一种基于p53信号通路的药物筛选模型的构建方法和应用与流程

本发明属于医药领域，涉及一种以p53为靶点的药物筛选细胞模型，尤其涉及一种以具有野生型p53活性细胞为基础的药物筛选细胞模型；本发明同时还涉及该药物筛选细胞模型的构建方法和应用。

背景技术：

p53是一个肿瘤抑制蛋白，作为一个转录因子，p53由n端激活域、dna中央特定结合域和c-端四聚体化域组成，而且其调控域富含碱性氨基酸。p53半衰期很短，在26s蛋白酶体作用下，通过持续的泛素化和后期蛋白酶降解，p53在无刺激的哺乳类动物细胞中维持较低的含量。去磷酸化的p53在mdm2(鼠双微体基因-2)泛素连接酶作用下被泛素化。通过使p53的失活，mdm2扮演着p53抑癌基因的主要监视者。当细胞面临着dna损伤、缺氧、细胞因子、代谢改变、病毒感染或者致癌基因等刺激时，导致p53泛素化被抑制和p53在细胞核内积累，通过多个共价修饰包括磷酸化和乙酰化，p53被激活并稳定存在。

在所有肿瘤中p53是最频繁突变的蛋白，据估计有60％的肿瘤有变异形式，影响其生长抑制活动。突变的p53伴随着基因组的不稳定和增加肿瘤发生的概率，一方面丧失了肿瘤抑制活性；另一方面突变后的蛋白会产生新的癌基因活性，从而促进了肿瘤的发展。而野生型的p53被认为具有对肿瘤发生的保护性作用。针对p53野生型肿瘤领域的药物研发，最重要的思路是靶向p53的反向调控蛋白mdm2和mdmx。通过抑制剂结合mdm2/mdmx，阻止其与p53的结合，从而抑制了p53蛋白的降解过程，提高了细胞内部p53的蛋白水平。p53蛋白水平的提高，可以诱导肿瘤细胞中p53发挥启动细胞凋亡和细胞周期阻止的功能，从而有效抑制肿瘤细胞的生长和存活。因此，p53成为肿瘤治疗中靶点选择的热门候选之一。

基于上述原因，一直以来研究者们试图寻找特异性好，副作用低的野生型p53的激活剂，以最终用于临床，缓解和治疗数目庞大的相关患者；基于报告系统的高通量筛选方法虽已经出现并用于实践，取得了一定成效，但仍然有一些不可克服的缺点，比如需要外源刺激，这样不仅步骤多，而且筛选成本也较高，也会使报告系统的不稳定性增加(额外的操作必然会带来额外的不确定因素)。为此我们选取了基因背景上与肿瘤患者具有相似基因突变的肿瘤细胞系，建立luciferase报告基因筛选系统。旨在利用这一模拟天然的p53信号通路基因突变图谱的永生化肿瘤细胞系筛选体系，筛选得到更具有临床应用价值的p53信号通路激活剂。此外，基于这一模拟环境下筛选得到的p53信号通路激活剂的研究，也可以通过对激活剂靶标的逆向寻找，探索肿瘤细胞中参与p53信号通路调节的蛋白的种类和功能，有利于发现新的靶标蛋白，扩展对p53信号通路更深刻的认识。

技术实现要素：

本发明可提供一种以p53为靶点的药物筛选细胞模型。

本发明可提供一种以p53为靶点的药物筛选细胞模型的构建方法。

本发明还可提供一种以p53为靶点的药物筛选细胞模型在药物筛选中的应用方法。

(一)以p53为靶点的药物筛选细胞模型

根据已有文献中对p53通路的研究报告，发现选取了野生型p53细胞系hct-116，mcf-7和a549作为候选细胞系，为了进一步验证选取了针对mdm2的抑制剂sar405838靶向野生型p53细胞，作为阳性药物，用于检测给药后p53信号通路的变化。以突变型p53的抑制剂nsc59984靶向p53突变型细胞作为对照，附图2可以看到，野生型p53细胞hct-116中，加入mdm2抑制剂可以有效提高p53蛋白水平，从而诱导下游p21蛋白的表达。并且，加入激活剂sar405838后，p53活化体蛋白水平升高，说明这一活化信号受到阳性药物sar405838的有效调节，可以用于后续的luciferase模型构建。而突变型p53抑制剂对野生型细胞a549的p53信号通路影响较弱，说明抑制剂对突变型和野生型p53信号通路具有选择性，需要分别建立药物筛选系统。

本发明以p53为靶点的药物筛选细胞模型，是利用含有p53特异性结合序列的报告系统载体，以具有野生型p53的活性细胞hct-116、mcf-7和a549为基础，构建成稳定的以p53信号为靶点的高通量药物筛选细胞模型。

所述p53的特异性结合序列为5’-ggcctaactggccggtaccgctagcctcgatacgtttgccttgcctggacttgcctggccttgccttggacatgcccgggctgtcgcgcgtagatctgca-3’。

所述报告系统载体是在含有荧光素酶报告基因的报告载体pgm-lu中的多克隆位点中插入包含有p53特异性结合序列作为报告系统载体的响应序列构建成的报告系统载体。

所述具有野生型p53活性细胞为一类具有持续活化p53活性的hct-116、mcf-7和a549细胞。

(二)以p53为靶点的药物筛选细胞模型的构建方法

本发明以p53为靶点的药物筛选细胞模型的构建方法，包括以下工艺步骤：

(1)luciferase报告系统载体的构建：

利用分子生物学方法在含有荧光素酶报告基因的报告载体pgm-lu多克隆位点中插入包含有p53特异性结合序列，作为报告系统载体的响应序列，构建成报告系统载体。

这样插入序列位于荧光素酶报告基因的上游，当p53活化时，便可增强荧光素酶报告基因的转录和荧光素酶翻译，从而增强了荧光素酶的活性，加入荧光素酶底物时即可检测到更强的荧光；激活p53活性时，荧光素酶报告基因的转录和荧光素酶翻译的水平都升高，也就增强细胞内荧光素酶的活性，加入荧光素酶底物时荧光强度也就增强。

(2)细胞模型的构建：

a)受体细胞系的选择：检测多种人源肿瘤细胞系中p53信号蛋白的表达活性，界定野生型活化的候选细胞系；

b)蛋白水平检测p53通路活性：瞬时转染pgmp53-lu质粒后，加入阳性药物检测luciferase活性，调整转染方法、条件以及阳性药物或刺激因子的剂量、处理时间；

将所述报告系统载体转染hct-116、mcf-7和a549细胞中检测模型建立的可行性。附图2可以看到，hct-116、mcf-7和a549细胞中瞬转pgmp53-lu后，用g418进行阳性克隆筛选，产生明显的luciferase活性，并且加入阳性药物sar405838后，可以增强luciferase活性。这说明，pgmp53-lu可以在hct-116、mcf-7和a549细胞中进行luciferase转录，产生筛选活性。再经过3-4周的阳性单克隆的筛选得到单克隆细胞株即为以p53为靶点的药物筛选细胞模型。

(三)以p53为靶点的药物筛选细胞模型的应用

本发明以p53为靶点的药物筛选细胞模型具体药物筛选方法如下：

(1)将所述药物筛选细胞模型用100μl培养基接种于96孔板中，培养至细胞汇合度为50％～60％；

(2)培养基中加入待筛选化合物10μm，继续培养24小时；

(3)在96孔板中加入10μl稳定型荧光素酶底物，使用酶标仪测定荧光强度并分析荧光激活率，当荧光激活率达到200％以上得到初筛产物；

(4)以化合物细胞毒性实验mtt法消除初筛产物对细胞模型的直接损伤，荧光激活率仍在200％以上得到复筛产物，即为以p53为靶点的激活剂。

本发明与现有技术相比较，本发明的实施效果如下：

以p53信号通路为靶点，采用基于具有野生型p53活性(即持续p53活性)的细胞系为策略，使报告系统本身在细胞中处于高度活化状态，无需使用外加刺激，得到的稳定细胞模型可直接用于化合物的筛选；不仅大大降低了筛选的成本，同时也使整个筛选流程从细胞培养→激活p53→加化合物→检测简化为细胞培养→加化合物→检测，缩短了筛选的周期，减少了操作步骤，提升系统稳定性、高效性及易用性，更适用于高通量药物筛选。

附图说明

图1为所用报告载体pgmp53-lu基本骨架和插入序列；

图2为使用western-blot方法检测本发明所涉及的细胞中p53活性结果；

图3为转染hct-116、mcf-7和a549细胞检测报告系统载体pgmp53-lu响应能力；

图4为p53报告系统的应用。

具体实施方式

下面将结合具体的实施例来说明本发明的内容。

实施例

下面通过具体实施例对本发明以p53为靶点的药物筛选细胞模型的构建方法和应用做进一步说明。实验中所采用的仪器和试剂如下：

仪器：perkinelmervictor3荧光/化学发光分析仪；biorad蛋白质电泳及转印系统；tanon4200multi全自动荧光/化学发光成像分析系统。

试剂：萤火虫荧光素酶测定试剂盒购自promega公司；sar405838以及g418购自sigma-aldrich公司；96孔板购自corning公司；dmem(高糖)及胎牛血清购自hyclone(thermo公司)，转染试剂lipofectamine^tm3000transfectionreagent购自thermo公司；筛选的化合物由上海陶素生化提供；抗体购自cellsignalingtechnology公司。限制性内切酶及t4dna连接酶等购自fermentas公司；pvdf膜(millipore)；bca蛋白定量试剂盒(thermo公司)；ecl发光液(perkinelmer)；mtt干粉、序列合成及测序等，由生工生物提供；cocktail购自roche。

1、报告系统载体构建

利用分子生物学方法在含有荧光素酶报告基因的报告载体pgm-lu多克隆位点中插入包含有p53特异性结合序列，作为报告系统载体的响应序列，构建成报告系统载体。将人工合成的5’-ggcctaactggccggtaccgctagcctcgatacgtttgccttgcctggacttgcctggccttgccttggacatgcccgggctgtcgcgcgtagatctgca-3’dna片段，以kpni和hindⅲ的酶切位点插入到报告载体pgm-lu中，得到的报告系统载体命名为pgmp53-lu。报告载体图谱和完整插入序列如下附图1：具体步骤如下：

1.1、提取pgm-lu质粒并做kpni和hindⅲ的双酶切，取10μgpgm-lu，各3μl的kpn1和hindⅲ于37℃做双酶切8小时，琼脂糖凝胶电泳后进行产物的回收纯化，得到产物1；再将两条带有粘性末端的含有p53特异性结合序列的互补片段：5ggcctaactggccggtaccgctagcctcgatacgtttgccttgcctggacttgcctggccttgccttggacatgcccgggctgtcgcgcgtagatctgca-3进行稀释退火，将两端互补引物稀释成50μm的水溶液，分别取15μl混合均匀，95℃沸水浴放置5分钟，再停止加热于水浴中自然冷却至室温，得到产物2；

1.2、将上述两种产物1和2以摩尔比1:3的比例在dna连接酶下进行连接，16℃过夜处理；

1.3、将上述连接产物于感受态大肠杆菌dh5α下进行转化，并在氨苄抗性培养板上培养，37℃过夜处理；

1.4、挑取4-5个克隆，在lb培养基上分别培养至细菌生长对数期，测序无误则表明插入序列成功，由此得到重组载体pgmp53-lu。

2、报告系统载体性能测试

首先检测多种人源肿瘤细胞系中p53信号蛋白的表达活性，界定野生型活化的候选细胞系以检测模型建立的可行性，结果见附图2。具体操作步骤如下：

2.1、hct-116、mcf-7和a549细胞于12孔板生长，当细胞汇合度为50％～60％时，用sar405838(2μm)处理8小时，突变型p53的抑制剂nsc59984(50μm)靶向p53突变型细胞，作为对照，提取总蛋白进行western-blot。

2.2、蛋白提取：将培养皿中细胞刮下后收集好，离心后吸走上清使用裂解液裂解细胞，并转移到预冷的离心管中离心、取上清，进行bca蛋白定量，样品加入5×蛋白上样缓冲液处理，随后进行western-blot分析。

2.3、western-blot分析：配制8％sds-page凝胶，电泳，然后将凝胶浸泡至预冷的转膜缓冲液中，甲醇处理pvdf膜，进行三明治转膜。取出转印好的pvdf膜，蛋白面向上，室温封闭；一抗选用p53、p21以及作为内参的gapdh配制4℃孵育过夜，tbst清洗5次，每次5分钟；二抗，tbst清洗pvdf膜4次，每次10分钟。加ecl于4200multi全自动荧光/化学发光成像分析系统显影曝光。

随后以此细胞作为载体细胞检测重组载体的性能，结果见附图3(实验重复3次，取平均值，误差棒表示±sd，其中*为p＜0.05显著性标注，**为p＜0.01显著性标注)，具体步骤如下：

2.4、hct-116、mcf-7和a549细胞于96孔板生长，当细胞汇合度为50％～60％时，转染pgmp53-lu(100ng/孔)，p30000.2μl+100ngdna+无血清无双抗培养基，5μl体系；lipo30000.2μl+无血清无双抗培养基，5μl体系，上述两种体系混合温静置20分钟，再加入90μl无双抗完全dmem，混匀后加入96孔板各孔内，24小时以后，用sar405838(5μm)处理8小时，对照组以dmso代替进行荧光素酶活性的检测。

2.5、上述处理后，吸去培养基，每孔加入20μl荧光素酶检测底物，轻摇5分钟，使用荧光/化学发光分析仪立即测定荧光素酶的活性，对照及处理各3个重复。即分为未转染组(blank)、转染未加阳性药物组(p53-nc)以及转染加阳性药物组(p53-pc)。附图3可以看到，hct-116、mcf-7和a549细胞中瞬转pgmp53-lu后，产生明显的luciferase活性，并且加入阳性药物sar405838后，可以升高luciferase活性的变化。

3、药物筛选模型构建及性能测试

培养hct-116、mcf-7和a549细胞，至细胞密度达到60％时，进行pgmp53-lu重组载体的稳定转染，48小时后以1:3比例传代，加入g418进行阳性克隆的筛选，最初使用浓度为10μg/ml，处理2周后用5μg/ml维持，待3周左右形成克隆，用胰酶消化将每个克隆转入96孔板中，再依次转入48孔板、6孔板直到10cmdish中冻存。将得到的每个克隆都进行荧光素酶活性鉴定，首先选取荧光素酶阳性的克隆，再检测这些克隆是否响应正常，由于即使野生型活化，信号通路一般还能对外加细胞因子有所反应，故所选阳性克隆的荧光素酶活性在细胞因子刺激时应当还能有所增加；并且由于是野生型活化，p53信号通路的激活剂应当能使荧光素酶的活性升高，最终得到稳定转染的细胞株。

4、基于p53信号通路的药物筛选模型的应用

4.1、将上述筛选系统细胞接种于96孔板中，培养至细胞密度为50％～60％；加入待筛选化合物0.2μl(20μm)，继续培养24小时，然后在对应96孔板中加入20μl稳定型荧光素酶底物，使用荧光/化学发光分析仪测定荧光强度并分析荧光增强率。试检测化合物13种，把这13种化合物浓度减半再次筛选，并以化合物细胞毒性mtt实验消除化合物对细胞的直接毒性作用，得到对药物筛选细胞模型荧光素酶活性激活约在2倍以上的化合物3种，结果见附图4(实验重复3次，取平均值，误差棒表示±sd，其中*为p＜0.05显著性标注)，后续可选取其中响应最好的4号、7号和12号化合物做进一步探索。

上述实验证明，通过以p53为靶点的药物筛选细胞模型复筛得到的化合物确为以p53为靶点的抗肿瘤药物，从而证明该药物筛选细胞模型的有效性。本发明以p53为靶点的药物筛选细胞模型能取得便捷、快速、高效的筛选效果。

以上内容是结合具体的实施例对本发明所作的详细说明，不能认定本发明具体实施仅限于这些说明。对于本发明所属技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明保护的范围。

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