MiR-29海绵、包含miR-29海绵的核酸构建体及其应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抑制mir-29的mir-29海绵、包含该mir-29海绵的核酸构建体及其在制备用于治疗或预防1型糖尿病的药物中的应用。

背景技术：

糖尿病(diabetesmellitus，dm)已成为现代社会严重影响人类健康的常见病和多发病。根据idf最新报告，截止到2019年全球约4.63亿20-79岁成人患糖尿病。虽然2型糖尿病占到90-95％，但是1型糖尿病的患病率也以2％～5％的速度增长，其中以15岁以下的儿童和青少年的发病率增长速率最快。1型糖尿病的发病率虽然没有2型糖尿病高，但是起病迅速，趋于年轻化，以及引起严重的并发症如酮症酸中毒、低血糖等。所以围绕糖尿病展开的相关的预防、诊断、治疗是世界各国医药领域研发攻关的重大方向。

1型糖尿病(t1dm)是一种免疫系统介导胰岛β细胞破坏的自身免疫性疾病。其特征是血糖水平增加(高血糖症),这是由于β细胞受损导致的胰岛素分泌不足所造成的。目前t1dm的发病原因普遍认为是遗传、环境、免疫等因素共同作用引发了胰岛β细胞为主体的自身免疫损害反应。其中淋巴细胞比如cd4⁺、cd8⁺t淋巴细胞和b淋巴细胞对胰岛β细胞的浸润及其分泌的细胞因子在1型糖尿病的发病过程中发挥着重要作用。此外，在1型糖尿病的发病过程中调节性t细胞(treg)、巨噬细胞(dc)、nk细胞等参与也导致了分泌胰岛素的β细胞的损伤。多数患者在临床诊断为1型糖尿病时仅剩下不到30％的残存胰岛β细胞,胰岛素分泌严重不足，患者体内难以被利用的葡萄糖一直存在于血液循环中，随着时间的推移，血液中高浓度的葡萄糖造成身体中多组织损伤，并可引发心脏、肾脏、肝脏、神经、眼部和其他重要器官的病变(也称糖尿病并发症)。

目前，t1dm的传统治疗仍然是胰岛素注射，但是长期的使用并不能满足代谢的需求，并且会导致多种并发症，例如低血糖，视网膜病，心血管疾病等。除此之外胰岛/胰腺移植也由于自身免疫排斥的存在，以及有限的可供使用的供体，导致这种治疗方法不能从根本上解决问题。干细胞疗法能够从细胞和基因水平治疗糖尿病，但是大多处于研究试验阶段，并且对病人存在个体差异和应用局限性。因此，寻找一种有效抑制胰岛β细胞受损，达到治疗t1d的新方法至关重要。

表观遗传学参与1型糖尿病的发生发展过程，包括dna甲基化、翻译后组蛋白修饰和micrornas(mirnas)，它们是基因表达的重要调节因子，从而促进了机体对环境因素的生理或病理反应。目前已经发现2500多种人类mirnas，并且每一种的mirna又能调控成百上千基因的表达。mirna的异常表达可以导致胰岛素合成、分泌异常，或产生胰岛素抵抗，还可以影响t、b淋巴细胞的增殖、分化过程，影响免疫细胞信号转导，进而导致糖尿病的发生。许多研究结果显示，mirna在1型糖尿病发病及病程中都有所改变，可能成为治疗或者预测的潜在标志物。

其中mir-29是小鼠胰岛β细胞中表达最丰富的micrornas之一，由三个密切相关的前体组成：mir-29a、mir-29b和mir-29c。mir-29家族在糖尿病患者肝脏、骨骼肌和脂肪组织中的表达水平增强，与纤维化、糖尿病、恶性肿瘤等多种疾病的发生、发展相关。在病理情况下，研究发现1型糖尿病的儿童血清以及nod小鼠中mir-29表达是明显增加的。此外，在min6细胞系、小鼠及人的原代胰岛中，使用炎症因子处理后，mir-29的表达量明显增加的。大量数据显示，mir-29与1型糖尿病发生的关系密切，参与了1型糖尿病的发生发展过程。

非肥胖型糖尿病(non-obesediabetic，nod)小鼠是一种广泛用于1型糖尿病研究的啮齿类动物模型，其出现自发性糖尿病的临床特征、病理形态学和免疫学的表现与人类1型糖尿病极为相似。该品系小鼠通常于4～5周龄开始出现胰腺炎，进行性破坏胰岛β细胞，于12周龄时出现明显的糖尿病症状，至30周龄时雌性小鼠累计发病率可达到80％，而雄性小鼠则不到20％。因此，该发明以8-9周龄的雌性nod鼠为研究对象，便于更好的了解mir-29以及mir-29sponge在1型糖尿病发病的预防作用。

mirna海绵(mirnasponge)是麻省理工大学的phillipsharp及他的同事开发出一种长期抑制mirna基因的高效方法。mirna海绵是一条mrna，其3’非翻译区(utr)包含若干个mirna靶定位点。更重要的是，这些靶定位点在risc切割位点有一些错配。这样抑制剂mrna就不会被降解，而与risc稳定结合，让它远离天然的mrna靶点。

技术实现要素：

发明目的：本发明提供了一种mir-29海绵，并进一步提供了包含该mir-29海绵的mir-29核酸构建体。该mir-29海绵可吸附体内mir-29a-3p和mir-29b-3p并封闭其功能。

具体地，本发明提供了一种抑制mir-29的mir-29海绵，其核苷酸序列如seqno.1所示，具体为：

taaccgatttcagatggtgctatatactaaccgatttcagatggtgctaacatcaacactgatttcaaatggtgctatcttcaaacactgatttcaaatggtgctatttttt。

本发明进一步提出了上述mir-29海绵在制备用于预防和/或治疗1型糖尿病的药物中的应用。研究结果表明，mir-29海绵可以抑制体内mir-29的表达。

本发明进一步提出了一种mir-29核酸构建体，包含表达载体和与所述表达载体有效连接的mir-29海绵。所述“有效连接”是指本发明的mir-29海绵与表达载体的连接使所产生的核酸构建体能在细胞或动物体内转录本发明的mir-29海绵。

优选地，所述表达载体为慢病毒表达质粒，优选地，选用慢病毒表达质粒phblv-u6-mcs-cmv-zsgreen。

mir-29核酸构建体可以通过在mir-29海绵序列的两端加上与表达载体相配的酶切位点，合成正向序列和反向序列，以与该表达载体有效连接。

在一种实施方式中，可以通过如下方法制备mir-29核酸构建体(亦称为mir-29海绵慢病毒)：

1)选用慢病毒载体phblv-u6-mcs-cmv-zsgreen；感受态细胞选用大肠杆菌菌株dh5α；抗性:amp；

2)针对目的基因合成mir-29海绵，然后构建慢病毒表达载体，大量扩增慢病毒载体；在293t细胞内进行慢病毒载体的大量包装，进行慢病毒的浓缩及纯化，最后对慢病毒滴度测定(10^9tu/ml)。

上述构建方法也可以直接委托商业性合成公司完成。

本发明进一步提出了上述mir-29核酸构建体在制备用于预防和/或治疗1型糖尿病的药物中的应用。

本发明提出的mir-29sponge通过吸附体内mir-29a-3p和mir-29b-3p阻断其功能，抑制促炎细胞因子的分泌，进而缓解nod鼠胰岛炎的发生，提高血清胰岛素水平，维持血糖趋于正常水平，最终显著降低nod鼠1型糖尿病的发病，提高nod鼠的存活率。

附图说明

图1显示的是对8-9周的糖尿病前期nod小鼠通过尾静脉注射hblv-mmu-mir-29sponge或者hblv-mmu-gfpnc后，对其代谢表型进行监测；

图2显示hblv-mmu-mir-29sponge或者hblv-mmu-gfpnc尾静脉注射18周后，对小鼠的体重进行监测；

图3显示尾静脉注射hblv-mmu-mir-29sponge或者hblv-mmu-gfpnc18周后，统计小鼠的糖尿病发病率；

图4显示尾静脉注射hblv-mmu-mir-29sponge或者hblv-mmu-gfpnc18周后，检测小鼠随机血糖，以及血清中胰岛素水平；

图5显示尾静脉注射hblv-mmu-mir-29sponge或者hblv-mmu-gfpnc18周后，检测小鼠空腹血糖，以及血清中胰岛素和c肽水平；

图6a显示尾静脉注射hblv-mmu-mir-29sponge或者hblv-mmu-gfpnc18周后，小鼠isletsmass的统计结果；

图6b显示尾静脉注射hblv-mmu-mir-29sponge或者hblv-mmu-gfpnc18周后he染色的结果；

图7显示经上述处理nod小鼠后，胰岛素免疫染色的结果；

图8a显示经处理nod小鼠后，cba法检测小鼠血清中tnf-α，il-6,il-1β和mcp-1六个炎症因子在fl-2-h和fl-4-h通道上的含量分布；

图8b是两组血清中il-6，tnf-α，mcp-1浓度的统计结果；

图9显示经上述处理nod小鼠后，各组小鼠循环中单核细胞f4/80和mhcii细胞的数量；其中a图为流式细胞仪检测结果图，b图为对应的柱状统计图；

图10显示经上述处理nod小鼠后，经过流式检测后各组小鼠外周血、胰腺淋巴结、肠系膜淋巴结、脾脏中cd4+细胞的所占的比例。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。本发明中的mir-29核酸构建体委托商业性合成公司。

实施例1mir-29sponge对nod鼠1型糖尿病发病的影响。

实验动物：8-9周龄雌性nod小鼠及饲料，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号：scxk(京)2019-0008。动物随机分笼饲养，食水自由。

实验药品：hblv-mmu-mir-29sponge委托汉恒科技(上海)公司制备和纯化，阴性对照为hblv-mmu-gfpnc，购自汉恒科技公司，其中，hblv-mmu-mir-29sponge采用的慢病毒表达载体为phblv-u6-mcs-cmv-zsgreen；感受态细胞选用大肠杆菌菌株dh5α；抗性:amp。

实验步骤：

1)8-9周龄雌性nod小鼠进入南京医科大学实验动物中心，在清洁环境中饲养，温度(21±2)℃，湿度(35±2)％，12h:12h昼夜间断照明，自由进食饮水，饮用水为实验动物中心制备的蒸馏水；

2)经适应性饲养一周，随机分2组，每组10只，隔天尾静脉分别注射hblv-mmu-mir-29sponge(1*10^8tu/ml，100ul/只)、hblv-mmu-gfpnc(1*10^8tu/ml，100ul/只)；

3)每周测定血糖，持续18周的数据；测量方法为：取尾静脉血1滴，用血糖试纸及快速血糖仪测定随机血糖，以血糖浓度≥11.1mmol/l且持续一周以上诊断为糖尿病；

4)待小鼠药物处理18周后，小鼠摘眼球法，一部分取全血，4℃，3000×g离心15min，血清置-30℃保存备做指标测定；一部分取外周血，ep管加入肝素钠抗凝剂；

5)取步骤4)的血清10ul，用elisa试剂盒依说明书步骤分别检测血清中胰岛素和c肽的含量；

6)小鼠死后立即取出脾脏和胰腺淋巴结，肠系膜淋巴结，pbs清洗，待后续提取淋巴细胞；

7)小鼠死后立即取出胰腺，pbs清洗，用4％多聚甲醛液固定24h，80％乙醇保存；随后，经石蜡包埋、透明后切片，进行苏木素-伊红(h-e)染色以及免疫组化染色。

统计学分析：本实验所有数据均采用均值±标准差(±s)表示，组间差异性分析采用t检验，以p<0.05作为统计学差异参考标准。

实验结果：

1)如图1所示，8-9周的糖尿病前期nod小鼠通过尾静脉注射hblv-mmu-mir-29sponge(mir-29sponge组)或者hblv-mmu-gfpnc(gfp对照组)的代谢表型监测；

2)如图2所示，给药0-18周期间，通过监测小鼠体重，结果如图2所示，同mir-29sponge组相比，gfp组小鼠体重出现明显减轻的现象；(p*<0.05)

3)如图3所示，给药0-18周期后，统计小鼠的糖尿病患病率，经过计算，经过mir-29sponge处理的nod小鼠糖尿病的患病率明显低于gfp对照组；(p*<0.05)

4)如图4所示，给药0-18周期间，通过监测小鼠随机血糖(随机血糖≥11.1mmol/l且持续1周则认为发病)，经mir-29sponge病毒处理的nod小鼠中，随机血糖维持在正常水平；(p*<0.05)

5)如图5所示，给药0-18周期间，通过检测了两组nod小鼠的空腹血糖，发现经mir-29sponge处理的nod小鼠空腹血糖明显低于gfp对照组；(p*<0.05)

6)如图6所示，图a通过统计小鼠isletsmass发现，与gfp组相比mir-29sponge处理的nod小鼠的isletsmass明显增加，图b两组nod鼠胰腺组织he切片；(p*<0.05)

7)如图7所示，通过对了两组nod小鼠的胰腺切片进行免疫组化染色，发现gfp对照组胰岛炎程度极其严重，淋巴细胞几乎完全占据了整个胰岛；而mir-29sponge组的小鼠，胰岛炎性浸润程度明显减轻。

从以上实验结果可以看出，本发明所述mir-29sponge能够明显提高nod鼠血胰岛素水平、显著降低随机血糖水平、抑制小鼠胰岛炎的发生、明显延缓nod鼠的发病并提高了其存活率，mir-29sponge对于预防和/或治疗1型糖尿病的发生有很好的效果。

实施例2mir-29sponge对nod鼠血清中促炎和抑炎细胞因子水平的影响。

收集的血清样本，取50ul加入流式管中，加入cba试剂盒(美国bd公司)中炎症因子磁珠混合物50ul，室温孵育1小时，再加入50ulpe检测试剂盒(美国bd公司)混合物，室温孵育1小时。孵育结束后，加入1ml清洗液室温200g离心5min，弃上清后用300ul清洗液重悬，流式细胞仪上机检测。

结果见图8，发现同gfp对照组相比，mir-29sponge处理组可显著降低nod小鼠血清中炎性细胞因子tnf-α、il-6和mcp-1的水平。图atnf-α，il-6,il-1β和mcp-1六个炎症因子在fl-2-h和fl-4-h通道上的含量分布。图b，cba检测到的两组血清中il-6，tnf-α，mcp-1浓度的统计结果。(p*<0.05)这些结果提示，mir-29sponge可能通过调节机体免疫影响nod鼠糖尿病的发生。

实施例3mir-29sponge对nod鼠循环单核细胞的影响。

运用流式检测的方法分析实施例1小鼠循环中单核细胞的数量，比较gfp组和mir-29sponge实验组之间的差异。具体步骤如下：

将小鼠外周血80ul，加6250u/ml肝素钠20ul，充分混匀，37度静置1h，吸取血浆及白细胞层。血浆用于cba及其他检测，中间的白细胞层加3倍体积红细胞裂解液，室温5分钟，混匀，裂解后，pbs清洗后标记相应流式抗体f4/80，mhcii(均购自美国ebioscience公司)。室温避光孵育15min,pbs洗一遍后，弃上清。最后以300ulpbs重悬，制成单个核细胞悬液。取1×10⁶个细胞上流式细胞仪，进行细胞计数。

结果如图9所示，与gfp组相比，mir-29sponge组的小鼠中循环单核细胞的活化程度更低。图af4/80⁺和f4/80⁺mhc⁺示意图，图b统计学结果。(p*<0.05)

实施例4流式检测的方法分析两组nod小鼠的外周血、胰腺淋巴结、肠系膜淋巴结、脾脏中cd4⁺细胞所占的比例。

为了进一步分析mir-29sponge是否参与了适应性免疫。我们提取了nod鼠外周血、脾脏和胰腺淋巴结、肠系膜淋巴结中的淋巴细胞，运用流式检测的方法分析。

具体步骤如下：

1)将2组清洗干净的新鲜小鼠脾脏或淋巴结放在盛有rpmi-1640细胞培养液的平皿里，用玻璃匀浆器压磨脾脏或胰腺淋巴结，过滤后倒入刻度离心管中，加培养液至6ml；

2)室温下1500rpm/min，离心5min；

3)弃上清液，下层细胞加红细胞裂解液，振荡5min，使红细胞裂解破坏；

4)加含pbs至6ml，室温下1500rpm/min，离心5min；

5)弃上清液，再加rpmi-1640液洗涤，同上离心，共洗涤3次；

6)弃去洗涤液，台盼蓝检测细胞活力，调整细胞浓度至1×10⁶/ml；

7)向每管中加入荧光标记的抗小鼠cd4抗体，室温避光孵育30min；

8)用pbs重复洗涤2次，最后加入pbs至0.3ml，制成单个核细胞悬液。取1×10⁶个细胞上流式细胞仪，进行淋巴细胞计数。

结果如图10所示，与gfp处理小鼠相比，mir-29sponge小鼠外周血单核细胞(pmbc)和胰腺淋巴结(plns)中的cd4⁺细胞显著增加，而在肠系膜淋巴结(mlns)和脾脏组间没有明显差异，进一步提示适应性免疫参与。

综上所述，本发明所述的mir-29sponge通过抑制体内mir-29的表达，进一步抑制促炎细胞因子分泌，进而缓解nod鼠胰岛炎的发生，提高血清胰岛素水平，维持血糖趋于正常水平，最终显著降低nod鼠1型糖尿病的发病，提高nod鼠的存活率。

序列表

<110>南京医科大学

<120>mir-29海绵、包含mir-29的核酸构建体及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>112

<212>dna

<213>mir-29海绵(artificialsequence)

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gatttcaaatggtgctatcttcaaacactgatttcaaatggtgctatttttt112

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