呼吸道合胞病毒全长融合前融合糖蛋白核苷酸序列、重组腺病毒载体及其应用产品的制作方法

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种呼吸道合胞病毒全长融合前融合糖蛋白核苷酸序列、重组腺病毒载体及其应用产品。

背景技术：

人呼吸道合胞病毒(humanrespiratorysyncytialvirus，rsv)是引起婴幼儿下呼吸道感染的重要病毒病原，同时也是引起免疫缺陷患者和老年人等高危人群住院治疗及死亡的重要病毒病原。从婴幼儿感染情况看，1岁时有70％的婴幼儿感染过rsv，2岁时已全部感染过至少1次。从儿童感染rsv后的死亡情况看，在1月至1岁的儿童死亡原因中，rsv感染引起的死亡人数约占总数的6.7％，紧随疟疾位列第二位，5岁以下儿童因下呼吸道感染引起死亡的病因中，rsv感染引起的死亡人数约占总数的6.29％，紧随肺炎球菌排列第二位，在病毒病原中位列第一位。在我国，rsv是引起儿童流行性喘憋性肺炎(简称流喘肺炎)及儿童期应变性哮喘的主要病原，26.5％的婴幼儿急性呼吸道感染是由于rsv感染引起[5]。全球每年约有3310万5岁以下儿童感染rsv，其中约有320万感染儿童需要住院治疗，5.96万住院儿童死亡，这其中，99％的死亡发生在发展中国家，给世界各国尤其是发展中国家带来沉重的经济和社会负担。

rsv属肺病毒科、正肺病毒属，单股负链rna包膜病毒[7]，病毒粒子直径为150-300nm，共编码11种蛋白，其中融合糖蛋白(fusionglycoprotein，f)和黏附糖蛋白(attachmentglycoprotein，g)为主要中和抗原[8]，根据g蛋白抗原性存在的差异，rsv分为a和b两个亚型。f蛋白的抗原性较稳定，针对f蛋白的中和抗体对a、b两个亚型的rsv感染具有交叉保护作用，可减少高危人群对rsv感染的严重程度，在rsv流行季节，针对f蛋白的单克隆抗体(palivizumab,帕利珠单抗)已用于对高危人群的预防，提示诱导产生足够高的针对rsvf蛋白的中和抗体的疫苗可以预防rsv感染。因此，f蛋白成为rsv疫苗研究的主要目标抗原。

rsvf蛋白属i型跨膜糖蛋白，最初翻译得到的是无活性前体形式f0，f0存在2个furin-like蛋白酶酶切位点，分别位于109/110氨基酸位点处和136/137氨基酸位点处，当f0通过高尔基体时，被furin-like蛋白酶在109/110氨基酸位点处和136/137氨基酸位点处分别酶切，产生3个片段，即：羧基端大片段f1、氨基端小片段f2和27个氨基酸的短片段p27(即rsvf蛋白编码序列aa110-136)，f1和f2通过2个二硫键结合在一起形成成熟的rsvf蛋白，p27被游离出来。成熟的rsvf主要存在两种构象状态：即亚稳态的融合前f(pre-fusionfusionglycoprotein，pre-f)构象和稳定的融合后f(post-fusionfusionglycoprotein，post-f)构象，为了从pre-f转变为post-f，包含有融合肽(fusionpeptide，fp)和七肽重复a(heptadrepeata，hra)的位于f1上的rr1(refoldingregion1)(137-216aa)，由α-螺旋、β-折叠和loops的二级结构转变为一个长的、连续的α-螺旋，同时，位于f1蛋白n端的高度疏水的fp能够从病毒膜外展、并插入到靶细胞的细胞膜中。随后，包含七肽重复b(heptadrepeatb，hrb)的rr2(refoldingregion2)重新定位到f蛋白顶部的另一侧，形成pre-f刺突c末端杆(c-terminalstem)。最后，hrb结合到hra卷曲螺旋三聚物(coiled-coiltrimer)，形成6hb结构(six-helixbundle)，从而完成膜融合，也完成了由亚稳定的pre-f结构转变为稳定post-f结构。

在已鉴定的rsvf蛋白的中和抗原表位中，sitei主要位于post-f上，siteii和siteiv在pre-f和post-f上均存在，siteiii主要位于pre-f，和sitev仅存在于pre-f。研究表明，在感染者血清中的具有保护作用的主要中和抗体是针对中和性抗原表位iii、和v的抗体，进一步研究显示，pre-f能够诱导机体产生更高活性的中和抗体、具有更好的保护作用。因此，近年来，pre-f成为rsv疫苗研制的重点与核心。

腺病毒载体因其安全性好、免疫原性强、生产方便等优点，被广泛用于疫苗载体，目前，使用最广泛的是人ad5型腺病毒载体，但是超过90％的我国人群感染过ad5，因而，严重干扰了疫苗的免疫效果。为避免预存ad5预存免疫反应对疫苗免疫效果的影响，研究者选用人稀有血清型腺病毒、非人腺病毒载体替代ad5用于疫苗研究，能够有效避免预存ad5预存免疫反应对疫苗免疫效果的影响。鉴于猩猩63型腺病毒(chimpanzeeadenovirusserotype63，chad63)和人26型腺病毒(humanadenovirusserotype26，ad26)在人体感染率低，且具有高度免疫原性等优点，以及尚未见chad63用作rsv疫苗研制的原因。

技术实现要素：

本发明提供了一种呼吸道合胞病毒全长融合前融合糖蛋白核苷酸序列、重组腺病毒载体及其应用产品，以克服现有技术的问题。

为了实现上述目的，本发明采取了如下技术方案。

一种呼吸道合胞病毒全长融合前融合糖蛋白核苷酸序列，该全长融合前融合糖蛋白核苷酸序列包括s155c、s190f、v207l和s290c四个突变位点，保留了融合糖蛋白的跨膜区及胞内区，该全长融合前融合糖蛋白核苷酸序列的序列表如序列1所示：

一种含有所述全长融合前融合糖蛋白核苷酸序列的重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体为猩猩复制缺陷型重组腺病毒载体pchad63，出发毒株为猩猩腺病毒63型，缺失了腺病毒e1和e3区、且e4orf6替换为人5型腺病毒e4orf6；

或者；

所述重组腺病毒载体为人复制缺陷型重组腺病毒载体pad26，出发毒株为人腺病毒26型，缺失了腺病毒e1和e3区、且e4orf6替换为人5型腺病毒e4orf6。

优选地，所述缺失腺病毒e1和e3区，e4orf6替换为人5型腺病毒e4orf6的骨架载体pchad63的序列表如序列2所示：

优选地，缺失腺病毒e1和e3区，e4orf6替换为人5型腺病毒e4orf6的骨架载体pad26的序列表如序列3所示：

序列3：

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一种应用重组腺病毒的产品，产品的活性成分包含所述重组腺病毒载体。

优选地，所述产品包括：呼吸道合胞病毒疫苗和用于中和呼吸道合胞病毒的药物。

由上述本发明的实施例提供的技术方案可以看出，本发明的复制缺陷型重组腺病毒免疫动物后，能在短时间内诱导机体产生强烈的细胞免疫和体液免疫反应，产生的抗体对融合前f识别能力较强，具有较好的免疫效果和免疫保护作用。可以应对世界范围内5型腺病毒载体重组疫苗预存免疫水平较高的问题。此外，该疫苗制备方法简单，可在短期内大规模生产，用于预防rsv感染。可以应对世界范围内5型腺病毒载体重组疫苗预存免疫水平较高的问题，同时保留了腺病毒的高滴度、易于生产储存等优点，对人呼吸道合胞病毒提出了有效预防方法，具有广泛应用前景。

本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的一种质粒pshuttle63分别经paci单酶切、pmei单酶切后的电泳图。

图2为本发明提供的一种质粒pshuttle26分别经paci单酶切、bamhi和pmei双酶切后的电泳图。。

图3为本发明提供的一种质粒pchad63分别经ndei和avrii双酶切、xbai和spei双酶切、ecorv单酶切后的电泳图。

图4为本发明提供的一种质粒pad26经speι、avrⅱ双酶切的电泳图。

图5为本发明提供的一种质粒pcdna3.1-mds-cav1经hindⅲ和xhoⅰ双酶切酶切后的电泳图。

图6为本发明提供的一种携带外源基因的穿梭质粒酶切鉴定的电泳图。

a：质粒pshuttle26-mds-cav1经kpni和notⅰ双酶切后的电泳图。

b：质粒pshuttle63-mds-cav1经kpnⅰ和xhoⅰ双酶切后的电泳图。

图7为本发明提供的一种重组质粒酶切鉴定的电泳图。

a：质粒pad26-mds-cav1分别经paci、bamhi单酶切和ecorv单酶切后的电泳图。

b：质粒pchad63-mds-cav1分别经mlui和avrⅱ双酶切、ndei单酶切和ecori单酶切后的电泳图。

图8为本发明提供的一种westernblot检测重组腺病毒蛋白表达情况，检测用抗体为rsv多抗。

图9为本发明提供的一种斑点印记(dotblot)鉴定f蛋白融合前表位。

图10为本发明提供的一种透射电镜观察纯化的腺病毒样品(1％磷钨酸，ph6.8负染，tecnai-12，97000×)。

图11为本发明提供的一种重组腺病毒诱导balb/c小鼠产生的rsv特异性igg。

图12为本发明提供的一种基于rsv-mgfp的中和抗体分析方法分析重组腺病毒诱导balb/c小鼠产生的rsv特异性中和抗体应答。

图13为本发明提供的一种重组腺病毒诱导balb/c小鼠产生的rsvf特异性cd8+t细胞免疫应答。

图14为本发明提供的一种rsv感染免疫后小鼠体重变化及肺组织病毒滴度。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施方式，所述实施方式的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。

为便于对本发明实施例的理解，下面将结合附图以几个具体实施例为例做进一步的解释说明，且各个实施例并不构成对本发明实施例的限定。

本发明首先利用常规分子克隆和dnaassembly方法构建穿梭质粒(pshuttle63)和骨架质粒(pchad63)，然后采用定点突变方法将s155c、s190f、v207l和s290c四个突变位点引入全长rsvf基因，获得构象稳定的pre-f(mds-cav1)。随后，将mds-cav1和野生型rsvf基因(fsyn)分别亚克隆到pshuttle63，得到穿梭质粒pshuttle63-mds-cav1和pshuttle63-fsyn，经scaⅰ单酶切后，采用dnaassembly方法与pchad63进行dna组装，得到重组腺病毒质粒pchad63-mds-cav1和pchad63-fsyn。随后，经pacⅰ单酶切，利用脂质体2000转染至293细胞，获得重组腺病毒rchad63-mds-cav1和rchad63-fsyn。经氯化铯梯度超速离心法纯化后，经滴鼻途径免疫babl/c小鼠，对疫苗的安全性、免疫原性及其免疫保护作用进行系统、全面的评价。

本发明提供了一种重组腺病毒的制备方法和包含重组腺病毒的产品，该产品的活性成分为上述得重组腺病毒，所述产品可以为呼吸道合胞病毒疫苗和用于中和呼吸道合胞病毒的药物等，比如，可以为携带呼吸道合胞病毒融合前融合糖蛋白的猩猩63型复制缺陷型腺病毒载体疫苗。

本发明提供的重组腺病毒的制备方法，是将重组腺病毒质粒转染包装细胞，然后进行细胞培养得到腺病毒包装细胞，该腺病毒包装细胞中具有5型腺病毒e1基因。所属重组质粒是将特异dna分子插入猩猩63型复制缺陷型腺病毒载体中得到的；所述特异dna分子包括构象稳定的融合前融合糖蛋白(mds-cav1)的编码基因。

实施例1、重组腺病毒的制备

一、穿梭质粒(pshuttle63和pshuttle26)的构建

将人工合成dna序列插入pshuttle-cmv载体的两个pacι酶切位点之间，于dh5α感受态细胞中进行转化，提取质粒，获得穿梭质粒pshuttle63和pshuttle26。

二、骨架质粒(pchad63和pad26)的构建

采用酶切连接方法和dnaassembly方法获得缺失缺失腺病毒e1和e3区，e4orf6替换为人5型腺病毒e4orf6的骨架质粒pchad63和pad26。

三、携带外源基因的穿梭质粒的构建

1、设计mds-cav1定点突变引物，将s155c、s190f、v207l和s290c四个突变位点引入全长rsvf基因，突变引物5'端磷酸化，进行突变链合成反应，dpnⅰ消化扩增产物，转化到感受态细胞、得到带有构象稳定的融合前融合糖蛋白(mds-cav1)的重组质粒pcdna3.1-mds-cav1。构象稳定的融合前融合糖蛋白(mds-cav1)序列见序列表序列1。突变引物如下：

s155cprimer:5'-cggagtggccgtgtgcaaggtgctgcacct-3'

s190fprimer:5'-cgtgtccgtgctgaccttcaaggtgctggatctg-3'

v207lprimer:5'-cagctgctgcccatcctgaacaagcagagct-3'

s290cprimer:5'-cagagctactccatcatgtgcatcatcaaagaagagg-3'

2、将突变得到的片段连接到载体pcdna3.1上，于dh5α感受态细胞中进行转化，提取质粒，用限制性内切酶hindⅲ和xhoⅰ双酶切pcdna3.1-mds-cav1，酶切后可见1700bp目的条带和15400bp载体条带，得到质粒pcdna3.1/mds-cav1。

3、用限制性核酸内切酶aflⅱ和xhoⅰ分别双酶切pshuttle63和pcdna3.1-mds-cav1，凝胶电泳回收约3600bp的pshuttle63载体片段和约1700bp的mds-cav1目的片段，连接载体片段和目的片段，于dh5α感受态细胞中进行转化，提取质粒，用限制性核酸内切酶pacⅰ单酶切，酶切后为约1700bp和3600bp两条带，用限制性核酸内切酶pmei单酶切，不能正常酶切，见质粒大小条带，得到重组质粒pshuttle63-mds-cav1。

四、重组腺病毒质粒的构建

用限制性核酸内切酶scai和aflⅱ双酶切pshuttle63-mds-cav1，凝胶电泳回收约2600bp的pshuttle63目的片段，用限制性核酸内切酶hpai单酶切pchad63，用虾碱性磷酸酶(rsap)去磷酸化，再用无水乙醇沉淀回收约34000bp的载体片段。运用hifidnaassembly试剂盒的方法，组装载体片段和目的片段，得到重组腺病毒质粒pchad63-mds-cav1。

五、重组腺病毒的拯救

细胞培养条件：37℃、5％co2恒温培养箱

1、用含有10％胎牛血清的dmem培养基培养293细胞至细胞密度达到80％。

2、取12.5μg重组腺病毒质粒pchad63-mds-cav1和pad26-mds-cav1，用限制性核酸内切酶pacⅰ过夜酶切，乙醇沉淀回收，得到线性化质粒。

3、借助lipofectamine2000将所得线性化质粒转染到步骤1培养细胞中并培养5h(无胎牛血清的dmem培养液)，然后换用含有10％胎牛血清的dmem培养液过夜培养，最后换用含有2％胎牛血清的dmem培养液，继续培养，在转染后6～7d，细胞出现肿胀、变圆等细胞病变，获得的病毒称为：rchad63-mds-cav1和rad26-mds-cav1。

六、重组腺病毒体外鉴定

1、蛋白质印迹法(westernblot)鉴定重组腺病毒的蛋白表达情况

取p4代重组腺病毒病毒液rchad63-mds-cav1、rchad63-fsyn和rchad63-empty各2μl，分别接种于细胞密度为80％的293细胞。48h后收集细胞，用细胞裂解液裂解后，收取等量的上清，利用rsv多抗进行westernblot来检测重组腺病毒蛋白表达情况，结果显示rchad63-fsyn和rchad63-mds-cav1均表达f蛋白，条带大小为170kd。

2、免疫斑(dotblot)检测各重组腺病毒表达的蛋白融合前表位

取p4代重组腺病毒病毒液rchad63-mds-cav1、rchad63-fsyn和rchad63-empty各2μl，分别接种于细胞密度为80％的293细胞。48h后细胞发生病变，收集细胞，利用识别不同表位的f蛋白单克隆抗体，采用dotblot的方法检测重组腺病毒表达的f蛋白的融合前表位情况，结果显示：与rchad63-fsyn表达的野生型f蛋白相比，rchad63-mds-cav1表达的mds-cav1含有更多的融合前表位iii、v和(我们以palivizumab的表位含量为1，计算出其他表位的百分比)。

实施例2、重组腺病毒的应用

一、动物免疫

6-8周龄的雌性balb/c小鼠，分成4组，每组5只，分别处理如下：

第一组(g1组)：采用滴鼻方式进行单次免疫，免疫物为rchad63-empty病毒液(病毒量为1×10¹⁰vp)；

第二组(g2组)：采用滴鼻方式进行单次免疫，免疫物为rchad63-fsyn病毒液(病毒量为1×10¹⁰vp)；

第三组(g3组)：采用滴鼻方式进行单次免疫，免疫物为rchad63-mds-cav1病毒液(病毒量为1×10¹⁰vp)；

第四组(g4组)：采用肌肉注射方式进行单次免疫，免疫物为fi-rsv病毒液(病毒量为1.25×10⁶pfu)；

第五组(g5组)：采用滴鼻方式进行单次免疫，免疫物为rad26-empty病毒液(病毒量为1×10¹⁰vp)；

第六组(g6组)：采用滴鼻方式进行单次免疫，免疫物为rad26-fsyn病毒液(病毒量为1×10¹⁰vp)；

第七组(g7组)：采用滴鼻方式进行单次免疫，免疫物为rad26-mds-cav1病毒液(病毒量为1×10¹⁰vp)；

以上各组中，滴鼻方式免疫的免疫体积均为30μl，肌肉注射方式免疫的体积均为50μl，用ph7.2的pbs缓冲液作为溶剂调整病毒浓度。

免疫前1d，眼内眦静脉采集基础血。第0d，用0.4％戊巴芘妥钠经腹腔注射麻醉小鼠(40-50mg/kg体重)，待小鼠深麻后，滴鼻免疫。在免疫后第21d，眼内眦静脉采集免疫后血。免疫后第28d，经滴鼻途径进行攻毒实验，攻毒的剂量为1×10⁶pfu/50μl的wtrsv-long。

二、免疫后小鼠体液免疫效果分析

待测溶液为：步骤一中免疫后第21d采集小鼠静脉血，分离获得血清。

采用elisa方法检测小鼠的血清抗体滴度。首先用棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度。rsv按2500pfu/孔包被酶标板采用elisa方法检测小鼠血清抗体igg。

三、抗体中和实验

1、rsv抗体中和实验，按照2.5×10⁴细胞/孔的密度将hep-2细胞接种到96孔板上，培养24h。

2、将免疫后小鼠血清于56℃，灭活30min，用维持液2倍稀释，注意每稀释一个稀释度都必须换一个枪头吸管。并用2％胎牛血清的dmem培养液进行2倍稀释。不同稀释度的血清中，加入rsv-mgfp(rsv-mgfp的终浓度为1000pfu/100μl)，混合后于37℃孵育1h。

3、弃96孔板培养基，pbs洗涤1-2次后，将100μl混合液(含1000pfu的rsv-mgfp)加入到铺有单层hep-2细胞的96孔板中，37℃培养48h。同时设立空白对照(无病毒、无血清或抗体)、阴性对照组(有rsv-mgfp，无血清)和阳性对照组(rsv多抗替代血清)，培养2d。

4、完成步骤9后，采用多功能酶标仪spectramaxm5e检测每孔中绿色荧光蛋白的荧光强度(激发波长479nm、发射波长517nm，检测10s)。

5、实验组、阴性对照组、阳性对照组均分别减去空白对照组，利用spss建立建立实验组的线性回归方程，通过线性回归方程，计算出荧光强度减少50％的抗体滴度(ic50)。或者以“(实验组-空白组)/(阴性对照组-空白组)是否小于0.5为判断标准。

四、免疫后小鼠细胞免疫效果分析

待测细胞为：步骤一中免疫后第21d小鼠脾细胞。

1、脱颈处死免疫后21d的小鼠，在超净台中无菌采集脾细胞。

2、利用elispot的方法分析细胞免疫效果，计数rsvf蛋白h-2k^d限制性ctl表位刺激后分泌ifn-γ的脾淋巴细胞数量。

3、实验检测前一天，在超净台中，向预包被板加入200μl/孔1640培养基，室温静置5-10min后，弃1640培养基。

4、按2×10⁵细胞/孔浓度将细胞悬液加入各实验孔，100μl/孔，同时注意设置阴性对照孔(未加阳性刺激物)和背景对照孔(不加细胞，只加1640)。

5、阳性对照孔中加入阳性刺激物工作液，10μl/孔，阴性对照孔和背景对照孔加入1640无血清培养基；刺激物为rsvf蛋白h-2k^d限制性ctl表位(kyknavtel和tymltnsell,纯度≥95％，冻干分装保存于-20℃冰箱)(2×10⁵细胞中各加0.5μg),盖好板盖，37℃，5％co2温箱孵育16-20h。

6、完成步骤5后，弃去原孔内培养基，加入冰冷的去离子水，200μl/孔，于4℃冰箱放置10min,低渗裂解细胞。

7、倒出孔内液体，1xwashingbuffer洗涤5次，200μl/孔，，每次停留30s，最后一次洗涤完毕后在吸水纸上扣干。

8、将稀释好的生物素标记的抗体工作液加入各实验孔，100μl/孔，37℃孵育1h。

完成步骤8后，到处孔内液体，1xwashingbuffer，200μl/孔，洗涤5-7次，每次停留30s，并吸水纸上扣干。

9、按照说明书稀释亲和素标记的二抗工作液，100μl/孔加入各实验孔，37℃孵育1h。

10、倾倒孔内液体，1xwashingbuffer洗涤5次，200μl/孔，每次停留30s，最后一次洗涤完毕后在吸水纸上扣干；

11、按照说明书配制aec显色工作液，100μl/孔加入各实验孔，室温静置15-30min。

12、待斑点生长到合适的大小之后，倾倒孔内液体，之后揭开板底座，用以去离子水洗涤板底座5遍，终止显色反应，然后将板放置到室温阴凉处自然晾干，待板彻底干燥后，用elispotreader对96孔板进行成像，并immunospotimageanalyzersoftwarev4.0分析读取斑点数。

五、攻毒后小鼠免疫保护作用分析

待测溶液为：步骤一中攻毒后第7d小鼠肺组织匀浆。

1、脱颈处死攻毒后第7d的小鼠，在生物安全柜内制备小鼠肺组织匀浆。

2、采用rt-qpcr的方法检测攻毒后小鼠的肺病毒滴度。trizol法提取小鼠肺组织匀浆中的病毒rna，并通过rt-qpcr合成cdna。

3、根据wtrsv-longn基因相对保守的序列，设计扩增引物。扩增引物如下：

rsa-1:5′-agatcaacttctgtcatccagcaa-3′

rsa-2:5′-gcacatcataattaggagtatcaat-3′；

质粒pmd-18t-n作为标准品，计算其拷贝数：拷贝数(copies/μl)＝od260×50×稀释倍数/(碱基数×324)×6×10¹⁴。按如下方法准备qpcr反应管：

按如下反应条件进行qpcr：

每个循环最后一步结束时收集荧光值，使根据45℃-95℃溶解曲线计算出ct值并给出定量的结果。

4、动物体重统计，将攻毒当天设为第0d，连续记录攻毒后的0-7d小鼠体重变化。

5、攻毒后小鼠肺病理分析，步骤一中取出的肺组织用10％甲醛进行固定，再用石蜡进行包埋，做成厚度为4μm的切片，进行he染色。

6、每张切片选择10个视野进行拍照，分析肺组织病理的相关指标，包括肺泡腔内炎性细胞数、肺脏小气管周围炎性细胞数、肺间质炎性细胞数以及肺泡壁厚度，并采用盲法对各个指标进行评分，得分范围是0-4，0分为无病理，4分为病理变化严重，以fi-rsv作为阳性对照。

序列表

序列1

稳定的pre-f(mds-cav1)序列

gccaccatggaactgctgatcctgaaggccaacgccatcaccaccatcctgaccgctgtgaccttctgcttcgccagcggccagaacatcaccgaggaattctaccagagcacctgtagcgccgtgtccaagggctacctgagcgccctgcggaccggctggtacaccagcgtgatcaccatcgagctgagcaacatcaagaaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaagatcaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaacgccgtgaccgagctgcagctgctgatgcagagcacccccgccaccaacaaccgggctagacgcgagctgcctcggttcatgaactacaccctgaacaacgccaaaaagaccaacgtgaccctgagcaagaagcggaagcggcggttcctgggcttcctgctgggcgtgggcagcgccattgctagcggagtggccgtgtgcaaggtgctgcacctggaaggcgaagtgaacaagatcaagtccgccctgctgagcaccaacaaggccgtggtgtccctgagcaacggcgtgtccgtgctgaccttcaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcccatcctgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagacagtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggaaatcacccgcgagttcagcgtgaacgccggcgtgaccacccccgtgtccacctacatgctgaccaacagcgagctgctgagcctgatcaacgacatgcccatcaccaacgaccagaaaaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagagctactccatcatgtgcatcatcaaagaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcccctgtacggcgtgatcgacaccccctgctggaagctgcacaccagccccctgtgcaccaccaacaccaaagagggcagcaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgataatgccggcagcgtgtcattctttccacaagccgagacatgcaaggtgcagagcaaccgggtgttctgcgacaccatgaacagcctgaccctgccctccgaagtgaacctgtgcaacgtggacatcttcaaccctaagtacgactgcaagatcatgacctccaagaccgacgtgtccagctccgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgccagcaacaagaaccggggcatcatcaagaccttcagcaacggctgcgactacgtgtccaacaagggggtggacaccgtgtccgtgggcaacaccctgtactacgtgaacaaacaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttccccagcgacgagttcgacgccagcatcagccaggtcaacgagaagatcaaccagagcctggccttcatcagaaagagcgacgagctgctgcacaatgtgaatgccgtgaagtccaccaccaatatcatgatcaccacaatcatcatcgtgatcatcgtcatcctgctgtccctgatcgccgtgggcctgctgctgtactgcaaggcccggtccacccctgtgaccctgtccaaggaccagctgagcggcatcaacaatatcgccttctccaactga

序列2

缺失腺病毒e1和e3区，e4orf6替换为人5型腺病毒的骨架载体pchad63序列

tgatatccttaattaacatcatcaataatatacctcaaacttttggtgcgcgttaatatgcaaatgaggtgtttgaatttggggatgcggggcgctgattggctgagagacgggcgaccgttaggggcggggcgggtgacgttttgatgacgtggccgtgaggcggagccggtttgcaagttctcgtgggaaaagtgacgtcaaacgaggtgtggtttgaacacggaaatactcaattttcccgcgctctctgacaggaaatgaggtgtttctgggcggatgcaagtgaaaacgggccattttcgcgcgaaaactgaatgaggaagtgaaaatctgagtaattccgcgtttatggcagggaggagtatttgccgagggccgagtagactttgaccgattacgtgggggtttcgattaccgtatttttcacctaaatttccgcgtacggtgtcaaagtccggtgtttttacgtaggcgtcagctgatcgccagggtatttaaacctgcgctctctagtcaagaggccactcttgagtgccagcgagtagagttaacgggacggagttcggctccagcggggaagaatctgactagagtgagtagtgtttgggggtgggtgggagcctgcatgatgggcagaatgactaaaatctgtgtttttctgtgtgttgcagcagcatgagcggaagcgcctcctttgagggaggggtattcagcccttatctgacggggcgtctcccctcctgggcgggagtgcgtcagaatgtgatgggatccacggtggacggccggcccgtgcagcccgcgaactcttcaaccctgacctacgcgaccctgagctcctcgtccgtggacgcagctgccgccgcagctgctgcttccgccgccagcgccgtgcgcggaatggccctgggcgccggctactacagctctctggtggccaactcgagttccaccaataatcccgccagcctgaacgaggagaagctgttgctgctgatggcccagctcgaggccctgacccagcgcctgggcgagctgacccagcaggtggctcagctgcaggcggagacgcgggccgcggttgccacggtgaaaaccaaataaaaaatgaatcaataaataaacggagacggttgttgattttaacacagagtcttgaatctttatttgatttttcgcgcgcggtaggccctggaccaccggtctcgatcattgagcacccggtggatcttttccaggacccggtagaggtgggcttggatgttgaggtacatgggcatgagcccgtcccgggggtggaggtagctccattgcagggcctcgtgctcgggggtggtgttgtaaatcacccagtcatagcaggggcgcagggcgtggtgctgcacgatgtctttgaggaggagactgatggccacgggcagccccttggtgtaggtgttgacgaacctattgagctgggagggatgcatgcggggggagatgagatgcatcttggcctggatcttgagattggcgatgttcccgcccagatcccgccgggggttcatgttgtgcaggaccaccagcacggtgtatccggtgcacttggggaatttgtcatgcaacttggaagggaaggcgtgaaagaatttggagacgcccttgtgaccgcccaggttttccatgcactcatccatgatgatggcgatgggcccgtgggcggcggcctgggcaaagacgtttcgggggtcggacacatcgtagttgtggtcctgggtgagctcgtcataggccattttaatgaatttggggcggagggtacccgactgggggacaaaggtgccctcgatcccgggggcgtagttcccctcgcagatctgcatctcccaggccttgagctcggagggggggatcatgtccacctgcggggcgatgaaaaaaacggtttccggggcgggggagatgagctgcgccgaaagcaggttccggagcagctgggacttgccgcagccggtggggccgtagatgaccccgatgaccggctgcaggtggtagttgagggagagacagctgccgtcctcgcggaggaggggggccacctcgttcatcatctcgcgcacatgcatgttctcgcgcacgagttccgccaggaggcgctcgccccccagcgagaggagctcttgcagcgaggcgaagtttttcagcggcttgagcccgtcggccatgggcattttggagagggtctgttgcaagagttccagacggtcccagagctcggtgatgtgctctagggcatctcgatccagcagacctcctcgtttcgcgggttggggcgactgcgggagtagggcaccaggcgatgggcgtccagcgaggccagggtccggtccttccagggtcgcagggtccgcgtcagcgtggtctccgtcacggtgaaggggtgcgcgccgggctgggcgcttgcgagggtgcgcttcaggctcatccggctggtcgagaaccgctcccggtcggcgccctgcgcgtcggccaggtagcaattgagcatgagttcgtagttgagcgcctcggccgcgtggcccttggcgcggagcttacctttggaagtgtgtccgcagacgggacagaggagggacttgagggcgtagagcttgggggcgaggaagacggactcgggggcgtaggcgtccgcgccgcagctggcgcagacggtctcgcactccacgagccaggtgaggtcggggcggtcggggtcaaaaacgaggtttcctccgtgctttttgatgcgtttcttacctctggtctccatgagctcgtgtccccgctgggtgacaaagaggctgtccgtgtccccgtagaccgactttatgggccggtcctcgagcggggtgccgcggtcctcgtcgtagaggaaccccgcccactccgagacgaaggcccgggtccaggccagcacgaaggaggccacgtgggaggggtagcggtcgttgtccaccagcgggtccaccttctccagggtatgcaagcacatgtccccctcgtccacatccaggaaggtgattggcttgtaagtgtaggccacgtgaccgggggtcccggccgggggggtataaaagggggcgggcccctgctcgtcctcactgtcttccggatcgctgtccaggagcgccagctgttggggtaggtattccctctcgaaggcgggcatgacctcggcactcaggttgtcagtttctagaaacgaggaggatttgatattgacggtgccgttggagacgcctttcatgagcccctcgtccatctggtcagaaaagacgatctttttgttgtcgagcttggtggcgaaggagccgtagagggcgttggagagcagcttggcgatggagcgcatggtctggttcttttccttgtcggcgcgctccttggcggcgatgttgagctgcacgtactcgcgcgccacgcacttccattcggggaagacggtggtgagctcgtcgggcacgattctgacccgccagccgcggttgtgcagggtgatgaggtccacgctggtggccacctcgccgcgcaggggctcgttggtccagcagaggcgcccgcccttgcgcgagcagaaggggggcagcgggtccagcatgagctcgtcgggggggtcggcgtccacggtgaagatgccgggcaggagctcggggtcgaagtagctgatgcaggtgcccagatcgtccagacttgcttgccagtcgcgcacggccagcgcgcgctcgtaggggctgaggggcgtgccccagggcatggggtgcgtgagcgcggaggcgtacatgccgcagatgtcgtagacgtagaggggctcctggaggacgccgatgtaggtggggtagcagcgccccccgcggatgctggcgcgcacgtagtcgtacagctcgtgcgagggcgcgaggagccccgtgccgagattggagcgctgcggcttttcggcgcggtagacgatctggcggaagatggcgtgggagttggaggagatggtgggcctctggaagatgttgaagtgggcatggggcagtccgaccgagtccctgatgaagtgggcgtaggagtcctgcagcttggcgacgagctcggcggtgacgaggacgtccagggcgcagtagtcgagggtctcttggatgatgtcgtacttgagctggcccttctgcttccacagctcgcggttgagaaggaactcttcgcggtccttccagtactcttcgagggggaacccgtcctgatcggcacggtaagagcccaccatgtagaactggttgacggccttgtaggcgcagcagcccttctccacggggagggcgtaagcttgcgcggccttgcgcagggaggtgtgggtgagggcgaaggtgtcgcgcaccatgactttgaggaactggtgcttgaagtcgaggtcgtcgcagccgccctgctcccagagctggaagtccgtgcgcttcttgtaggcggggttgggcaaagcgaaagtaacatcgttgaagaggatcttgcccgcgcggggcatgaagttgcgagtgatgcggaaaggctggggcacctcggcccggttgttgatgacctgggcggcgaggacgatctcgtcgaagccgttgatgttgtgcccgacgatgtagagttccacgaatcgcgggcggcccttgacgtggggcagcttcttgagctcgtcgtaggtgagctcggcggggtcgctgagcccgtgctgctcgagggcccagtcggcgacgtgggggttggcgctgaggaaggaagtccagagatccacggccagggcggtctgcaagcggtcccggtactgacggaactgctggcccacggccattttttcgggggtgacgcagtagaaggtgcgggggtcgccgtgccagcggtcccacttgagctggagggcgaggtcgtgggcgagctcgacgagcggcgggtccccggagagtttcatgaccagcatgaaggggacgagctgcttgccgaaggaccccatc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综上所述，本发明实施例的复制缺陷型重组腺病毒具有与猩猩63型腺病毒(serotype63chimpanzeeadenovirus，chad63)完全一致的颗粒结构，基因组中缺失腺病毒e1和e3区，e4orf6替换为人5型腺病毒e4orf6，呼吸道合胞病毒融合前融合糖蛋白基因表达框嵌入腺病毒基因组包装信号之后，在293中能够有效包装，感染细胞后可以稳定表达呼吸道合胞病毒融合前融合糖蛋白。该复制缺陷型重组腺病毒免疫动物后，能在短时间内诱导机体产生强烈的细胞免疫和体液免疫反应，产生的抗体对融合前f识别能力较强，具有较好的免疫效果和免疫保护作用。可以应对世界范围内5型腺病毒载体重组疫苗预存免疫水平较高的问题。此外，该疫苗制备方法简单，可在短期内大规模生产，用于预防rsv感染。可以应对世界范围内5型腺病毒载体重组疫苗预存免疫水平较高的问题，同时保留了腺病毒的高滴度、易于生产储存等优点，对人呼吸道合胞病毒提出了有效预防方法，具有广泛应用前景。

本发明的疫苗的施用可以采用方便的途径，例如肌内注射，鼻内和口服。本发明优选采用鼻内途径，合适的剂量为1×1010vp。

本发明获得的携带呼吸道合胞病毒融合前融合糖蛋白的猩猩63型复制缺陷型腺病毒载体疫苗还具有下述优势。感染细胞后可以稳定表达呼吸道合胞病毒融合前融合糖蛋白。免疫动物后，能在短时间内诱导机体产生强烈的细胞免疫和体液免疫反应，产生的抗体对融合前f识别能力较强。此外，该疫苗制备方法简单，可在短期内大规模生产，用于预防rsv感染。

本领域普通技术人员可以理解：附图只是一个实施例的示意图，附图中的模块或流程并不一定是实施本发明所必须的。

本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于装置或系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述得比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。以上所描述的装置及系统实施例仅仅是示意性的，其中所述作为分离部件说明的单元可以是或者也可以不是物理上分开的，作为单元显示的部件可以是或者也可以不是物理单元，即可以位于一个地方，或者也可以分布到多个网络单元上。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部模块来实现本实施例方案的目的。本领域普通技术人员在不付出创造性劳动的情况下，即可以理解并实施。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

sequencelisting

<110>北京交通大学

<120>呼吸道合胞病毒全长融合前融合糖蛋白核苷酸序列、重组腺病毒载体及其应

用产品

<130>2020.12.11

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