一种利用水稻osa-miR5511基因提高水稻产量的方法与流程

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种利用水稻osa-mir5511基因提高水稻产量的方法。

背景技术：

水稻是地球上主要的粮食作物，养活了约一半的地球人口。近年来，世界人口逐年增加，环境却逐渐恶化，有效耕地面积也逐步减少。因此，如何提高水稻产量以保障世界粮食安全，成为世界各国政府部门和广大科研工作者关注的焦点问题之一。其中，利用基因工程手段以开展分子设计育种将是提高水稻产量、保障世界粮食安全问题的重要手段。

水稻单株产量的形成主要决定于有效穗数、每穗粒数、千粒重等性状，每穗粒数又由穗长、一次枝梗、二次枝梗、着粒密度等性状共同决定，而千粒重则直接取决于粒长、粒宽、粒厚和籽粒的灌浆程度等。通常认为，水稻产量形成相关性状往往属于多基因调控的数量性状，遗传基础复杂；除了结构蛋白和转录因子等的编码基因外，mirna等非编码rna基因在水稻产量形成中也具有十分重要的调控作用；因此，挖掘在水稻产量性状形成中具有重要作用的mirna基因，并解析其作用机理，也将是今后利用基因工程手段开展分子设计育种以培育高产水稻新品种的重要方面。

mirna是植物体内广泛存在的大小为20-24nt的内源性非编码rna，通过调控其靶基因的表达来调节植物个体的生长发育或对胁迫环境的适应能力。据报道，水稻基因组中至少有592个mirna前体，可以产生713个以上的成熟mirna[kozomaraandgriffiths-jones.mirbase:annotatinghighconfidencemicrornasusingdeepsequencingdata.nucleicacidsresearch,2014,42:d68-d73]。目前，已发现了一些与水稻产量性状发育调控有关的mirna。例如，mir156能通过调控理想株型ipa1/osspl14基因的表达，来影响水稻的分蘖数、粒数、千粒重、单株产量等性状的形成[jiaoetal.regulationofosspl14byosmir156definesidealplantarchitectureinrice.naturegenetics,2010,42:541-544.miuraetal.osspl14promotespaniclebranchingandhighergrainproductivityinrice.naturegenetics,2010,42:545-549]。过量表达osmir397能靶向调控oslac基因的表达水平，以促进水稻圆锥花序分枝，增加水稻籽粒大小，最终能提高水稻的单株产量[zhangetal.overexpressionofmicrornaosmir397improvesriceyieldbyincreasinggrainsizeandpromotingpaniclebranching.naturebiotechnology,2013,31:848-852]。mir159可通过调控其靶基因osgamybl1和osgamyb的表达水平，来影响水稻的籽粒大小等产量性状的发育[zhaoetal.suppressionofmicrorna159impactsmultipleagronomictraitsinrice(oryzasatival.).bmcplantbiology,2017,17:215]。然而，通过抑制osa-mir5511的表达以提高水稻产量目前尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种利用水稻osa-mir5511基因提高水稻产量的方法。该方法通过基因工程手段来抑制osa-mir5511基因的表达，首次发现osa-mir5511缺失表达能显著增加成熟期水稻的穗长、每穗粒数、粒重和单株产量。为培育高产水稻优良品种提供了一种新的分子育种方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种利用水稻osa-mir5511基因提高水稻产量的方法，所述方法为通过基因工程技术对水稻osa-mir5511基因进行敲除或抑制其表达，所述水稻osa-mir5511基因的成熟序列如seqidno.1所示，其发夹结构序列如seqidno.2所示。

本发明优先crispr基因编辑技术抑制或敲除水稻osa-mir5511基因的表达，包括以下步骤：

1)osa-mir5511的crispr敲除表达载体构建：利用crispr敲除靶点引物对、水稻u6a启动子和pylcrispr/cas9质粒，经酶切、连接、转化大肠杆菌感受态细胞、阳性菌落pcr检测与测序分析，获得osa-mir5511的crispr敲除表达载体；

2)osa-mir5511缺失表达高产水稻植株的获得：将上述构建osa-mir5511的crispr敲除表达载体，经ti质粒、植物病毒载体、显微注射、原生质体或dna直接转化水稻愈伤组织/细胞，再培养成转基因水稻植株，并利用pcr、测序分析、qrt-pcr、northern-blot方法鉴定获得osa-mir5511缺失表达的转基因水稻，经在大田种中与野生型水稻一起种植，于成熟期进行考种比较分析，确定获得osa-mir5511缺失表达的高产水稻植株。

本发明提供一种水稻osa-mir5511基因在提高水稻产量中的应用，抑制水稻osa-mir5511基因的表达，用于选育水稻产量提高的水稻品种。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

发明首次提供一种利用osa-mir5511基因来提高水稻产量的方法，本方法通过抑制osa-mir5511基因的表达来提高水稻产量，为培养高产水稻优良品种提供了一种新的分子育种途径，具有广阔的应用前景。本发明可显著增加水稻植株的穗长、每穗粒数、粒重和单株产量。

附图说明

图1为pylcrispr/cas9质粒结构示意图。其中，p35s为花椰菜花叶病毒的35s启动子；pubi为玉米泛素蛋白基因启动子；ccdb为ccdb致死基因，经bsai酶切后被sgrna表达盒替换，以完成敲除载体构建；tnos为终止子；rb为右边界；lb为左边界；kan^r为卡那霉素抗性基因；hpt为潮霉素抗性基因；pbr322ori为pbr322的复制起始位点；cas9p为cas9蛋白基因；sp-l1和sp-r为菌落pcr引物对和测序引物。

图2为osa-mir5511的crispr敲除缺失表达突变体分子鉴定。a：osa-mir5511的茎环、成熟(红色字)和靶点(黄色底)序列；b：靶点突变类型的测序分析；c：northern-blot杂交检测成熟osa-mir5511的表达。nip：日本晴(野生型)；cr：osa-mir5511的crispr敲除缺失表达突变体mir5511。u6为northern-blot杂交的内参基因。

图3为osa-mir5511缺失表达导致水稻的穗子变大。a：成熟期的穗子整体表型；b：成熟期的穗长；c：成熟期的每穗总粒数；d：成熟期的千粒重；e：成熟期的单株产量。nip：日本晴；cr：osa-mir5511缺失表达突变体mir5511。**：p<0.01水平的极显著差异。

具体实施方式

以下实施例中所用实验方法如无特别说明均为常规的实验方法。本发明中，引物合成或dna序列测定均由上海生物工程技术有限公司完成。

实施例1：osa-mir5511的crispr敲除载体构建与水稻遗传转化

在mirbase数据库(http://www.mirbase.org/)中获得水稻osa-mir5511的成熟序列seqidno.1及其发夹结构序列seqidno.2，进而利用在线软件crispr-p2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/crispr2/)设计获得osa-mir5511的crispr敲除靶点引物对seqidno.3：gccgcatgcatatcccagctgttt(下划线为bsai酶切位点)和seqidno.4：aaacaaacagctgggatatgcatg(下划线为bsai酶切位点)；随后，经变性退火与水稻u6启动子连接成sgrna表达盒，再经酶切、连接到pylcrispr/cas9质粒中，获得mir5511的crispr敲除载体，进而参考前人的方法[hieietal,efficienttransformationofrice(oryzasatival.)mediatedbyagrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesofthet-dna.plantj,1994,6(2):271-282]，利用农杆菌介导法转化粳稻日本晴(nip)，大致过程为愈伤组织诱导、愈伤组织继代培养、预培养、共培养、抗性愈伤筛选、预分化、分化、生根培养、炼苗、移栽等，共获得24株遗传转化水稻植株，基于ctab法提取其基因组dna，并利用潮霉素基因特异引物进行pcr鉴定，确定获得的全部为转基因阳性水稻植株，潮霉素基因扩增的特异引物对序列如下：

hpt-f：5’-ctgaactcaccgcgacgtctgtc-3'(seqidno.5)；

hpt-r：5’-tagcgcgtctgctgctccataca-3’(seqidno.6)；

pcr扩增条件为：94℃4min；[94℃30sec，62℃30sec，72℃50sec]，32个循环；72℃7min。

实施例2：osa-mir5511的crispr敲除缺失表达突变体(mir5511)鉴定

根据osa-mir5511的crispr敲除靶点序列信息(图2a)，在其对应的水稻基因组上设计一对特异引物(seqidno.7和seqidno.8)，以野生型(日本晴)和上述提取的24份水稻基因组dna为模板，扩增获得包含该敲除靶点序列的单一目的基因组dna片段，进行测序分析，确定获得发生了敲除突变的t0转基因植株，并在其分离后代苗期进一步进行潮霉素基因阳性检测和靶位点的测序分析，获得了不含t-dna插入的osa-mir5511敲除突变体。其中一个在成熟osa-mir5511序列中插入了1个a碱基的无外源t-dna的敲除纯合突变体(cr)(图2b)，经northern-blot杂交实验证实，成熟osa-mir5511在该cr突变体中是缺失表达的(图2c)。northern-blot杂交探针序列为seqidno.9(ggccaaacagctgggatatg)，其中5’端的核苷酸加dig修饰，3’端的3个核苷酸进行lna锁定。

实施例3：osa-mir5511缺失表达显著提高水稻单株产量

随后，将野生型日本晴(nip)和osa-mir5511缺失表达突变体(cr)同时种植于大田中，于成熟期发现：osa-mir5511缺失表达突变体cr的穗子明显比野生型nip的大一些(图3a)。于是，在nip和cr中各选择了具有代表性的5个单株为样本，对每个单株的有效分蘖进行了每穗粒数、穗子长度、千粒重和单株产量进行考查。结果(图3b-e)表明：与nip相比，cr的穗长显著增长7.2cm，每穗粒数显著增多23.7粒，千粒重显著增加3.0克，单株产量显著提高3.6克，单株产量增产约为24.2％。

序列表

<110>南昌大学

<120>一种利用水稻osa-mir5511基因提高水稻产量的方法

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>rna

<213>水稻(oryzasativa)

<400>1

cauaucccagcuguuucggcc21

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<211>128

<212>rna

<213>水稻(oryzasativa)

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uugguggaagaaggccaaguguuugggauguuggaaauaacuuccuagcuggcuggccua60

agaaauuuucauagacaaagagccguuucaaaccaugcauaucccagcuguuucggccuu120

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<213>人工序列(artificialsequence)

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