基于SARS-CoV-2S蛋白RBD区域的靶向性外泌体及其制备方法与流程

本发明涉及一种基于sars-cov-2s蛋白rbd区域的靶向性外泌体及其制备方法，属于生物医药技术领域。

背景技术：

严重急性呼吸系统综合征ii型冠状病毒(sars-cov-2)是2019冠状病毒病(covid-19)的病因，死亡率一直处于上升态势，成为全球重大公共健康问题。到目前为止，还没有特异性的药物或疫苗得到正式批准。结构分析和病理观察确认sars-cov-2病毒进入组织器官是通过与宿主细胞上的血管紧张素转换酶2(ace-2)结合，病毒进入细胞取决于特异性识别ace2的sars-cov-2刺突蛋白(s)的受体结合域(rbd)。目前认为阻断rbd和ace2结合是开发疫苗、中和抗体和小分子药物对抗covid-19的主要潜在策略。

外泌体是由多种细胞类型分泌的天然运输纳米囊泡(约30-100nm)。目前已知外泌体能够将特定的功能性生物分子(如核酸，包括质粒dna和小干扰rna、抗体及小分子药物)输送到受体细胞或组织器官，发挥治疗特定疾病的能力。然而，已有研究表明，大多数静脉注射的外泌体被肝脏所吸收代谢，因此，需要通过对外泌体改造，使其具备靶向治疗能力，将外源性治疗药物递送到体内特定的组织或细胞。目前为止，并没有特异性运输治疗covid-19药物的靶向载体，本项发明通过对外泌体的改造，使其具备靶向sars-cov-2嗜性的组织器官，为运输相关特异性抗病毒药物提供靶向载体，实现对sars-cov-2感染的精准治疗。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供一种基于sars-cov-2s蛋白rbd区域的靶向性外泌体，能够高效、组织特异性的递送抗sars-cov-2潜在药物。

本发明的第一个目的是提供一种基于sars-cov-2s蛋白rbd区域的靶向性外泌体，所述靶向性外泌体上表达rbd-vsvg融合蛋白，所述的rbd-vsvg融合蛋白为sars-cov-2(严重急性呼吸系统综合征ii型冠状病毒)s蛋白(刺突蛋白)的rbd(受体结合域)替换vsvg(水泡性口炎病毒糖蛋白g)的胞外区域得到。

进一步地，所述的rbd-vsvg融合蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示。

进一步地，所述的rbd-vsvg融合蛋白的氮端设有信号肽。

进一步地，所述的信号肽的氨基酸序列如seqidno.2所示。

本发明的第二个目的是提供所述的靶向性外泌体的制备方法，包括如下步骤：

s1、以含有sars-cov-2的样本cdna为模板，pcr扩增获得rbd片段；

s2、体外合成vsvg的跨膜区及胞内区全长基因片段；

s3、将s1步骤的rbd片段和s2步骤的vsvg的跨膜区及胞内区全长基因片段进行连接，并连接到载体上得到表达载体；

s4、将s3步骤的表达载体转入宿主细胞中，培养后收集细胞培养上清，分离得到所述的靶向性外泌体。

进一步地，所述的宿主细胞为293t细胞或树突状细胞。

进一步地，所述的载体是pcmv载体。

进一步地，所述的分离包括如下步骤：将细胞培养上清在8000-15000g离心20-40min取上清液，将上清液经过微米膜过滤后在80000-120000g超速离心60-80min，取沉淀，将沉淀采用缓冲溶液重悬，再在80000-120000g超速离心60-80min，去除上清，得到所述的靶向性外泌体。

本发明的第三个目的是提供所述的靶向性外泌体在制备靶向治疗covid-19的药物中的应用，所述的应用是将特异性抗sars-cov-2的功能性生物分子转入到所述的靶向性外泌体中，得到所述的靶向治疗covid-19的药物。

进一步地，所述的功能性生物分子为小干扰rna、抗体或小分子药物。

本发明的有益效果：

本发明构建了能够高效、组织特异性的递送抗sars-cov-2潜在药物的靶向外泌体；利用靶向外泌体包裹sars-cov-2sirna，从而实现在组织器官中特异性抑制病毒复制。

在小鼠动物模型中，尾静脉注射外泌体包裹sars-cov-2sirna，能够显著抑制小鼠肺组织中的病毒复制量，减轻病毒感染引发的肺炎等症状。

附图说明

图1为利用sars-cov-2s蛋白的rbd区域替换水泡性口炎病毒糖蛋白g(vsvg)的细胞示意图；

图2为正常细胞外泌体与rbd标记的外泌体的透射电镜图；

图3为正常细胞外泌体与rbd标记的外泌体的纳米颗粒分析图；

图4为正常细胞外泌体与rbd标记的外泌体的免疫沉淀结果；

图5为正常细胞外泌体与rbd标记的外泌体的靶向富集效果图；

图6为正常细胞外泌体与rbd标记的外泌体携带活性抗病毒药物抑制病毒效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1：

1、设计rbd的引物(f：5’-atgtttcctaatattacaaacttgtgcc-3’，seqidno.3；r:5’-ttatgctggtgcatgtagaagttca-3’，seqidno.4)，以covid-19患者咽拭子样本cdna为模板，运用takarapcr试剂盒扩增获得rbd完整片段，2％的琼脂糖电泳，axygen切胶回收试剂盒进行dna产物纯化；体外合成vsvg跨膜区及胞内区全长dna，通过t4酶连插入到pcmv载体中，构建成pcmv-vsvg载体，测序验证序列；

2、将步骤1中pcr纯化回收后的rbd基因与pcmv-vsvg载体进行t4酶连，16℃反应过夜，构建成pcmv-rbd-vsvg载体，测序验证；通过载体转化，涂板，挑单克隆，进行扩大培养，并通过axygen质粒提取试剂盒提取pcmv-rbd-vsvg质粒载体；

图1是利用sars-cov-2s蛋白的rbd区域替换水泡性口炎病毒糖蛋白g(vsvg)的胞外区域，形成rbd与vsvg融合载体，转染进入细胞表达后，所产生的外泌体带有rbd-vsvg融合蛋白表达，其中胞外区为rbd蛋白，跨膜区及胞内区为vsvg蛋白的跨膜区及胞内区。cd9和cd63为外泌体特异性标记蛋白。

3、293t细胞铺板(100mm皿)，密度约60-70％，将步骤2中的pcmv-rbd-vsvg重组载体通过pei转染(质粒与pei质量比为1：3)细胞，6小时后，用无外泌体培养基培养换液，继续培养48小时后，收集细胞培养上清；

4、将收集的上清液首先在10000g，4度离心30分钟，去掉细胞碎片，将离心后的上清液通过0.22微米膜过滤后，在超速离心机(德国beckman)以100,000g，4度，离心70分钟，小心去掉上清液，加入适量pbs，将外泌体沉淀吹打悬浮混匀，再以100,000g，4度，70分钟离心，弃上清，用适量的pbs重悬，获得靶向外泌体，通过电镜技术和纳米粒径仪检测外泌体大小；

图2、图3分别通过透射电镜(tem)和纳米颗粒分析(nta)所提取的外泌体，与正常细胞分泌的外泌体(exo-nc)对比，rbd标记的外泌体(exo-rbd)在体积大小方面没有显著性差异，说明rbd的标记并没有影响到外泌体正常物理形态和特征。

图4通过外泌体免疫沉淀技术，用偶联rbd抗体的磁珠分别与正常细胞外泌体(exo-nc)和rbd标记的外泌体(exo-rbd)共孵育，通过磁力架分离，westernblot结果揭示rbd蛋白是表达在外泌体外膜上。

5、设计针对sars-cov-2的sirna并合成，通过电穿孔仪(bio-rad)把针对sars-cov-2基因组的特异性干扰rna(sirna)电转到所获得的靶向外泌体中，使靶向外泌体包裹sirna进行运载，使用比例为外泌体：sirna质量比1：1；在超速离心机(德国beckman)以100,000g，4度，离心70分钟，去除多余的sirna后，pbs悬浮外泌体沉淀；

6、以人源化ace2(sars-cov-2特异性受体)小鼠为模型，通过尾静脉注射靶向外泌体，150ug/只，从而实现sirna靶向递送到sars-cov-2嗜性的组织器官，感染病毒复制。

图5：将正常细胞外泌体(exo-nc)和rbd标记的外泌体(exo-rbd)分别通过did亲脂性染料标记荧光，通过尾静脉注射后人源化ace2小鼠，以24h为时间间隔，连续观察96h，结果发现exo-rbd能够显著靶向富集在小鼠肺组织，心脏以及肾组织中，且持续时间不低于96h，而未标记rbd蛋白的正常外泌体exo-nc未在上述组织中富集。

图6：通过滴鼻途径，使人源化ace2小鼠感染带有绿色荧光蛋白gfp的sars-cov-2假病毒，24h后，尾静脉分别注射携带有gfpsirna的正常细胞外泌体(exo-nc)和rbd标记的外泌体(exo-rbd)，48h后，通过组织免疫荧光检测小鼠肺组织中gfp荧光强度，结果发现携带有gfpsirna的rbd标记的外泌体能够先显著抑制sars-cov-2假病毒gfp的表达，说明rbd标记的外泌体能够作为有效载体，携带活性抗病毒药物靶向sars-cov-2嗜性组织(肺等)，从而抑制病毒致病性。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110>苏州大学

<120>基于sars-cov-2s蛋白rbd区域的靶向性外泌体及其制备方法

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>309

<212>prt

<213>（人工序列）

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