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您当前的位置： 猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的制备方法与流程
2021-02-02 18:02:17|
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起点商标网 本发明属于生物制品领域，具体涉及猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的制备方法。
背景技术：
：猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种高度接触性传染病，该病最早于1987年报道于美国，而后在欧洲和亚洲地区相继都有报道。因患猪耳部等处发绀变蓝，故命名为“猪蓝耳病”。因为该病主要以妊娠母猪的繁殖障碍(流产、早产、死胎、木乃伊胎)及仔猪的呼吸道症状为特征，故1992年国际猪病学术会议上正式命名为“猪繁殖与呼吸综合征”。该病有2个基因型，分别是以vr-2332株为代表毒株的美洲原型和以lv毒株为代表的欧洲原型。美洲原型主要流行于美国、加拿大和亚洲国家，欧洲原型则主要流行于欧洲和亚洲。我国于1995年在北京地区发生该病，此后迅速蔓延到全国所有省份，给养猪业造成了巨大的危害。1996年中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的郭宝清研究员等首次自北京郊区某规模化猪场的死胎中分离到prrsv流行株ch-1a株。在2004年至2005年，经典弱毒疫苗开始使用。2006年，我国出现一种高致病性猪蓝耳病，其发病率和死亡率较经典的prrsv明显增强，并随后在越南、老挝等东南亚国家暴发流行，成为影响我国及东南亚养猪业最为严重的一种疫病。该病以高度接触性传播、全身出血、肺部实变和母猪繁殖障碍为特征，仔猪、育肥猪、和成年猪均可发病和死亡。其中仔猪发病100％，死亡率达50％以上，母猪流产率可达30％以上。该病主要传播途径是直接传播和间接传播，也可发生垂直传播。病毒污染的气溶胶和媒介昆虫、鸟类、运输工具均可引起prrsv的传播。目前，与大多数病毒性疾病的防治相同，对猪繁殖与呼吸综合征的防治仍以疫苗免疫预防为主。而商品化的猪繁殖与呼吸综合征疫苗主要是灭活疫苗和弱毒疫苗两种传统常规疫苗。弱毒疫苗相对于灭活疫苗能够更加有效的刺激猪体产生坚强而持久的免疫力，降低临床发病率以及疾病严重性，提高猪只日增重等生产性能。目前，弱毒疫苗的代表毒株为ch-1r株，该毒株遗传性能稳定，能在marc-145细胞上快速扩繁。有文献表明prrsv毒株在接种细胞6小时后，可见核衣壳从光面内质网和高尔机体内见到成熟的有囊膜的病毒粒子。病毒的复制在胞浆中进行，在感染9-12小时后，成熟的病毒粒子通过细胞胞吐作用从感染细胞释放。目前国内猪繁殖与呼吸综合征病毒的疫苗抗原生产主要采用转瓶培养方法，少数采用微载体悬浮培养方法，而全悬浮的培养方式更是少数。目前转瓶培养存在以下问题：①半成品抗原效价偏低(107.0-7.6tcid50/ml左右)，②转瓶数量较多，生产工艺劳动强度大，③培养基中含有一定浓度的血清，其制备的抗原中杂蛋白会比较多，易造成免疫动物的应激反应，④生产周期长、成本偏高。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的制备方法，该方法既可以提高抗原的产量及效价，又可以减少过敏反应，缩短细胞生长周期，提升抗原的整体品质。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的制备方法，包括以下步骤：1)细胞优化：细胞从低温液氮罐中复苏后，进行贴壁生长，待细胞第一次长满致密单层后(通常需3-4天)，用0.25％edta-胰酶进行消化，用含10％新生牛血清的细胞培养液进行吹打，将细胞吹打成大多为单个细胞悬液后，按1:1的比例将细胞悬液全部装入一个一次性培养瓶中，进行贴壁培养，待培养15-30min后，将未贴壁的细胞全部弃去，培养瓶中加入新鲜培养液，继续培养已贴壁的细胞；2)细胞传代与扩大：第一次优化后细胞的生长周期变为2天，将细胞用胰酶进行消化，用含9％新生牛血清的细胞培养液进行吹打，将细胞吹打成大多为单个细胞悬液后，按1:3-1:4的比例将细胞悬液分装、补足细胞培养液，进行贴壁培养，培养瓶从t75-t175-5l-10l进行逐级扩大，方瓶扩大到转瓶，需保证培养瓶的细胞密度不少于1×106个/ml；细胞传代与扩大中胰酶为：质量分数为0.25％的胰酶和0.02％的edta的pbs溶液的混合液；细胞传代中与扩大中胞培养液为：mem培养基、血清、抗生素和碳酸氢钠的混合液，其中血清的含量为9％，混合液的ph值为7.2-7.6；3)细胞补液：每次传代30小时后，补充10-20％新鲜纯mem培养液；4)细胞接毒：将待接毒的健康细胞培养液全部弃去，补入等量的不含血清的维持液，将猪繁殖与呼吸综合征病毒(ch-1r株)生产用毒种按1-3％的接种剂量接入以上维持液中，继续培养至收获；细胞接毒时使用的维持液为：mem培养基、碳酸氢钠和抗生素的混合液，其中抗生素的含量为50iu/ml，且混合液的ph值为7.4—7.6；5)抗原收获：抗原一收：将带毒细胞培养18-28小时，第一次收获含毒维持液，抗原一收时只收获上清液，然后往细胞瓶中补入一定量的维持液，继续培养细胞；抗原二收：将一收结束后的带毒细胞培养18-24小时，第二次收获含毒维持液，抗原二收时将细胞瓶壁上的细胞弃去，只收获上清液。6)分装冻干将一收和二收收获的抗原，按一定比例加入含免疫增强剂的冻干保护剂，混匀分装制成冻干活疫苗，即为猪繁殖与呼吸综合征活疫苗。本发明具有以下有益效果：1、本发明待复苏细胞长满致密单层后，消化细胞，筛选贴壁较快的细胞进行扩繁，可将转瓶细胞密度由原来的2×105/ml左右提升至2×106/ml，通过增加细胞密度来提高抗原效价。2、调整细胞传代比例，缩短细胞传代周期：marc-145的细胞传代比例为1：2时，细胞传代周期为48小时：当比例为1:3时，细胞的生长周期为72小时。本发明的传代比例为1:3-1:4，细胞生长周期为48小时。3、抗原收获方式改变：现有技术是待细胞接毒后80％细胞出现细胞病变(通常48-72小时)，再将病毒收获。本发明通过实验证明细胞接毒后18-28小时上清液中就可以产生大量的高浓度蛋白，此时细胞并未出现较大的损伤及非常明显的病变，还可以补入新鲜的培养液继续培养病毒，实现第二次收获。本发明不仅将半成品抗原效价由原来的107.0～107.6tcid50/ml左右，提升至108.0～108.75tcid50/ml左右，还增加了抗原收获次数，提高了抗原产量。同时，直接收获培养上清液，剔除了大部分细胞骨架(细胞骨架内含大量蛋白)，减少了使用时的应激反应，且减少了冻融细胞次数和刮苗的步骤，可以减少病毒的冻损及降低了操作人员劳动强度，减少了操作时间。4、本发明对接毒后的细胞采用无血清的维持液培养，收获的抗原不含血清，大大减少异源杂蛋白造成免疫动物应激反应。具体实施方式实施例1一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的制备方法，包括以下步骤1)细胞优化：细胞从低温液氮罐中复苏后，进行贴壁生长，待细胞第一次长满致密单层后，用0.25％edta-胰酶进行消化，用含10％新生牛血清的细胞培养液进行吹打，将细胞吹打成大多为单个细胞悬液后，按1:1的比例将细胞悬液全部装入一个一次性培养瓶中，进行贴壁培养，待培养20min后，将未贴壁的细胞全部弃去，培养瓶中加入新鲜培养液，继续培养已贴壁的细胞；2)细胞传代与扩大：第一次优化后细胞的生长周期变为2天，将细胞用胰酶进行消化，用含9％新生牛血清的细胞培养液进行吹打，将细胞吹打成大多为单个细胞悬液后，按1:3的比例将细胞悬液分装、补足细胞培养液，进行贴壁培养，培养瓶从t75-t175-5l-10l进行逐级扩大，方瓶扩大到转瓶，需保证培养瓶的细胞密度不少于1×106个/ml；细胞传代中使用的胰酶为：质量分数为0.25％的胰酶和0.02％的edta的pbs溶液的混合液；细胞传代中使用的细胞培养液为：mem培养基、血清、抗生素和碳酸氢钠的混合液，其中血清的含量为9％，细胞培养液的ph值为7.4；3)细胞补液：每次传代30小时后，补充15％新鲜纯mem培养液，细胞补液对细胞密度的影响如表1所示：表1细胞补液对细胞密度的影响备注：a为细胞传代后不采取任何措施，48h测定细胞密度。b为细胞传代30小时后补充10-20％的纯mem溶液后，继续培养直至48h测定其密度。每次试验a与b均是由同一瓶细胞消化后，均匀分装细胞悬液而制得。4)细胞接毒：将待接毒的健康细胞培养液全部弃去，补入等量的不含血清的维持液，将猪繁殖与呼吸综合征病毒(ch-1r株)生产用毒种按2％的接种剂量接入以上维持液中，继续培养至收获；细胞接毒时使用的维持液为：mem培养基、碳酸氢钠和抗生素的混合液，其中抗生素的含量为50iu/ml，且混合液的ph值为7.5；接毒时工艺由加2％血清改为不含血清的维持液，其原因有3点：(1)细胞已经长满致密单层，受到接触抑制的作用，几乎不会再分裂生长；(2)添加的2％血清直接含在抗原里，只注射疫苗时容易引起动物的应激反应；(3)添加2％血清对抗原效价没有明显影响。表2维持液是否添加血清培养的抗原效价对比(效价单位-lgtcid50/ml)试验批次接毒时加入2％血清接毒时补入不含血清的维持液18.1258.2528.08.12538.3758.37548.58.37558.258.255)抗原收获：抗原一收：将带毒细胞培养24小时，第一次收获含毒维持液，抗原一收时只收获上清液，然后往细胞瓶中补入一定量的维持液，继续培养细胞；抗原二收：将一收结束后的带毒细胞培养24小时，第二次收获含毒维持液，抗原二收时将细胞瓶壁上的细胞弃去，只收获上清液。本发明抗原收获时只收取上清液的方法与传统收取细胞悬液方法的效价对比如表3所示。表3不同收毒方法对抗原效价的影响(效价单位-lgtcid50/ml)备注:1、上清液就是收获时只有维持液，细胞悬液就是收获时连同细胞一起冻融后收取的维持液及细胞瓶内的细胞碎片。为了条件一致，上清液的效价也是冻融一次后测定效价。抗原一收和抗原二收效价如表4所示。表4同一批细胞抗原一收与抗原二收的效价对比(效价单位-lgtcid50/ml)试验批次一收二收18.6258.37528.58.2538.1258.048.3758.2558.58.125本发明还针对不同时间上清液的效价进行了对比，结果如表5所示。表5细胞各个时间段的效价对比(效价单位-lgtcid50/ml)6)分装冻干将一收和二收收获的抗原，按一定比例加入含免疫增强剂的冻干保护剂，混匀分装制成冻干活疫苗，即为猪繁殖与呼吸综合征活疫苗。实施例2一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的制备方法，包括以下步骤1)细胞优化：细胞从低温液氮罐中复苏后，进行贴壁生长，待细胞第一次长满致密单层后，用0.25％edta-胰酶进行消化，用含10％新生牛血清的细胞培养液进行吹打，将细胞吹打成大多为单个细胞悬液后，按1:1的比例将细胞悬液全部装入一个一次性培养瓶中，进行贴壁培养，待培养15min后，将未贴壁的细胞全部弃去，培养瓶中加入新鲜培养液，继续培养已贴壁的细胞；2)细胞传代与扩大：第一次优化后细胞的生长周期变为2天，将细胞用胰酶进行消化，用含9％新生牛血清的细胞培养液进行吹打，将细胞吹打成大多为单个细胞悬液后，按1:3的比例将细胞悬液分装、补足细胞培养液，进行贴壁培养，培养瓶从t75-t175-5l-10l进行逐级扩大，方瓶扩大到转瓶，需保证培养瓶的细胞密度不少于1×106个/ml；细胞传代中使用的胰酶为：质量分数为0.25％的胰酶和0.02％的edta的pbs溶液的混合液；细胞传代中使用的细胞培养液为：mem培养基、血清、抗生素和碳酸氢钠的混合液，其中血清的含量为9％，细胞培养液的ph值为7.2；3)细胞补液：每次传代30小时后，补充10％新鲜纯mem培养液；4)细胞接毒：将待接毒的健康细胞培养液全部弃去，补入等量的不含血清的维持液，将猪繁殖与呼吸综合征病毒(ch-1r株)生产用毒种按1％的接种剂量接入以上维持液中，继续培养至收获；细胞接毒时使用的维持液为：mem培养基、碳酸氢钠和抗生素的混合液，其中抗生素的含量为50iu/ml，且混合液的ph值为7.4；5)抗原收获：抗原一收：将带毒细胞培养18小时，第一次收获含毒维持液，抗原一收时只收获上清液，然后往细胞瓶中补入一定量的维持液，继续培养细胞；抗原二收：将一收结束后的带毒细胞培养18小时，第二次收获含毒维持液，抗原二收时将细胞瓶壁上的细胞弃去，只收获上清液。6)分装冻干将一收和二收收获的抗原，按一定比例加入含免疫增强剂的冻干保护剂，混匀分装制成冻干活疫苗，即为猪繁殖与呼吸综合征活疫苗。实施例3一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的制备方法，包括以下步骤1)细胞优化：细胞从低温液氮罐中复苏后，进行贴壁生长，待细胞第一次长满致密单层后，用0.25％edta-胰酶进行消化，用含10％新生牛血清的细胞培养液进行吹打，将细胞吹打成大多为单个细胞悬液后，按1:1的比例将细胞悬液全部装入一个一次性培养瓶中，进行贴壁培养，待培养30min后，将未贴壁的细胞全部弃去，培养瓶中加入新鲜培养液，继续培养已贴壁的细胞；2)细胞传代与扩大：第一次优化后细胞的生长周期变为2天，将细胞用胰酶进行消化，用含9％新生牛血清的细胞培养液进行吹打，将细胞吹打成大多为单个细胞悬液后，按1:4的比例将细胞悬液分装、补足细胞培养液，进行贴壁培养，培养瓶从t75-t175-5l-10l进行逐级扩大，方瓶扩大到转瓶，需保证培养瓶的细胞密度不少于1×106个/ml；细胞传代中使用的胰酶为：质量分数为0.25％的胰酶和0.02％的edta的pbs溶液的混合液；细胞传代中使用的细胞培养液为：mem培养基、血清、抗生素和碳酸氢钠的混合液，其中血清的含量为9％，细胞培养液的ph值为7.6；3)细胞补液：每次传代30小时后，补充20％新鲜纯mem培养液4)细胞接毒：将待接毒的健康细胞培养液全部弃去，补入等量的不含血清的维持液，将猪繁殖与呼吸综合征病毒(ch-1r株)生产用毒种按3％的接种剂量接入以上维持液中，继续培养至收获；细胞接毒时使用的维持液为：mem培养基、碳酸氢钠和抗生素的混合液，其中抗生素的含量为50iu/ml，且混合液的ph值为7.6；5)抗原收获：抗原一收：将带毒细胞培养28小时，第一次收获含毒维持液，抗原一收时只收获上清液，然后往细胞瓶中补入一定量的维持液，继续培养细胞；抗原二收：将一收结束后的带毒细胞培养24小时，第二次收获含毒维持液，抗原二收时将细胞瓶壁上的细胞弃去，只收获上清液；6)分装冻干将一收和二收收获的抗原，按一定比例加入含免疫增强剂的冻干保护剂，混匀分装制成冻干活疫苗，即为猪繁殖与呼吸综合征活疫苗。当前第1页1 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：猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种高度接触性传染病，该病最早于1987年报道于美国，而后在欧洲和亚洲地区相继都有报道。因患猪耳部等处发绀变蓝，故命名为“猪蓝耳病”。因为该病主要以妊娠母猪的繁殖障碍(流产、早产、死胎、木乃伊胎)及仔猪的呼吸道症状为特征，故1992年国际猪病学术会议上正式命名为“猪繁殖与呼吸综合征”。该病有2个基因型，分别是以vr-2332株为代表毒株的美洲原型和以lv毒株为代表的欧洲原型。美洲原型主要流行于美国、加拿大和亚洲国家，欧洲原型则主要流行于欧洲和亚洲。我国于1995年在北京地区发生该病，此后迅速蔓延到全国所有省份，给养猪业造成了巨大的危害。1996年中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的郭宝清研究员等首次自北京郊区某规模化猪场的死胎中分离到prrsv流行株ch-1a株。在2004年至2005年，经典弱毒疫苗开始使用。2006年，我国出现一种高致病性猪蓝耳病，其发病率和死亡率较经典的prrsv明显增强，并随后在越南、老挝等东南亚国家暴发流行，成为影响我国及东南亚养猪业最为严重的一种疫病。该病以高度接触性传播、全身出血、肺部实变和母猪繁殖障碍为特征，仔猪、育肥猪、和成年猪均可发病和死亡。其中仔猪发病100％，死亡率达50％以上，母猪流产率可达30％以上。该病主要传播途径是直接传播和间接传播，也可发生垂直传播。病毒污染的气溶胶和媒介昆虫、鸟类、运输工具均可引起prrsv的传播。目前，与大多数病毒性疾病的防治相同，对猪繁殖与呼吸综合征的防治仍以疫苗免疫预防为主。而商品化的猪繁殖与呼吸综合征疫苗主要是灭活疫苗和弱毒疫苗两种传统常规疫苗。弱毒疫苗相对于灭活疫苗能够更加有效的刺激猪体产生坚强而持久的免疫力，降低临床发病率以及疾病严重性，提高猪只日增重等生产性能。目前，弱毒疫苗的代表毒株为ch-1r株，该毒株遗传性能稳定，能在marc-145细胞上快速扩繁。有文献表明prrsv毒株在接种细胞6小时后，可见核衣壳从光面内质网和高尔机体内见到成熟的有囊膜的病毒粒子。病毒的复制在胞浆中进行，在感染9-12小时后，成熟的病毒粒子通过细胞胞吐作用从感染细胞释放。目前国内猪繁殖与呼吸综合征病毒的疫苗抗原生产主要采用转瓶培养方法，少数采用微载体悬浮培养方法，而全悬浮的培养方式更是少数。目前转瓶培养存在以下问题：①半成品抗原效价偏低(107.0-7.6tcid50/ml左右)，②转瓶数量较多，生产工艺劳动强度大，③培养基中含有一定浓度的血清，其制备的抗原中杂蛋白会比较多，易造成免疫动物的应激反应，④生产周期长、成本偏高。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的制备方法，该方法既可以提高抗原的产量及效价，又可以减少过敏反应，缩短细胞生长周期，提升抗原的整体品质。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的制备方法，包括以下步骤：1)细胞优化：细胞从低温液氮罐中复苏后，进行贴壁生长，待细胞第一次长满致密单层后(通常需3-4天)，用0.25％edta-胰酶进行消化，用含10％新生牛血清的细胞培养液进行吹打，将细胞吹打成大多为单个细胞悬液后，按1:1的比例将细胞悬液全部装入一个一次性培养瓶中，进行贴壁培养，待培养15-30min后，将未贴壁的细胞全部弃去，培养瓶中加入新鲜培养液，继续培养已贴壁的细胞；2)细胞传代与扩大：第一次优化后细胞的生长周期变为2天，将细胞用胰酶进行消化，用含9％新生牛血清的细胞培养液进行吹打，将细胞吹打成大多为单个细胞悬液后，按1:3-1:4的比例将细胞悬液分装、补足细胞培养液，进行贴壁培养，培养瓶从t75-t175-5l-10l进行逐级扩大，方瓶扩大到转瓶，需保证培养瓶的细胞密度不少于1×106个/ml；细胞传代与扩大中胰酶为：质量分数为0.25％的胰酶和0.02％的edta的pbs溶液的混合液；细胞传代中与扩大中胞培养液为：mem培养基、血清、抗生素和碳酸氢钠的混合液，其中血清的含量为9％，混合液的ph值为7.2-7.6；3)细胞补液：每次传代30小时后，补充10-20％新鲜纯mem培养液；4)细胞接毒：将待接毒的健康细胞培养液全部弃去，补入等量的不含血清的维持液，将猪繁殖与呼吸综合征病毒(ch-1r株)生产用毒种按1-3％的接种剂量接入以上维持液中，继续培养至收获；细胞接毒时使用的维持液为：mem培养基、碳酸氢钠和抗生素的混合液，其中抗生素的含量为50iu/ml，且混合液的ph值为7.4—7.6；5)抗原收获：抗原一收：将带毒细胞培养18-28小时，第一次收获含毒维持液，抗原一收时只收获上清液，然后往细胞瓶中补入一定量的维持液，继续培养细胞；抗原二收：将一收结束后的带毒细胞培养18-24小时，第二次收获含毒维持液，抗原二收时将细胞瓶壁上的细胞弃去，只收获上清液。6)分装冻干将一收和二收收获的抗原，按一定比例加入含免疫增强剂的冻干保护剂，混匀分装制成冻干活疫苗，即为猪繁殖与呼吸综合征活疫苗。本发明具有以下有益效果：1、本发明待复苏细胞长满致密单层后，消化细胞，筛选贴壁较快的细胞进行扩繁，可将转瓶细胞密度由原来的2×105/ml左右提升至2×106/ml，通过增加细胞密度来提高抗原效价。2、调整细胞传代比例，缩短细胞传代周期：marc-145的细胞传代比例为1：2时，细胞传代周期为48小时：当比例为1:3时，细胞的生长周期为72小时。本发明的传代比例为1:3-1:4，细胞生长周期为48小时。3、抗原收获方式改变：现有技术是待细胞接毒后80％细胞出现细胞病变(通常48-72小时)，再将病毒收获。本发明通过实验证明细胞接毒后18-28小时上清液中就可以产生大量的高浓度蛋白，此时细胞并未出现较大的损伤及非常明显的病变，还可以补入新鲜的培养液继续培养病毒，实现第二次收获。本发明不仅将半成品抗原效价由原来的107.0～107.6tcid50/ml左右，提升至108.0～108.75tcid50/ml左右，还增加了抗原收获次数，提高了抗原产量。同时，直接收获培养上清液，剔除了大部分细胞骨架(细胞骨架内含大量蛋白)，减少了使用时的应激反应，且减少了冻融细胞次数和刮苗的步骤，可以减少病毒的冻损及降低了操作人员劳动强度，减少了操作时间。4、本发明对接毒后的细胞采用无血清的维持液培养，收获的抗原不含血清，大大减少异源杂蛋白造成免疫动物应激反应。具体实施方式实施例1一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的制备方法，包括以下步骤1)细胞优化：细胞从低温液氮罐中复苏后，进行贴壁生长，待细胞第一次长满致密单层后，用0.25％edta-胰酶进行消化，用含10％新生牛血清的细胞培养液进行吹打，将细胞吹打成大多为单个细胞悬液后，按1:1的比例将细胞悬液全部装入一个一次性培养瓶中，进行贴壁培养，待培养20min后，将未贴壁的细胞全部弃去，培养瓶中加入新鲜培养液，继续培养已贴壁的细胞；2)细胞传代与扩大：第一次优化后细胞的生长周期变为2天，将细胞用胰酶进行消化，用含9％新生牛血清的细胞培养液进行吹打，将细胞吹打成大多为单个细胞悬液后，按1:3的比例将细胞悬液分装、补足细胞培养液，进行贴壁培养，培养瓶从t75-t175-5l-10l进行逐级扩大，方瓶扩大到转瓶，需保证培养瓶的细胞密度不少于1×106个/ml；细胞传代中使用的胰酶为：质量分数为0.25％的胰酶和0.02％的edta的pbs溶液的混合液；细胞传代中使用的细胞培养液为：mem培养基、血清、抗生素和碳酸氢钠的混合液，其中血清的含量为9％，细胞培养液的ph值为7.4；3)细胞补液：每次传代30小时后，补充15％新鲜纯mem培养液，细胞补液对细胞密度的影响如表1所示：表1细胞补液对细胞密度的影响备注：a为细胞传代后不采取任何措施，48h测定细胞密度。b为细胞传代30小时后补充10-20％的纯mem溶液后，继续培养直至48h测定其密度。每次试验a与b均是由同一瓶细胞消化后，均匀分装细胞悬液而制得。4)细胞接毒：将待接毒的健康细胞培养液全部弃去，补入等量的不含血清的维持液，将猪繁殖与呼吸综合征病毒(ch-1r株)生产用毒种按2％的接种剂量接入以上维持液中，继续培养至收获；细胞接毒时使用的维持液为：mem培养基、碳酸氢钠和抗生素的混合液，其中抗生素的含量为50iu/ml，且混合液的ph值为7.5；接毒时工艺由加2％血清改为不含血清的维持液，其原因有3点：(1)细胞已经长满致密单层，受到接触抑制的作用，几乎不会再分裂生长；(2)添加的2％血清直接含在抗原里，只注射疫苗时容易引起动物的应激反应；(3)添加2％血清对抗原效价没有明显影响。表2维持液是否添加血清培养的抗原效价对比(效价单位-lgtcid50/ml)试验批次接毒时加入2％血清接毒时补入不含血清的维持液18.1258.2528.08.12538.3758.37548.58.37558.258.255)抗原收获：抗原一收：将带毒细胞培养24小时，第一次收获含毒维持液，抗原一收时只收获上清液，然后往细胞瓶中补入一定量的维持液，继续培养细胞；抗原二收：将一收结束后的带毒细胞培养24小时，第二次收获含毒维持液，抗原二收时将细胞瓶壁上的细胞弃去，只收获上清液。本发明抗原收获时只收取上清液的方法与传统收取细胞悬液方法的效价对比如表3所示。表3不同收毒方法对抗原效价的影响(效价单位-lgtcid50/ml)备注:1、上清液就是收获时只有维持液，细胞悬液就是收获时连同细胞一起冻融后收取的维持液及细胞瓶内的细胞碎片。为了条件一致，上清液的效价也是冻融一次后测定效价。抗原一收和抗原二收效价如表4所示。表4同一批细胞抗原一收与抗原二收的效价对比(效价单位-lgtcid50/ml)试验批次一收二收18.6258.37528.58.2538.1258.048.3758.2558.58.125本发明还针对不同时间上清液的效价进行了对比，结果如表5所示。表5细胞各个时间段的效价对比(效价单位-lgtcid50/ml)6)分装冻干将一收和二收收获的抗原，按一定比例加入含免疫增强剂的冻干保护剂，混匀分装制成冻干活疫苗，即为猪繁殖与呼吸综合征活疫苗。实施例2一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的制备方法，包括以下步骤1)细胞优化：细胞从低温液氮罐中复苏后，进行贴壁生长，待细胞第一次长满致密单层后，用0.25％edta-胰酶进行消化，用含10％新生牛血清的细胞培养液进行吹打，将细胞吹打成大多为单个细胞悬液后，按1:1的比例将细胞悬液全部装入一个一次性培养瓶中，进行贴壁培养，待培养15min后，将未贴壁的细胞全部弃去，培养瓶中加入新鲜培养液，继续培养已贴壁的细胞；2)细胞传代与扩大：第一次优化后细胞的生长周期变为2天，将细胞用胰酶进行消化，用含9％新生牛血清的细胞培养液进行吹打，将细胞吹打成大多为单个细胞悬液后，按1:3的比例将细胞悬液分装、补足细胞培养液，进行贴壁培养，培养瓶从t75-t175-5l-10l进行逐级扩大，方瓶扩大到转瓶，需保证培养瓶的细胞密度不少于1×106个/ml；细胞传代中使用的胰酶为：质量分数为0.25％的胰酶和0.02％的edta的pbs溶液的混合液；细胞传代中使用的细胞培养液为：mem培养基、血清、抗生素和碳酸氢钠的混合液，其中血清的含量为9％，细胞培养液的ph值为7.2；3)细胞补液：每次传代30小时后，补充10％新鲜纯mem培养液；4)细胞接毒：将待接毒的健康细胞培养液全部弃去，补入等量的不含血清的维持液，将猪繁殖与呼吸综合征病毒(ch-1r株)生产用毒种按1％的接种剂量接入以上维持液中，继续培养至收获；细胞接毒时使用的维持液为：mem培养基、碳酸氢钠和抗生素的混合液，其中抗生素的含量为50iu/ml，且混合液的ph值为7.4；5)抗原收获：抗原一收：将带毒细胞培养18小时，第一次收获含毒维持液，抗原一收时只收获上清液，然后往细胞瓶中补入一定量的维持液，继续培养细胞；抗原二收：将一收结束后的带毒细胞培养18小时，第二次收获含毒维持液，抗原二收时将细胞瓶壁上的细胞弃去，只收获上清液。6)分装冻干将一收和二收收获的抗原，按一定比例加入含免疫增强剂的冻干保护剂，混匀分装制成冻干活疫苗，即为猪繁殖与呼吸综合征活疫苗。实施例3一种猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的制备方法，包括以下步骤1)细胞优化：细胞从低温液氮罐中复苏后，进行贴壁生长，待细胞第一次长满致密单层后，用0.25％edta-胰酶进行消化，用含10％新生牛血清的细胞培养液进行吹打，将细胞吹打成大多为单个细胞悬液后，按1:1的比例将细胞悬液全部装入一个一次性培养瓶中，进行贴壁培养，待培养30min后，将未贴壁的细胞全部弃去，培养瓶中加入新鲜培养液，继续培养已贴壁的细胞；2)细胞传代与扩大：第一次优化后细胞的生长周期变为2天，将细胞用胰酶进行消化，用含9％新生牛血清的细胞培养液进行吹打，将细胞吹打成大多为单个细胞悬液后，按1:4的比例将细胞悬液分装、补足细胞培养液，进行贴壁培养，培养瓶从t75-t175-5l-10l进行逐级扩大，方瓶扩大到转瓶，需保证培养瓶的细胞密度不少于1×106个/ml；细胞传代中使用的胰酶为：质量分数为0.25％的胰酶和0.02％的edta的pbs溶液的混合液；细胞传代中使用的细胞培养液为：mem培养基、血清、抗生素和碳酸氢钠的混合液，其中血清的含量为9％，细胞培养液的ph值为7.6；3)细胞补液：每次传代30小时后，补充20％新鲜纯mem培养液4)细胞接毒：将待接毒的健康细胞培养液全部弃去，补入等量的不含血清的维持液，将猪繁殖与呼吸综合征病毒(ch-1r株)生产用毒种按3％的接种剂量接入以上维持液中，继续培养至收获；细胞接毒时使用的维持液为：mem培养基、碳酸氢钠和抗生素的混合液，其中抗生素的含量为50iu/ml，且混合液的ph值为7.6；5)抗原收获：抗原一收：将带毒细胞培养28小时，第一次收获含毒维持液，抗原一收时只收获上清液，然后往细胞瓶中补入一定量的维持液，继续培养细胞；抗原二收：将一收结束后的带毒细胞培养24小时，第二次收获含毒维持液，抗原二收时将细胞瓶壁上的细胞弃去，只收获上清液；6)分装冻干将一收和二收收获的抗原，按一定比例加入含免疫增强剂的冻干保护剂，混匀分装制成冻干活疫苗，即为猪繁殖与呼吸综合征活疫苗。当前第1页1 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