一种蛋白核小球藻叶绿体转基因系统及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及一种蛋白核小球藻叶绿体转基因系统及其应用。

背景技术：

蛋白核小球藻(chlorellapyrenoidosa)属于绿藻门(chlorophyta)绿藻纲(chlorophyceae)绿球藻目(chlorococcales)卵囊藻科(oocystaceae)小球藻属(chlorella)，蛋白核小球藻在学术分类上也称为auxenochlorellapyrenoidosa。蛋白核小球藻细胞呈球形或椭圆形，细胞壁较坚固，含有1个呈杯状叶绿体。自养生长下的叶绿体内常有1个色素体，1个淀粉核，细胞直径约5μm。蛋白核小球藻既可以自养生长，也可以异养生长。

蛋白核小球藻的蛋白质含量可高达55％～65％，可作为优良植物蛋白源。在特定的培养条件下，蛋白核小球藻总脂含量可以达到细胞干重的38％以上，不饱和脂肪酸含量可高达总脂肪酸的75％，其中亚油酸含量约47％，亚麻酸含量约10％，油脂产率可达126.3mg/(l·d)以上。蛋白核小球藻还富含芦丁、类胡萝卜素等营养素，是优良的食品资源。蛋白核小球藻已经被我国原卫生部批准为食品新资源。由于蛋白核小球藻具有良好的食品安全性，是少有几种可作为食品材料的微藻之一，可以用其加工食品或饲料。利用蛋白核小球藻作为转基因宿主开发基因工程食品和饲料或者其他生物活性物质，宿主安全性具有保证。因此，利用蛋白核小球藻开发转基因食品、药品、疫苗等相比于其他微藻具有优势。

蛋白核小球藻与其他光合作用真核细胞一样具有细胞核、叶绿体和线粒体三套dna分子，构成既独立又相互联系的遗传体系。在细胞内的三套遗传体系中，核基因组遗传体系具有一些明显的困难：(1)细胞核基因组庞大，结构复杂；(2)在基因转化过程中外源基因被随机插入到基因组的不确定位置中，常常无法表达而成为沉默基因；(3)外源基因表达效率低，且表达不稳定；(4)外源基因的插入有时会改变其他重要性状而降低宿主的生命力或者降低经济价值；(5)外源基因容易扩散，可能有对环境的基因污染的风险等。

叶绿体是微藻光合作用的场所，其遗传物质为双链环状dna。通常一个叶绿体中有多个基因组拷贝。叶绿体基因组大小在120～160kb，gc含量在25％～38％。叶绿体基因组具有原核生物基因的特点，与功能相关的基因多为多顺反子转录单位其排列顺序具有高度保守性。1988年在莱茵衣藻上首次开展了叶绿体遗传转化，此后，叶绿体转基因研究在其他微藻和烟草等植物中开展。与核转化相比，叶绿体转化技术具有如下特点：(1)外源基因通过同源片段精确定点插入到叶绿体基因组中，可以较好解决基因失活、基因沉默、位置效应等问题；(2)由于叶绿体中常常有多个基因组拷贝，当同质化后，外源基因的拷贝数高，表达效率高、基因丢失的风险小；(3)叶绿体基因组属于原核表达系统，可以以多顺反子的形式将多个基因转入叶绿体，有利于标记基因和目的基因等进行共同转化；(4)对于高等植物来说，叶绿体为母系遗传，能较好避免转基因植物对周围环境造成生物安全危害。

影响叶绿体转化系统效果的两个关键因素有：(1)合适的叶绿体转化载体；(2)有效的载体导入方法。叶绿体转化载体中表达盒的设计是重要因素，其中要素包括同源片段、标记基因和适合叶绿体的启动子、终止子。

但是，叶绿体转化表达系统也具有困难：(1)叶绿体一般是双层膜细胞器，加上坚韧的细胞壁结构，质粒注入叶绿体阻力大；(2)叶绿体基因组拷贝数高，同质化时间长；(3)微藻的叶绿体基因组多样性十分广泛，而叶绿体基因组获得测序的微藻种类目前还很少，所以叶绿体转化表达载体的构建和转化方法都不够完善，技术方法和技术参数在不同种微藻基因转化的差异性很大，在一种微藻有效的基因转化条件在另一种微藻中往往无效；(4)为筛选和获得完全同质化的转化子，需要用到很高的抗生素浓度，而较高的抗性基因表达水平对于植物是很大的代谢负担。

专利cn103834640a公开了一种向微拟球藻叶绿体中导入外源dna的方法及相关的叶绿体基因组序列；专利cn110747224a公开了一种富脂微拟球藻叶绿体转基因系统及其应用；专利cn109536525a公开了一种杜氏盐藻叶绿体同源重组空载体及其应用；专利cn110747226a公开了一种等鞭金藻叶绿体同源重组转基因系统及其应用。但是上述专利公开的叶绿体转基因系统均难以应用于蛋白核小球藻。因此，开发一套针对蛋白核小球藻的叶绿体转基因系统将为该藻的性能优化和应用提供技术基础，但是目前该藻的基因工程研究很少，缺少叶绿体转化系统，如可稳定插入的同源重组位点，高效的内源性调控序列，以及筛选标记基因等，这严重制约了该藻的研究和应用开发。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种蛋白核小球藻叶绿体转基因系统。

本发明的另一目的在于提供所述蛋白核小球藻叶绿体转基因系统的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种蛋白核小球藻叶绿体转基因系统，包含seqidno:1所示核苷酸序列中不小于1000bp的连续片段作为上游同源臂和下游同源臂，及插入上游同源臂和下游同源臂之间的启动子、终止子和外源基因。

本发明利用同源重组的策略，即利用同源臂引导目的基因在宿主叶绿体基因组上整合，建立一种适用于蛋白核小球藻叶绿体转基因的遗传转化系统和方法并应用于实际。其中，同源重组片段，即同源臂的选择至关重要，较长的同源片段有利于同源重组的发生。同时，为了防止外源基因插入引起的致死效应和重要序列的丢失，还应选择合适的插入位点。发明人前期完成了对蛋白核小球藻叶绿体基因组的测序，并将测序结果递交genebank，登录号为mn128434，蛋白核小球藻叶绿体基因组测序结果为蛋白核小球藻叶绿体同源重组的基因转化提供了有利的支持。经过分析后，本发明创造性的选择对于叶绿体基因组中对藻细胞生长没有影响的蛋白核小球藻非光依赖性叶绿素酸酯氧化还原酶dpor的基因(chll)序列(seqidno:1)，选择该序列中不小于1000bp的连续片段作为蛋白核小球藻叶绿体转基因系统的上游同源臂和下游同源臂，成功构建了蛋白核小球藻叶绿体定点转化载体。而正确有效的启动子、终止子等调控元件是保证目的基因在叶绿体中表达的因素之一，本发明的蛋白核小球藻叶绿体转基因系统可以用宿主叶绿体基因的启动子和终止子，也可以用其他物种的启动子和终止子。

优选地，所述上游同源臂和下游同源臂的序列如seqidno:2所示。所述同源臂为通过引物f：gaattcagcacttcaaggactggcat和r：tgacaccagaagcgtacaact扩增蛋白核小球藻叶绿体基因组得到一个全长1265bp的dna片段，再用限制性内切酶ecorⅰ和hpaⅰ酶切得到。

优选地，所述上下游同源臂间还插入有筛选标记基因。

优选地，所述蛋白核小球藻叶绿体转基因系统依次含上游同源臂、至少一个启动子、至少一个外源基因、选择标记基因、至少一个终止子和下游同源臂。

进一步优选地，所述启动子选自来源于莱茵衣藻的atpa启动子、rbcl启动子或psba启动子。

进一步优选地，所述终止子选自来源于莱茵衣藻的的psba终止子。

优选地，所述筛选标记基因为aada基因。

优选地，所述外源基因根据如下所述密码子偏好性进行优化：phe(ttc)、leu(tta)、ile(atc)、val(gta)、ser(tct)、pro(cca)、thr(act)、ala(gct)、tyr(tac)、gln(caa)、asn(aac)、asp(gac)、glu(gag)、cys(tgt)、arg(cgt)、gly(ggt)。本发明进一步对蛋白小球藻进行密码子优化，以获得最好的表达效果。根据宿主生物的密码子偏好性来优化外源基因编码序列，能降低基因沉默的概率，提高外源基因表达量。利用最优密码子修改要表达的外源基因序列，获得更好的表达效果。

本发明还请求保护所述蛋白核小球藻叶绿体转基因系统在构建转基因蛋白核小球藻中的应用。

具体地，为利用蛋白核小球藻叶绿体转基因系统将外源基因导入蛋白核小球藻细胞，经培养筛选获得转基因蛋白核小球藻。

优选地，为采用基因枪注射将蛋白核小球藻叶绿体转基因系统转化蛋白核小球藻细胞，在抗生素压力筛选和同质化培养后存活的藻即为成功的转基因藻，可以实现目标基因的转化和目的产物的生产。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明利用来源于蛋白核小球藻非光依赖性叶绿素酸酯氧化还原酶dpor的基因(chll)的序列片段作为上下游同源重组片段，成功构建了蛋白核小球藻的叶绿体转基因系统，所述系统可以将外源基因导入蛋白核小球藻叶绿体，并使之在蛋白核小球藻叶绿体中高效稳定的表达，为基于蛋白核小球藻开展的基因工程研究和实际应用开辟了道路，为利用蛋白核小球藻叶绿体转基因技术生产关键的食品营养因子或医药用蛋白创建了平台。

附图说明

图1为蛋白核小球藻叶绿体同源重组表的目的基因的表盒结构示意图。

图2为质粒p423-gfp的图谱。

图3为基因枪轰击后的蛋白核小球藻状态图。

图4为蛋白核小球藻在bg11液体培养基中的生长情况。注：左：野生藻，培养基无链霉素；中：野生藻，300μg/ml链霉素；右：转化藻，300μg/ml链霉素。

图5为gfp基因pcr扩增结果。m：dl1000；1：质粒对照；2：阴性对照；3：野生型对照；4：转化藻

图6为转绿色荧光蛋白基因小球藻显微图。a，藻细胞黑白照；b，叶绿素荧光；c，绿色荧光蛋白荧光；d，叶绿素荧光与绿色荧光蛋白荧光叠加。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1叶绿体表达载体的构建

1、蛋白核小球藻叶绿体基因组同源性片段克隆

配制bg11培养基，其配方为：nano31.5g/l、k2hpo40.04g/l、mgso4·7h2o0.075g/l、cacl2·2h2o0.036g/l、na2co30.02g/l、柠檬酸0.60mg/l、柠檬酸铁铵0.60mg/l、na2edta0.10mg/l、h3bo32.86×10^-3mg/l、mncl2·4h2o1.81×10^-3mg/l、znso4·7h2o0.22×10^-3mg/l、na2moo4·2h2o0.39×10^-3mg/l、cuso4·5h2o0.80×10^-4mg/l、co(no3)2·6h2o0.49×10^-4mg/l。用1mol/lnaoh或hcl调整培养基的ph至7.0。取400ml配制好的bg11培养基溶液装进500ml改装过的培养瓶，经121℃、30min高压蒸汽灭菌，冷却后接入蛋白核小球藻种子液，通过无菌过滤膜接入含5％co2的空气，空气通入培养瓶底部形成鼓泡作用，同时用磁力搅拌器连续搅拌。培养条件为26～30℃，2000～5000lx连续光照。培养时间为4～5天。培养结束后，采用离心法收获藻细胞。

取适量离心获得的藻细胞置于无菌研钵中，加入液氮充分研磨；将研磨过的产物放入2ml离心管，加250μl提取液，250μl酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，旋涡振荡均匀，12000rpm离心1min；取新的2ml离心管，加入离心后的上清150μl和异丙醇150μl(1:1)，振荡后12000rpm离心15min，弃上清；加入500μl70％乙醇，振荡后12000rpm离心1min，弃上清；在无菌台吹干后加入ddh2o溶解dna，作为扩增小球藻叶绿体同源序列的模板。

取适量离心获得的藻细胞置于无菌研钵中，加入液氮充分研磨；将研磨过的产物放入2ml离心管，加250μl提取液，250μl酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，旋涡振荡均匀，12000rpm离心1min；取新的2ml离心管，加入离心后的上清150μl和异丙醇150μl(1:1)，振荡后12000rpm离心15min，弃上清；加入500μl70％乙醇，振荡后12000rpm离心1min，弃上清；在无菌台吹干后加入ddh2o溶解dna，作为扩增小球藻叶绿体同源序列的模板。

同源重组片段，即同源臂，选择叶绿体基因组中对藻细胞生长没有影响的序列片段，本发明选择非光依赖性叶绿素酸酯氧化还原酶dpor的基因(chll)序列作为同源片段，所述蛋白核小球藻叶绿体chll基因序列如seqidno:1所示，在蛋白核小球藻叶绿体基因组序列中位于81983到83466。

本发明选择5’端和3’端的两个同源臂采用相同的一段序列，以实现同源臂长度达到1000bp以上。同源臂序列位于chll序列内部，从蛋白核小球藻叶绿体基因组扩增一段包含chll序列的dna片段，然后用限制性内切酶切出一段1053bp的片段用作同源臂dna片段。

具体方法为，以小球藻总基因组dna或叶绿体基因组dna为模板，上游引物序列为gaattcagcacttcaaggactggcat，下游引物序列为tgacaccagaagcgtacaact，人工合成获得这2个引物序列dna片段。pcr反应体系为2×taqmastermix10μl，上游引物0.8μl，下游引物0.8μl，模板dna1μl(<1μg)，补充ddh2o至20μl。pcr反应程序为：94℃预变性5min；94℃30s，60℃30s，72℃20s，共30个循环；72℃彻底延伸10min，4℃保温10min。取20μlpcr产物加入4μl6×loadingbuffer，用移液枪吸打混匀。在电泳凝胶胶孔分别加入适量的样品和合适的dnamarker后进行电泳(5v/cm，20min)。电泳完成后取出凝胶并将其置于凝胶成像仪中观察并拍照。同时，在用电泳分离pcr产物，切割目标片段相应位置凝胶，溶出dna片段，得到一个全长1265bp的dna片段(为叶绿体基因组序列82277-83516，)。再用限制性内切酶ecorⅰ和hpaⅰ酶切得到一个全长为1057bp的片段(在蛋白核小球藻叶绿体基因组序列中位于82277到83329)，其序列如seqidno:2所示，这个片段带有5’和3’粘性末端，用凝胶电泳分离出这段dna片段用作重组同源臂。

2、蛋白核小球藻叶绿体表达系统构建

质粒p423是以质粒puc18为骨架构建的。我们的前期试验表明，蛋白核小球藻对链霉素敏感，用于小球藻转基因的质粒载体可用抗性基因aada作为筛选标记。质粒p423的构建过程是，首先人工合成由莱茵衣藻的叶绿体atpa基因的启动子(seqidno:6)、抗生素筛选基因aada(seqidno:5)和莱茵衣藻的叶绿体rbcl基因的终止子(seqidno:7)顺序组成的序列片段，然后用ecor1酶切puc18，再将合成的上述片段与酶切的puc18连接，即得质粒p423，转入大肠杆菌保存。

目的基因表达载体由质粒p423为基础构建，用连接酶将同源臂与有启动子、目的基因和终止子组成的片段连接。启动子可以用莱茵衣藻的叶绿体atpa基因的启动子，终止子选用莱茵衣藻的叶绿体rbcl基因的终止子。

以绿色荧光蛋白为例，其构建表达盒结构图1所示。所述表达盒中用作同源臂的5’chll和3’chll片段均为seqidno:2的那段长度为1057bp的序列。构建的表达载体质粒图谱如图2所示，载体质粒构建完成后，转入大肠杆菌保存。

具体方法为：将保存p423质粒的大肠杆菌通过划线法接种到加有100μg/ml的氨苄青霉素的lb固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养24h。待固体平板上长出菌后，挑取形态良好的单菌落，将其接种到装有40mllb液体培养基的100ml锥形瓶中，并加入终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素，置于37℃恒温摇床中，200rpm，培养24h。取2.0ml培养好的培养液于2.0ml管中，4℃8000g离心1min，弃上清；向管内加入100μl已预冷的质粒提取溶液ⅰ(50mmol/l葡萄糖，25mmol/ltris-hcl，10mmol/ledta)，剧烈震荡，使菌体分散形成均一的悬液；再向管内加入200μl新鲜配制并预冷过的溶液ⅱ(0.2mol/lnaoh，1％sds)，动作轻慢颠倒离心管数次，将离心管在冰上放置2min，充分裂解细胞；继续向管内加入150μl预冷过的溶液ⅲ(5mol/l乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，去离子水28.5ml)，动作轻慢颠倒离心管数次，置于冰上3min；加入450μlpci抽提液(苯酚/氯仿/异戊醇＝25：24：1)，震荡混匀，4℃12000g离心10min，将上清转移到新离心管中；加入0.8倍体积预冷过的无水乙醇，-20℃下放置30min，4℃12000g离心20min，去上清；用70％乙醇洗涤dna沉淀两次，晾干后加入50μlte缓冲液溶解dna，得到p423质粒dna。将提取的质粒p423的dna用限制性内切酶ecorⅰ切开，然后用连接酶将目的基因表达盒连接，形成重组的目的基因表达载体。载体质粒构建完成后，转入大肠杆菌保存。

实施例2密码子偏好性及在外源基因表达上的应用

本发明在获得基因组序列后进行的分析了解到蛋白核小球藻叶绿体基因组密码子的偏好性，明确了16个氨基酸的最优密码子为：phe(ttc)、leu(tta)、ile(atc)、val(gta)、ser(tct)、pro(cca)、thr(act)、ala(gct)、tyr(tac)、gln(caa)、asn(aac)、asp(gac)、glu(gag)、cys(tgt)、arg(cgt)、gly(ggt)。本发明按照这些最优密码子修改要表达的目的基因的dna序列，获得更好的表达效果。

实施例3利用蛋白核小球藻叶绿体表达系统表达绿色荧光蛋白

按照ncbi所载绿色荧光蛋白(gfp)基因序列(seqidno:3)，结合本发明分析的蛋白核小球藻叶绿体基因密码子偏好性，对gfp的基因序列进行改写，改写后的序列如seqidno:4所示，再人工合成所述改造后的序列。

从提取的p423质粒dna中扩增atpa启动子和rbcl终止子dna片段，与按照seqidno:4人工合成的gfp片段连接，得到gfp表达盒。

将提取的质粒p423的dna用限制性内切酶ecorⅰ切开，然后用连接酶将同源臂片段和gfp表达盒与质粒p423连接形成重组的目的基因(gfp)表达载体p423-gfp。表达盒的结构符合图1和2。载体质粒构建完成后，转入大肠杆菌保存。同时留一部分重组质粒用于小球藻转化。

取重组质粒p423-gfp，用0.6μm的金粉包裹dna，然后用基因枪注射，再通过一段时间的培养实现同质化。具体方法为：

(1)金粉包裹：取100μl已制备好的金粉储液(60mg/ml)于1.5ml离心管内，加10μl浓度为1mg/ml的重组质粒溶液。向管内逐滴加入40μl已灭菌并预冷过的0.1m的亚精胺，充分震荡混匀；再向管内逐滴加入100μl已灭菌并预冷过的2.5m的氯化钙溶液，充分震荡混匀大约1min；用6000rpm离心30s，弃上清；向管内加入200μl预冷过的无水乙醇，震荡30s使金粉颗粒悬浮；6000rpm离心30s，弃上清；加入100μl无水乙醇悬浮金粉颗粒即完成质粒包裹金粉。

(2)基因枪注射：先准备好bg11培养基固体平板(含卡那霉素100μg/ml)，将收集的处于对数生长期的蛋白核小球藻在无菌条件下涂布于bg11固体平板上，使其成直径约为2cm的有一定厚度的藻苔；取10μl制备好的用重组质粒包裹过的金粉悬液注入基因枪加样孔内，将枪管竖立在藻细胞正上方，枪口距离藻斑5cm，扣动扳机进行轰击，每个平板轰击两次；轰击完毕后盖上培养皿上盖，将轰击过的藻置于黑暗条件下过渡培养，培养条件为25℃12h。蛋白核小球藻细胞在基因枪轰击藻落状态如图3所示。

(3)同质化培养：经过黑暗培养后，将藻细胞转移到装有20mlbg11液体培养基(链霉素终浓度为80μg/ml)的50ml锥形瓶中，在25℃、120rpm连续光照(500-1000lux)的培养箱内进行培养，摇瓶培养7d左右，将培养液在无菌条件下离心，收集藻细胞，弃去旧的培养基，重新加入新的加有链霉素的bg11培养基，逐级增加链霉素浓度，链霉素浓度梯度为80、100、120、150、180、200、300μg/ml每个浓度梯度进行3次继代培养，通过不断提高抗生素压力进行多轮继代培养，从而对转化藻进行筛选和同质化。最终，在抗生素压力筛选和同质化培养后存活的藻即为成功的转基因藻，可以实现目标基因的转化和目的产物的生产；同质化培养结果如图4所示。

取筛选到的转基因阳性藻，以转基因藻基因组dna为模板，扩增绿色荧光蛋白gfp基因序列，得到图5所示的结果，在700bp附近有明显的条带，符合gfp基因序列长度717bp。通过荧光显微镜观察可以清楚看到转基因蛋白核小球藻表达了绿素荧光蛋白，如图6所示，表明利用上述叶绿体转基因系统成功制备得到了表达绿色荧光蛋白的蛋白核小球藻。

序列表

<110>广东海洋大学

<120>一种蛋白核小球藻叶绿体转基因系统及其应用

<141>2020-09-03

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1483

<212>dna

<213>蛋白核小球藻(chlorellapyrenoidosa)

<400>1

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<212>dna

<213>蛋白核小球藻(chlorellapyrenoidosa)

<400>2

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<212>dna

<213>绿色荧光蛋白(gfp)

<400>3

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