一种用于驱动基因在人红细胞系统中特异表达的启动子及应用的制作方法

2021-02-02 18:02:23|

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本发明属于基因工程
技术领域：
，具体涉及一种用于驱动基因在人红细胞系统中特异表达的启动子及应用。
背景技术：
：启动子是基因发挥功能的核心组件，其通常位于基因转录起始位点上游，具有招募转录因子、rna聚合酶等重要作用。启动子在细胞发育过程中具有选择性表达的特性，细胞会根据其发育阶段不同，特异性的表达一些启动子以驱动细胞发挥特定的功能。故启动子在特异性调控基因表达[1]，载体运输[2]及特异干扰[3]上可有广泛的应用。贵州省β珠蛋白异常基因携带率高达5.4％[4]，属β型地中海贫血高发区域。针对重型β型地中海贫血临床的治疗金标准就是异体骨髓移植，但由于患者与供者之间的配型困难及移植后排斥反应等问题，导致供不应求，患者医治效率低。随着基因技术的发展以及地中海贫血发病机制的阐明，基因治疗也逐渐应用到了β型地中海贫血的治疗上。基因治疗策略主要分为基因修正策略，基因增加策略和基因再激活策略。基因修正策略即通过基因编辑矫正β珠蛋白基因上发生突变的位置。这种方法是最理想的基因治疗方法，但β珠蛋白基因突变种类多样、基因治疗操作难度大，临床治疗难以开展。基因增加策略即向细胞中引入正常的β珠蛋白替代异常的珠蛋白，在国际上已展开了临床试验[5-6]。但正确序列的引进所增加的珠蛋白水平不好掌控，仍是有待解决的问题。基因再激活策略原理是依据胎儿血红蛋白在血液系统发育过程中存在生理上的调控过程。hb在幼儿共经历两次生理转换[7]：(1)从胚胎期以ζ2ε2为主到胎儿期以α2γ2为主；(2)从胚胎期到出生后α2β2逐渐成为主要的表型[8]。但β-地贫患者体内γ珠蛋白表达量相较正常人有所提高，暗示这种调节是机体为了平衡α肽链而产生的代偿反应。γ肽链和β肽链在结构上类似，可部分替代缺失的β肽链发挥血红蛋白的功能。现阶段临床治疗地中海贫血也会使用一些激活胎儿血红蛋白(hbg)表达的药物，如羟基脲[9]，地西他滨[10]。这类药物均是通过作用于抑制hbg表达的基因表达，而再激活hbg表达，但存在疗效低，治疗效果不稳定，患者长期预后效果差，提升hbg水平有限，还会引起血小板反应性上升[11-13]等问题。故如何高效的激活hbg同时降低副作用是基因治疗致力于优化的问题。干扰bcl11a对hbg表达的抑制作用对地贫患者的治疗是基因再激活策略的主要思路。以往研究结果表明在造血干细胞中直接干扰bcl11a的表达会影响淋巴细胞的分化与发育过程[14]，在胚胎中敲除是致死性的[15]。故如何在红细胞系(红系)分化发育过程中特异性抑制bcl11a的表达[16]，是再激活hbg表达的主要思路。现阶段研究成果显示bcl11a基因上dhss(dnahypersensitivesites,dna超敏位点)+58操控着bcl11a在红系中的表达[16-17]。靶向bcl11adhss+58位点可显著提高造血干细胞内hbg的表达水平且不影响其他造血谱系表达水平[18]。相较于红系特异增强子针对于某个基因的表达，启动子可作用的基因工程范围更加广泛，如红系特异性基因敲除、沉默或过表达等。这不仅为β型地中海贫血基因治疗提供参考，还能为镰刀状贫血及其他红系单基因遗传性疾病的特异性靶向治疗及实验研究奠定基础。参考文献[1]sk1,gumjrjr,ericksonrh,etal.humandipeptidylpeptidaseivgenepromoter:tissue-specificregulationfromatata-lessgc-richsequencecharacteristicofahousekeepinggenepromoter[j].biochemj,1995,311(3):835-843.[2]wangy,rajalaa,caob,etal.cell-specificpromotersenablelipid-basednanoparticlestodelivergenestospecificcellsoftheretinainvivo[j].theranostics,2016,6(10):1514-1527.[3]pengyf,shiyh,dingzb,etal.α-fetoproteinpromoter-drivencre/loxp-switchedrnainterferenceforhepatocellularcarcinomatissue-specifictargettherapy[j].plosone,2013,8(2):e53072.[4]喻芳,钟春琍,周强,等.贵州少数民族地区β-地中海贫血的分子流行病学研究[j].中华医学遗传学杂志,2010,6:700-703.[5]karinesii-felice,mariegiorgi,philippeleboulch,etal.hemoglobindisorders:lentiviralgenetherapyinthestartingblockstoenterclinicalpractice[j].experimentalhematology,2018,64:12-32.[6]alirezapaikari,viviena.sheehan.fetalhaemoglobininductioninsicklecelldisease[j].britishjournalofhaematology,2018,180(2):189-200.[7]a.a.thompson,m.c.walters,j.kwiatkowski,etal.genetherapyinpatientswithtransfusion-dependentβ-thalassemia[j].thenewenglandjournalofmedicine,2018,378(16):1479-1493.[8]marinacavazzana,chiaraatoniani,annaritamiccio.genetherapyforβ-thalassemia[j].moleculortherapy,2017,25(5):1142-1154.[9]joo-inpark,hee-sunchoi,jin-sookjeong,etal.involvementofp38kinaseinhydroxyurea-induceddifferentiationofk562cells[j].cellgrowth&differentiation,2001,12,481-486.[10]gordond.ginder.epigeneticregulationoffetalglobingeneexpressioninadulterythroidcells[j].translationalreasearch,2015,165(1):115-125.[11]尹晓林,张新华,吴志奎.羟基脲治疗β地中海贫血进展[j].华南国防医学杂志,2012,26(01):94-96.[12]黄连春,黄琴,聂伟业,冯琪荣,周亚丽,尹晓林.超低剂量地西他滨联合羟基脲治疗中间型β地中海贫血的临床效果[j].广西医学,2017,39(08):1235-1237.[13]olivierinf,saunthararajahy,thayalasuthanv,etal.apilotstudyofsubcutaneousdecitabineinβ-thalassemiaintermedia[j].blood,2011,118(10):2708-2711.[14]liup,kellerjr,ortizm,etal.bcl11aisenssentialfornormallymphoiddevelopment[j].natimmunol,2003,4(6):525-532.[15]yuy,wangj,khaledw,etal.bcl11aisenssentialforlymphoiddevelopmentandnegativelyregulatesp53[j].jexpmed,2012,209(13):2467-2483.[16]daniele.bauer,sophiac.kamran,samuellessard,etal.anerythroidenhancerofbcl11asubjecttogeneticvariationdeterminesfetalhemoglobinlevel[j].science,2013,342:253-257.[17]elenoec.smith,sidinhluc,donyellm.croney,etal.strictinvivospecificityofthebcl11aerythroidenhancer[j].2016,128(19):2338-2342.[18]yuxuanwu,jingzeng,benjaminp.roscoe3,etal.highlyefficienttherapeuticgeneeditingofhumanhematopoieticstemcells[j].natmed,2019,25(5):776-783.技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于驱动基因在人红细胞系统中特异表达的启动子及应用，所述启动子可特异诱导于人红系系统中表达某基因或特异干扰红系中的基因，解决了在造血谱系广泛表达引起的副作用。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种用于驱动基因在人红细胞系统中特异表达的启动子，所述启动子的核苷酸序列如seqidno.1所示。优选的，所述启动子位于基因gypa上，长度为416bp。本发明还提供了一组克隆所述启动子的引物对，所述引物对包括gypafp和gyparp，所述gypafp的核苷酸序列如seqidno.2所示，所述gyparp的核苷酸序列如seqidno.3所示。本发明还提供了一种克隆所述启动子的方法，所述方法包括pcr扩增，所述pcr扩增的程序包括：95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸5min。优选的，所述pcr扩增的体系以50μl计，包括：5×q5reactionbuffer10μl，5×q5gcenhancer10μl，10mmdntp1μl，10mm上下游引物各2.5μl，模板dna0.1～2μg，q5酶0.5μl和余量的ddh2o。本发明还提供了一种包含所述启动子的重组载体。优选的，所述重组载体的载体骨架包括pegfp-n1。本发明提供了一种驱动基因在人红细胞系统中特异表达的启动子，所述启动子的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述启动子具有在红系中特异的干扰某基因的表达及研究与红系特异性表达某基因的影响的功能。通过基因重组技术构建不同长度的启动子驱动的egfp表达的质粒，应用细胞转染技术将质粒导入k562后观察荧光情况以比较启动子活性。如图3a-b所示，1001和1003的活性较佳。而后利用上述技术将1001和1003导入hel(红白血病)，ramos(b淋巴细胞瘤)后观察荧光表达情况以比较启动子特异性。如图3c-e显示在hel细胞中1001与1003活性无差异，但在ramos细胞中1003活性显著高于1001，说明1003质粒不具有红系特异性，确定gypa-416bp具有红系特异性。本发明所获得的启动子，为红系中特异表达、干扰及敲除等基因工程技术提供了基础和实验参考。本发明所述启动子对在红系系统疾病如地中海贫血、镰刀状细胞贫血及蚕豆病等疾病中进行定向基因治疗及红系基因的研究具有重要的临床意义。附图说明图1为启动子与pegfp-n1载体连接后的vspi和hindiii双酶切验证，其中泳道1～7分别表示双酶切后的1001、1002、1003、1004、1005、1006和pegfp-n1质粒；泳道8～14分别表示1001、1002、1003、1004、1005、1006和pegfp-n1质粒；图2为启动子与pegfp-n1载体连接后的测序验证，其中图2a:1001、图2b:1002、图2c:1003、图2d:1004、图2e:1005、图2f:1006；图3为启动子活性与特异性的检测，其中图3a和图3b为k562细胞中1001、1002及1003活性的比较，图3a为荧光图，×200；图3b为统计图，*p<0.05；**p<0.01；图3c至图3e为hel及ramos中1001及1003活性及特异性的比较，其中图3c为ramos中启动子荧光图；图3d为hel中启动子荧光图；图3e为统计图，**p<0.01；图3f-图3h表示1005和1006在hel和ramos细胞中活性及特异性的比较，图3f为ramos中启动子荧光图；图3g为hel中启动子荧光图；图3h为统计图，****p<0.0001。具体实施方式本发明提供了一种用于驱动基因在人红细胞系统中特异表达的启动子，所述启动子的核苷酸序列如seqidno.1所示：tagcaacctgttccttgcagtgaaaattttacttaccactttcatagccccaagatatccatgtatctttattaacaggcgcttaacaacttgcatcatttaaaatgcctcccctgcctatcagctgatgatggccgcaggaaggtgggcctggaagataacagctagcaggctaaggtcagacactgacacttgcagttgtctttggtagtttttttgcactaacttcaggaaccagctcatgatctcaggatgtatggaaaaataatctttgtattactattgtcaggtaagtgattttatttcatcttggttctgttatattgggtatgagatcatagaataaaatatgaactaccctattttagttctatcttatttaaatcaataaatgagtagtatttcctcttccagtc。本发明所述启动子位于基因gypa上，长度为416bp。本发明还提供了一组克隆所述启动子的引物对，所述引物对包括gypafp和gyparp，所述gypafp的核苷酸序列如seqidno.2所示(gcattaattagcaacctgttccttgcag)，所述gyparp的核苷酸序列如seqidno.3所示(gccaagcttgactggaagaggaaatactactc)。本发明所述引物对中，各引物的核苷酸序列中均包含了酶切位点和保护碱基，其中gypafp中的酶切位点为vspi，gyparp的酶切位点为hindiii。本发明还提供了一种克隆所述启动子的方法，所述方法包括pcr扩增，所述pcr扩增的程序包括：95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸5min。本发明所述pcr扩增的体系以50μl计，优选包括：5×q5reactionbuffer10μl，5×q5gcenhancer10μl，10mmdntp1μl，10mm上下游引物各2.5μl，模板dna0.1～2μg，q5酶0.5μl和余量的ddh2o。本发明对所述pcr扩增体系中的各成分来源并没有特殊限定，优选利用neb公司提供的试剂盒，货号：m0491s。本发明还提供了一种包含所述启动子的重组载体。本发明所述重组载体的载体骨架优选包括pegfp-n1，将所述启动子插入所述pegfp-n1的vspi和hindiii酶切位点之间。本发明对所述pegfp-n1的来源并没有特殊限定，优选见于pengzhang,cathiarausch,floriandhastert,etal.methyl-cpgbindingdomainprotein1regulateslocalizationandactivityoftet1inacxxc3domain-dependentmanner[j].nucleicacidsres,2017,45(12):7118-7136。本发明还提供了所述启动子或所述重组载体在制备治疗红细胞系系统疾病的药物中的应用。本发明所述红细胞系系统疾病优选包括β型地中海贫血、蚕豆病和镰刀状细胞贫血。下面结合实施例对本发明提供的一种用于驱动基因在人红细胞系统中特异表达的启动子及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例11.从http://www.genomatix.de/网址预测ahsp和gypa的启动子核心区域，最终选取片段ahsp-439bp；gypa-416bp和gypa-1378bp。2.在骨架质粒启动子上下游选出单一酶切位点，上游为vspi，下游为hindiii。根据ncbi基因序列及所预测的启动子区域设计上下游引物，并于5’端添加酶切位点和保护碱基(表1)。表1启动子的克隆引物信息引物名称序列seqidno：ahsp439bpfpgcattaatggctcttgccttcttgcatttc4ahsp439bprptccaagcttctgggtagagaaaagggtaga5gypa416bpfpgcattaattagcaacctgttccttgcag2gypa416bprpgccaagcttgactggaagaggaaatactactc3gypa1378bpfpccattaatgaggcattctggattcttgtcc6gypa1378bprpgctaagcttcagactggaagaggaaatac73.利用血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒(tiangen，货号：dp304)，提取正常人血液细胞基因组，方法同说明书。4.pcr扩增启动子片段(neb，货号：m0491s)：加样体系，50μl：5×q5reactionbuffer10μl，5×q5gcenhancer10μl，10mmdntp1μl，10mm上下游引物各2.5μl，模板dna0.1～2μg，q5酶0.5μl和余量的ddh2o。pcr反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃30s，40个循环；72℃延伸5min。5.利用普通dna产物纯化试剂盒进行pcr产物纯化(tiangen，货号：dp204-02)：①柱平衡：向cb3吸附柱中加500μl的bufferbl，12000rpm×1min离心，弃滤液；②向pcr产物中加5倍体积的bufferpb，充分混匀；③将2中的液体转移至平衡过得cb3中(需提前做好标记)，12000rpm×1min，弃滤液；④加600μlpw，室温静置2～5min，12000rpm×1min离心，弃滤液；⑤重复步骤④；⑥12000rpm×2min离心，弃滤液，可室温静置数分钟晾干；⑦将cb3转移至提前标记好的新的1.5mlepp管中，向吸附膜中间悬空滴加50μl以上的洗脱液，12000rpm×2min离心，收集滤液，进行浓度测定。6.vspi和hindiii双酶切骨架质粒及ahsp/gypa启动子(货号：vspi：fd0914；hindiii:fd0504)：酶切体系(30μl)：骨架或目的片段＜2μg，10×greenbuffer3μl，vspi1μl，hindiiii1μl，ddh2o补足30μl。7.利用genejetgelextractionkit试剂盒(thermoscientific，货号为k0691)割胶回收目的条带，pegfp-n1切除自身启动子后回收4117bp片段，启动子片段回收ahsp:439bp；gypa:416bp和1378bp。8.ahsp/gypa启动子与pegfp-n1的连接，(thermoscientific，货号：el0011)：根据割胶回收后的浓度以及启动子和pegfp-n1长度计算加样量。计算规则为片段(启动子)与骨架(pegfp-n1)的摩尔质量比为3:1，计算后加样，室温连接2h后置4℃过夜连接。9.转化(货号：cb101-02)：将连接体系转化进大肠杆菌中，以获得含有连接完整(启动子+pegfp-n1)的单克隆菌落，步骤如下：①取出感受态放冰上融化；②取5μl连接体系加入50μl感受态中，冰上静置30min；③热休克：42℃，90s热击；④立即放冰上静置5min；⑤复苏：加入150μl无抗性液体性培养基37℃，160rpm培养1h；⑥涂板:在平板内倒入适量高压后的玻璃珠，吸取全部复苏菌液打至珠子上，缓慢晃动平板使菌液涂布在50μg/ml的kana抗性的lb固体培养基上；⑦37℃过夜培养，观察菌落生长情况；10.单克隆菌落的扩增：取15ml离心管，加5ml无抗性液体性培养基，加入kana，终浓度为50μg/ml，高压后的枪头挑取单个菌落打入离心管中，37℃，160rpm过夜培养。11.质粒提取(axygen，货号：ap-mn-p-50)：①取4ml细菌培养物，12000rpm×2min离心，弃净上清；②向留有菌体沉淀的离心管中加入250μlbuffers1(如果为第1次使用，使用前先加入rnasea)，吹吸重悬，至不留有小菌块；③向离心管中加入250μlbuffers2，温和地上下转6～8次，使菌体充分裂解(注意:混匀一定要温和，以免污染细菌基因组dna，此时菌液应变得清亮粘稠，作用时间不要超过5min，以免质粒受到破坏)；④向离心管中加入350μlbuffers3，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀此时会出现白色絮状沉淀；12000rpm×10min离心，小心地将上清转移到提前标记好的吸附柱中(吸附柱加入收集管中)，室温放置2min，12000rpm×1min离心，弃滤液，将吸附柱重新放回收集管中；⑤向吸附柱中加入500μl漂洗液w1，12000rpm×1min离心，弃滤液，将吸附柱放回收集管中；⑥向吸附柱中加700μl漂洗液w2(使用前请先检查是否己加入无水乙醇)，12000rpm×1min离心，弃滤液，将吸附柱放回收集管中；⑦重复⑥；⑧12000rpm×2min离心，并将吸附柱转移至新的提前标记好的epp管中，敞口置于室温数分钟，去除吸附柱中残余的漂洗液；⑨向吸附膜中央悬空滴加60～80μlddh2o，55℃孵育8min，12000rpm×2min离心，收集滤液即为提取的质粒dna，测定质粒浓度。12.验证重组质粒是否连接成功，重组质粒命名为p-gypa-egfp(416bp)，编号为1001；p-gypa-egfp(1378bp)，编号为1002；p-ahsp-egfp(439bp)，编号为1003。酶切体系(15μl)：待测重组质粒/pegfp-n11μg，10×greenbuffer1.5μl，vspi0.5μl，hindiii0.5μl，ddh2o补足。13.琼脂糖凝胶电泳检测酶切后的片段：1001，1002和1003经vspi和hindiii双酶切后电泳条带应分别为4117bp大条带和416bp、1378bp及439bp、，与此同时设空白质粒及空白质粒酶切后作对照，结果如图1所示。14.测序检测插入片段基因序列，结果如图2所示。15.电转慢性髓系白血病细胞鉴定启动子活性：将质粒大量提取测定浓度后电转k562细胞，所用体系为20μl，分组及质粒用量如表2所示：表2分组信息使用机器型号为：celetrixelectroporation(中国)。电转步骤如下：将细胞悬液(pbs)与待转质粒混合后，在390ma，30v作用下电击细胞后过夜培养。电转后过夜培养12h后观察红色荧光阳性的细胞中绿色荧光阳性细胞的比率，重复三次，进行统计学分析。如图3a和图3b所示，在k562细胞中1003质粒的活性最高，其次为1001，1002的活性最差。1001与1003之间的差异不具有统计学意义，与1002的差异均具有显著性。k562属慢性髓系白血病，故后续将1001和1003质粒进行特异性检测。16.电转红白血病细胞系(hel)和b淋巴瘤细胞系(ramos)鉴定启动子特异性：将质粒大量提取测定浓度后电转hel及ramos细胞，所用体系为20μl，分组及质粒用量如表3所示：表3分组信息操作方法同前，结果(图3c，图3d及图3e)显示在hel细胞中1001与1003活性无差异，但在ramos细胞中1003活性显著高于1001，说明1003质粒不具有红系特异性，确定gypa-416bp具有红系特异性。实施例22.1设计ahsp启动子更多片段，分别为p-ahsp-egfp(358bp)，编号为1004；p-ahsp-egfp(367bp)，编号为1005；p-ahsp-egfp(529bp)，编号为1006。引物信息如表4所示：表4引物信息2.2.重复以上质粒构建步骤(结果见图1)和转染方案，比较出最佳启动子长度。如图3f和图3g所示，1004质粒在hel和ramos细胞中均不具有活性，故未做统计学分析。1005和1006虽然在红系中有表达，但在ramos细胞中活性更高，不具有红系特异性(图3h)。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
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的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>贵州医科大学<120>一种用于驱动基因在人红细胞系统中特异表达的启动子及应用<160>13<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>416<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tagcaacctgttccttgcagtgaaaattttacttaccactttcatagccccaagatatcc60atgtatctttattaacaggcgcttaacaacttgcatcatttaaaatgcctcccctgccta120tcagctgatgatggccgcaggaaggtgggcctggaagataacagctagcaggctaaggtc180agacactgacacttgcagttgtctttggtagtttttttgcactaacttcaggaaccagct240catgatctcaggatgtatggaaaaataatctttgtattactattgtcaggtaagtgattt300tatttcatcttggttctgttatattgggtatgagatcatagaataaaatatgaactaccc360tattttagttctatcttatttaaatcaataaatgagtagtatttcctcttccagtc416<210>2<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gcattaattagcaacctgttccttgcag28<210>3<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gccaagcttgactggaagaggaaatactactc32<210>4<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gcattaatggctcttgccttcttgcatttc30<210>5<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tccaagcttctgggtagagaaaagggtaga30<210>6<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ccattaatgaggcattctggattcttgtcc30<210>7<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gctaagcttcagactggaagaggaaatac29<210>8<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8gcattaatttctaccttcagggaagcct28<210>9<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9tccaagcttctgggtagagaaaagggtaga30<210>10<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10gcattaatggctcttgccttcttgcatttc30<210>11<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11tccaagcttaaatccctcctgccctgcag29<210>12<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12gcattaatgtaatagggctcagtaaacg28<210>13<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13tccaagcttctgggtagagaaaagggtaga30当前第1页1 2 3

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