，缺乏菌种和基质之间共生协同作用，不利于微生物生长繁殖，从而不利于石油烃的降解。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种固定化微生物制剂，以解决上述的技术问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种固定化微生物制剂，其中，所述步骤为：

a、菌株来源

a1、菌株均为实验室筛选菌株，包括假单胞菌属、青霉属、曲霉属及芽孢杆菌属；

b、载体制备：

b1：以玉米秸秆为原材料，在500℃缺氧条件下裂解3h，即得生物炭，以生物炭为载体；

c、培养基制备：

c1、牛肉膏蛋白胨平板培养基制备：牛肉膏3g、蛋白胨10g、nacl5g、琼脂20g、水1l，ph为7.0-7.2。；

c2、高氏1号平板培养基制备：kno31g、k2hpo40.5g、mgso4·7h2o0.5g、nacl0.5g、feso4·7h2o0.01g、20g、琼脂20g，ph为7.2-7.4；

c3、pda培养基制备：新鲜去皮马铃薯200g，切成小块，加水煮沸20-30分钟，将固体中的液体挤出，并加入葡萄糖20g，琼脂15g，然后用水定容至1l；

c4、bhb培养基制备：0.2g/l的mgso4·7h2o，0.02g/l的cacl2，1.0g/l的kno3，1.0g/l的k2hpo4·3h2o和0.02g/l的fecl3；

d、菌株培养：

d1、对培养基进行镜检，分别按照假单胞菌属、青霉属、曲霉属及芽孢杆菌属的培养基进行种子液的培养；

d2、发酵培养24h-36h，发酵结束后，即得到纯种发酵液；

e、固定化微生物制剂制备：

e1、假单胞菌属、青霉属、曲霉属、芽孢杆菌属按1：1：1：1的比例进行配比，并加入混合培养基中进行充分混合，使混合液的终浓度为1x108cfu/ml；

e2、以生物炭为载体将上述菌悬液和载体按照体积质量比15:1的比例混合，置于30℃恒温振荡器中，培养3天；

e3、配置2.5％的氯化钙溶液，加入到上述混合液中，钙化12h，即得到固定化微生物制剂。

优选的，所述高氏1号平板培养基中加入重铬酸钾溶液，以抑制细菌、霉菌生长，每100ml的高氏1号平板培养基中加入3％的重铬酸钾溶液。

优选的，所述bhb培养基染料为碘硝基四唑紫，称取碘硝基四唑紫3g，并用灭菌纯水定容至1l。

优选的，所述d2中发酵培养条件为35℃，ph为6-8。

优选的，所述细菌浓度检测均通过稀释涂布的方法进行检测。

一种固定化微生物制剂对石油污染土壤修复的方法，其总，包括以下操作：

f1、向石油污染土壤中按1％的比例添加固定化微生物制剂，并放入30℃培养箱内进行培养；

f2、控制土壤混合物c/n/p比为100/15/2，定期搅拌并保持土壤混合物湿度为60％，处理60天。

优选的，所述f2中，可通过nh4no3和k2hpo的投加，对土壤混合物c/n/p比进行控制。

优选的，所述石油污染土壤样品来自于受石油污染的土壤，其中总石油烃含量为8.5g/kg，石油污染土壤经过晾干，并过4mm筛筛分。

本发明的技术效果和优点：该固定化微生物制剂及其对石油污染土壤修复的方法，能够通过高活性固定化微生物制剂，将有机物与微生物紧密结合修复石油烃污染土壤，能够大大提高土壤中微生物数量，提高微生物对土壤中碳的利用，促进烃类物质降解。

附图说明

图1为本发明土壤修复后生物数量整体上升趋势图；

图2为本发明土壤修复过程中饱和烃降解率增幅趋势图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图1-2，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种固定化微生物制剂，其中，所述步骤为：

a、菌株来源

a1、菌株均为实验室筛选菌株，菌株对石油烃均具有较好的降解效果，菌株包含假单胞菌属、青霉属、曲霉属及芽孢杆菌属。

b、载体制备：

b1：以玉米秸秆为原材料，在500℃缺氧条件下裂解3h，即得生物炭，以生物炭为载体。

c、培养基制备：

c1、牛肉膏蛋白胨平板培养基制备：牛肉膏3g、蛋白胨10g、nacl5g、琼脂20g、水1l，ph为7.0-7.2。；

c2、高氏1号平板培养基制备：kno31g、k2hpo40.5g、mgso4·7h2o0.5g、nacl0.5g、feso4·7h2o0.01g、20g、琼脂20g，ph为7.2-7.4，加入重铬酸钾溶液，以抑制细菌、霉菌生长，每100ml的高氏1号平板培养基中加入3％的重铬酸钾溶液。

c3、pda培养基制备：新鲜去皮马铃薯200g，切成小块，加水煮沸20-30分钟，将固体中的液体挤出，并加入葡萄糖20g，琼脂15g，然后用水定容至1l；

c4、bhb培养基制备：0.2g/l的mgso4·7h2o，0.02g/l的cacl2，1.0g/l的kno3，1.0g/l的k2hpo4·3h2o和0.02g/l的fecl3，染料为碘硝基四唑紫，称取碘硝基四唑紫3g，并用灭菌纯水定容至1l。

d、菌株培养：

d1、对培养基进行镜检，分别按照假单胞菌属、青霉属、曲霉属及芽孢杆菌属的培养基进行种子液的培养；

d2、发酵培养24h-36h，发酵结束后，即得到纯种发酵液。

e、固定化微生物制剂制备：

e1、假单胞菌属、青霉属、曲霉属、芽孢杆菌属按1：1：1：1的比例进行配比，并加入混合培养基中进行充分混合，使混合液的终浓度为1x108cfu/ml，混合培养基由牛肉膏蛋白胨平板培养基、高氏1号平板培养基、pda培养基及bhb培养基均匀混合而成；

e2、以生物炭为载体将上述菌悬液和载体按照体积质量比15:1的比例混合，置于30℃恒温振荡器中，培养3天；

e3、配置2.5％的氯化钙溶液，加入到上述混合液中，钙化12h，即得到固定化微生物制剂。

具体的，所述d2中发酵培养条件为35℃，ph为6-8。

具体的，所述细菌浓度检测均通过稀释涂布的方法进行检测。

一种固定化微生物制剂对石油污染土壤修复的方法，其中，包括以下操作：

f1、向石油污染土壤中按1％的比例添加固定化微生物制剂，并放入30℃培养箱内进行培养；

f2、控制土壤混合物c/n/p比为100/15/2，定期搅拌并保持土壤混合物湿度为60％，处理60天。

具体的，所述f2中，可通过nh4no3和k2hpo的投加，对土壤混合物c/n/p比进行控制。

具体的，所述石油污染土壤样品来自于受石油污染的土壤，其中总石油烃含量为8.5g/kg，石油污染土壤经过晾干，并过4mm筛筛分。

实施例：

固定化微生物制剂对石油烃污染物的降解应用，在实施过程中设计a、b、c、d，4个不同处理组。

a为对照处理组，石油污染土壤中未添加任何其他物质。

b为石油烃降解菌添加处理组，对照仅在加入石油烃降解菌条件下其对土壤中石油烃的降解情况，添加剂量为土壤质量1％等量的混合菌株，混合菌株由假单胞菌属、青霉属、曲霉属、芽孢杆菌属按1：1：1：1的比例进行配比而成。

c固定化微生物制剂处理组，固定化微生物制剂添加比例为土壤质量的1％。

d为固定化微生物制剂与营养剂组合处理组，固定化微生物制剂添加比例为土壤质量的1％，营养剂为nh4no3和k2hpo4，并控制土壤混合物c/n/p比为100/15/2。

将a、b、c、d，4个不同处理组分别装入培养容器中，并放入30℃培养箱内进行培养，定期搅拌并保持土壤混合物湿度为60％，处理60天，并每隔10天测定石油烃物质的变化情况，每10天测定土壤中石油烃降解菌、烷烃降解菌和多环芳烃降解菌数量的变化。

在修复结束后测定土壤容重、土壤孔隙度、含水率、ph、toc、总氮、总磷和土壤细菌、真菌和放线菌数量。

对土壤中微生物的测试：称取待测土壤10g，放入装有90ml无菌水并放有玻璃珠的三角瓶中，震荡10min制成土壤悬液，为10-1稀释液，再用移液枪吸取10-1稀释液1ml于装有9ml无菌水的试管中，为10-2稀释液，依此类推，连续制成10-3，10-4，10-5，10-6和10-7菌悬液。移液枪取不同稀释度菌悬液0.5ml，细菌用10-4-10-7稀释度、放线菌用10-3-10-6稀释度，真菌用10-2-10-5稀释度，对号放入无菌培养皿中，细菌、放线菌、真菌的活菌计数培养基分别为牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、改良高氏1号琼脂培养基、pda培养基。将准备好的15ml的培养基倒入培养皿中，依次吸取100μl的菌悬液进行涂布，48h后取出培养皿，计算同一稀释度三个平板的菌落平均数。

对石油降解菌数量的测定：称取待测土壤1g，加入9ml无菌水，摇匀，在30℃、130r/min条件下震荡60min，为10-1稀释液，依次稀释到10-2-10-9稀释液。以石油烃溶液为底物测定石油烃降解菌数量，以正十六烷溶液为底物测定烷烃降解菌数量。在96孔板中分别加入180μl的mpn液体培养基及碳源，每个稀释度进行5个重复处理，分别取20μl相同稀释度的土壤溶液放入对应编号小孔中，室温培养2周后进行显色反应，24h后计数，表现红色呈阳性反应。

通过a、b、c、d，4个不同处理组，不同的处理方式对石油污染土壤进行修复研究，依据图1数据可见修复后各处理组生物数量整体表现上升趋势，其中细菌数量增幅最大，而真菌、放线菌数量增长幅度相对较小。

修复后b、c、d处理组比对照组a细菌数量增长20％-70％，同时可见d处理组，通过固定化微生物制剂与营养剂组合，d处理组在修复后，其整体细菌数量最多，为3×108cfu·g-1。

通过a、b、c、d，4个不同处理组，不同处理方式的实验结果可以得知，单一添加石油烃降解菌处理组修复后土壤微生物菌群数量增幅较小，以玉米秸秆生物炭为载体固定化微生物后，其微生物种群总数呈显著性增长，说明以该生物炭为载体的基质更有利微生物的生存，在固定化微生物制剂的基础上，补充营养剂可以显著提高土壤中微生物数量，从而表明补充营养剂能促进微生物在石油污染土壤中的繁殖和生长，

从图2可见，a、b、c、d，4个不同处理组，不同处理组饱和烃降解率随烷烃降解菌数量增加而上升，其中a和b处理组饱和烃降解率增幅较小，c和d处理组饱和烃降解率增幅相对较大。

与对照组a相比，c和d处理组烷烃降解菌数量变化程度较大，当烷烃降解菌对数值大于6后，饱和烃降解率随菌数增加呈显著上升趋势。

修复后d处理组的烷烃降解菌数量高于c，说明营养剂的添加更有利于石油烃降解菌的生存，提高微生物对土壤中碳的利用，促进烃类物质降解。

固定化微生物制剂的工程应用：

固定化微生物制剂应用于受石油污染的土壤中，收受污染土壤面积15平方米，其中总石油烃含量为9.5g/kg。

结果如下所示：

固定化微生物制剂对石油烃降解的效果(g/kg)

对照组(不添加固定化微生物制剂)：

由上表可以得出结论，在投加固定化微生物制剂后，在第75天时，石油烃去除率已经达到69.5％，而对照组未出现显著降低。由此可见固定化微生物制剂在对石油烃的去除上，效果尤为显著。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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