甘蔗SPSB基因同等型1及其鉴定方法与应用与流程

本发明属于植物分子育种
技术领域：
，涉及发现一种甘蔗spsb基因同等型1及其鉴定方法，以及该同等型基因特异序列在spsb等位基因鉴定、表达中开发分子标记的应用。
背景技术：
：甘蔗是复杂的异源多倍体植物，在细胞核内存在多套染色体组，基因的拷贝也会随着染色体倍性的增加而增加。在甘蔗中如何检测不同单倍型基因及其表达，一直是甘蔗研究的难题，因此在甘蔗杂交的后代中不能精确定位不同的功能基因；在每个单倍型基因在基因表达过程中，又可能出现内含子的保留、外显子的遗漏、基因5’端的可变剪接和基因3’端的可变剪接，这又称为同等型。蔗糖磷酸合成酶(sps)是甘蔗蔗糖合成最关键的酶之一，鉴定和分离出sps基因的不同单倍型或同等型对甘蔗的定向杂交与提高甘蔗蔗糖分具有重要的意义。因此上述情况的发生会对基因的表达及功能产生决定性的影响。从控制糖分性状的相关功能基因入手研究高产高糖的品种糖分相关功能基因的遗传变异及其单倍型的分析与表达，对甘蔗糖分性状的分子辅助育种具有重要意义，但目前在甘蔗分子辅助育种方面还研究甚少，在相关功能基因标记的开发和应用上还没有报道。因此如何从分子水平来指导甘蔗的品种选育成为育种家们关注的焦点。甘蔗是世界重要的糖料作物和能源植物，提高甘蔗蔗糖产量对提高能源利用率和解决世界食糖安全具有重要的意义。蔗糖磷酸合成酶是甘蔗蔗糖合成最密切的关键酶之一，共有4个家族，它是甘蔗体内光合产物向蔗糖和淀粉分配的关键调控点，在该酶的作用下，不可逆性的催化六磷酸果糖生成六磷酸蔗糖，此产物在蔗糖磷酸酯酶的作用下形成蔗糖，与蔗糖的合成呈正相关，对甘蔗蔗糖含量的增加具有重要的作用。因此，分析sps基因遗传变异特别是不同单倍型、同等型与甘蔗糖分性状的关联程度，对新型功能基因的挖掘、加速分子辅助育种进程具有重要的指导意义。技术实现要素：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种甘蔗spsb基因同等型1及其鉴定方法与应用。本发明利用甘蔗yz14-401成熟期的叶片总rna作为模板，然后合成cdna序列，在spsb基因的编码区设计引物，通过挑取多克隆的方式分析spsb等位基因类型，发现spsb基因同等型1(isform)的存在，该同等型在spsb基因的第9内含子发生内含子保留，共包含97bp的插入性片段，改变了spsb基因翻译成氨基酸的序列，该发现spsb基因同等型1能够提供一个pcr检测方法，并以此作为甘蔗spsb基因多态性的标记，为不同spsb基因型的甘蔗杂交选育提供指导。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：本发明第一方面提供甘蔗spsb基因同等型1，所述的甘蔗spsb基因同等型1的核苷酸序列如seqidno.1所示。本发明第二方面提供甘蔗spsb基因同等型1多出序列(内含子保留)为第9内含子序列，核苷酸序列如seqidno.2所示，长度为97bp。本发明第三方面提供检测甘蔗spsb基因同等型1的引物。进一步，优选的是，所述的检测甘蔗spsb基因同等型1的引物，其特征在于：针对seqidno.2所设计的引物；本发明第四方面提供含有所述的检测甘蔗spsb基因同等型1的引物的试剂盒。本发明第五方面提供一种鉴定甘蔗spsb基因同等型1的方法，包括如下步骤：步骤(1)，提取待检测样本成熟期叶片的总rna，然后反转录，得到cdna；步骤(2)，以cdna为模板，采用权利要求3或4所述的检测甘蔗spsb基因同等型1的引物进行pcr扩增；步骤(3)，对pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据上下游引物设计的距离判定条带大小，之后测序检测，鉴定甘蔗spsb基因同等型1。进一步，优选的是，pcr扩增体系如下：10×bufferⅰ5μl；dntp2.5mm5μl；kod酶1μl；上游引物10μmol1.5μl；下游引物10μmol1.5μl；mgso42μl；模板10ng/μl1.0μl；ddh2o33μl；总体积50μl；pcr扩增程序为：94℃预变性2min；94℃变性15s，60℃退火30s，68℃延伸2.5min，共35个循环；68℃延伸5min。进一步，优选的是，步骤(3)中，在seqidno.2序列上所设计的引物作为cdna检测甘蔗spsb基因同等型1的上游或下游引物，而目前已报道spsb基因同等型(如图2)在cdna中不存在seqidno.2序列，因为该区段在spsb基因中属于内含子序列，在spsb基因同等型1中得到了保留(图3所示)。本发明第六方面提供所述的甘蔗spsb基因同等型1、所述的甘蔗spsb基因同等型1、所述的鉴定甘蔗spsb基因同等型1的方法在spsb基因表达水平上的等位基因分型，spsb基因同等型1的表达研究和分子辅助育种的标记制备中的应用。进一步，优选的是，利用甘蔗yz14-401spsb基因同等型1中seqidno.2所示的第九内含子的保留序列设计特异引物，进而进行spsb基因表达水平上的等位基因分型，spsb基因同等型1的表达研究和分子辅助育种的标记制备。本发明以高糖甘蔗yz14-401成熟期叶片作为检测对象，以北京全式金生物(transgenbiotech)技术有限公司提供的easypureplantrnakit提取总rna(具体步骤详见全式金公司网站说明书)，最后用灭过菌的超纯水溶解，检测后4℃保存，选用first-strandcdnasynthesissupermix试剂盒合成cdna，利用东洋纺(上海)生物科技有限公司的kod酶进行pcr扩增。用紫外光光度计测定rna样品在260nm、280nm处的od值。计算rna含量和od260/od280的比值，评估rna提取质量；rna检测完毕后，取出一定量稀释至10ng/μl，以备cdna的合成模板用。以设计的spsb2351为引物，上下游引物序列分别在甘蔗spsb基因第4外显子和第10外显子上，pcr扩增甘蔗spsb基因部分片段，片段长度为2449bp，距离甘蔗roc22spsb基因起始密码子1020bp，经测序筛选出甘蔗yz14-401中spsb基因的一个单倍型在第九和第十外显子之间存在一个内含子保留，引物两端序列与spsb基因cds序列完全相同。所述的引物spsb2351序列为：上游引物：5’–cgtggcgaaaacatggaacta–3’；，(seqidno.3)下游引物：5’–tagcagagggacaacctgaagt–3’。(seqidno.4)pcr扩增程序为：94℃预变性2min；94℃变性15s，60℃退火30s，68℃延伸2.5min，共35个循环；68℃延伸5min。上述rt-pcr产物经琼脂糖凝胶电泳(浓度为1.5％(w/v))，在140v的电压下进行电泳，条带大小选用全式金公司生产的trans2kplusmarker作为参照，在紫外光下图片如图1所示，将电泳的条带经切割和凝胶回收，载体连接和遗传转化大肠杆菌后，挑取60个克隆送生工生物工程(上海)有限公司进行测序分析，经序列的同源性比对，检测到spsb基因同等型1序列的存在(测序图如图5)，片段长度共计2449bp，序列如下：cgtggcgaaaacatggaactaggtcgtgattctgacaccggtggccaggtgaaatatgtcgtcgaacttgcaagagcgatgtcaatgatgcctggagtgtacagggtggacctcttcactcgtcaagtgtcatctcctgacgtggactggagttatggtgagccaaccgagatgttatgctccggttccaatgatggagaggggatgggtgagagtgctggagcctacattgtgcgcataccgtgtgggccacgggataaatacctcaagaaagaagcactgtggccttacctccaagaatttgtcgatggagctctggcgcatatcctgaacatgtccaaggctctgggagagcaggttggaaatgggaggccagtactgccttatgtgatacatggacactatgccgatgctggagatgttgctgctctcctttctggtgcgctgaatgttcccatggtgctcactggtcactcacttgggaggaacaagctggagcaactgctgaagcaagggcgcatgtccaaggaggagatagattcaacctacaagatcatgaggcgtatcgagggtgaggagctggccctcgatgcgtcagagcttgtcatcacgagcacaaggcaggagattgatgaacagtggggactgtacgatggatttgacgtcaagcttgagaaagtgttgagggcccgggcgaggcgtggggttagctgtcatggtcgtttcatgcctaggatggtggtgattcctccaggaatggacttcagcaatgttgtggttcctgaagacattgatggggatggtgacagcaaagatgatatcgttggtttggagggtgcctcacccaagtcaaggcccccaatttgggctgaggtgatgcggttcctaaccaatcctcacaagccgatgatcctcgcgttgtcaaggccagacccgaagaagaacatcactaccctcgtcaaagcgtttggagagtgccgcccactcagggaacttgcaaaccttactctgatcatggggaacagagatgacatcgacgatatgtctgctgggaatgccagtgtcctcaccacagttctgaagctgattgacaagtatgacctgtatggaagtgtggcgttccctaagcatcacaaccaggctgatgtcccggagatctaccgcctcgcggccaaaatgaagggcgtcttcatcaaccctgctctcgttgagccgttcggtctcacccttatcgaggctgcggcacacggacttccaatagtcgctaccaagaatggtggtccagtcgacattacaactgtgagaaaccatattttgaacattcaatgtgcgagaaacccactgcaattcacttgtgaaaatagtggataattgtctgcgtgcatcatactggcaggcactgaacaatggactgctcgttgacccacacgaccagaacgccatcgctgatgcactgctgaagcttgtagcagacaagaacctgtggcaggaatgccggagaaacgggttgcgcaacatccacctctactcatggccggagcactgccgcacttacctcaccagggtggctgggtgccggttaaggaacccgaggtggctgaaggacacaccggcagatgccggagctgatgaggaggagttcctggaggattccatggacgctcaggacctgtcactccgtctgtccatcgacggtgagaagagctcgctgaacactaacgacccactgtcgttggacccgcaggatcaggtgcagaagatcatgaacaagatcaagcagtcgtccgcgcttccgccgtccttgtcctcggtcggagacggtgccaagaatgcagccgaggccacaggcagcaccatgaacaagtacccactcctgcgtcggcgccggcgcctgttcgtcgtagctgtggactgctaccaagacgatggccgtgctagcaagaagatgctgcaggtgatccaggaagttttcagagcagtccggtcggactcccagatgtccaagatctcagggttcgcgctgtcgactgccatgccgttgtccgagacactccagcttctgcagctcggcaagatccaagcgaccgacttcgacgcccttatctgtggcagtggcagcgaggtgtactatcctggcacggcgaactgcatcgatgctgaaggaaagctgcgcccagaccaggactatctgatgcacatcagccaccgctggtcccatgacggcgtgaggcagaccatagcgaagctcatggccagtcaggacggttcagacgacgctgtcgagctggacgtggcgtccagtaatgcacactgcttcgccttcctcatcaaagatcccaaaaaggtgaaagcggtcgatgagctgagggagaggctgaggatgcgtggtctccggtgccacatcatgtactgcaggaacgcgacaagacttcaggttgtccctctgcta(seqidno.1)其中带有下划线的碱基为插入的97bp内含子序列(测序图如图4所示)，非氨基酸编码所需的3的整数倍碱基，该序列的插入改变了spsb基因后续编码的蛋白序列。本发明中，spsb基因同等型1cdna序列存在该基因的第九内含子的保留，其保留的内含子序列为：gtgagaaaccatattttgaacattcaatgtgcgagaaacccactgcaattcacttgtgaaaatagtggataattgtctgcgtgcatcatactggcag(seqidno.2)，共计97bp，该序列属于spsb基因第九内含子序列，在正常的cdna的表达中是不存在的，但在spsb基因同等型1中存在。所扩增甘蔗spsb基因同等型1所用的引物为spsb2351。本发明为蔗糖合成相关的spsb不同等位基因及其同等型的区分提供一种特异靶位点，为甘蔗糖分性状的分子辅助育种提供可靠的基因表达水平上的标记技术。本发明为甘蔗糖分性状标记辅助育种提供了一种spsb基因同等型1在基因表达水平的鉴定所需序列，有利于甘蔗杂交后代中spsb基因不同单倍型或同等型的跟踪，鉴定和表达丰度的检测，对快速建立遗传优良的甘蔗种质具有重要意义本发明与现有技术相比，其有益效果为：本发明中利用rt-pcr方法成功在甘蔗yz14-401成熟期叶片中筛选出spsb基因同等型1，该spsb基因同等型1与甘蔗品种roc22的spsb基因编码序列相比，具有内含子保留的特点，因此可根据这一特点在该序列及其两端设计特异引物，作为区分该基因同等型1的标记。目前国内外在甘蔗spsb基因的克隆和功能方面的研究较多，主要从mrna的角度来进行研究，但该基因的内含子区域并没有得到完整的克隆，其内含子区域的多态性分析也未见报道，由于sps基因功能涉及甘蔗蔗糖分性状，本发明鉴定出sps基因编码的同等型1为甘蔗杂交后代不同基因型分离与甘蔗糖分性状关系的建立奠定了基础，以便用于甘蔗糖分性状标记的辅助选择，快速建立遗传资源优良的甘蔗高糖种质。通过本发明，可利用甘蔗yz14-401spsb基因同等型1第九内含子的保留序列设计特异引物，从而实现spsb基因表达水平上的等位基因分型，spsb基因同等型1的表达研究和分子辅助育种的标记开发。附图说明图1为甘蔗yz14-401spsb基因cdna扩增条带电泳图；其中，m为maker；1、2均为为甘蔗材料yz14-401；图2为spsb基因同等型1(hap1)与基因组dna对比；其中，细线部分为内含子序列，粗线部分为cdna序列；图3为spsb基因同等型1(hap1)与已发现的其它spsb基因单倍型及甘蔗roc22的spsb基因cdna序列(genbank:jn584485.1)、割手密spsb基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/？term＝sspon.hic_chr_asm)dna比对；图4为spsb基因cdna序列第9内含子保留位置测序图；其中，两个竖线中间部分为第9内含子序列，与图3相比，该序列为反向互补序列；图5为spsb基因同等型1cdna测序图.具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。实施例1甘蔗spsb基因cdna序列的克隆及测序分析。1、样本rna的提取及cdna的合成本发明以甘蔗yz14-401成熟期叶片作为检测对象，以全式金公司提供的easypureplantrnakit提取总rna，最后用灭过菌的超纯水溶解，检测后4℃保存，选用first-strandcdnasynthesissupermix试剂盒合成cdna，利用东洋纺(上海)生物科技有限公司的kod酶进行pcr扩增。用紫外光光度计测定rna样品在260nm、280nm处的od值。计算rna含量和od260/od280的比值，评估rna提取质量；rna检测完毕后，取出一定量稀释至10ng/μl，以备cdna的合成模板用。2、引物设计从ncbi上获得已公布的spsb基因序列，genbankid为jn584485，利用primer5.0软件在cds区域及seqidno.2上设计引物，该引物能够扩增出spsb基因同等型1。其引物spsb2351-1序列如下：上游引物：5’–cgtggcgaaaacatggaacta–3’；(seqidno.5)下游引物：5’–tcaaaatatggtttctcac–3。’(seqidno.6)3、pcr扩增取已稀释是cdna1.0μl作为模板，pcr所用的试剂为东洋纺(上海)生物科技有限公司的kod酶，反应体系为50μl，混匀后在pcr仪上进行扩增，pcr反应体系见表1所示。表1体系成分体积(μl)10×buffer5dntp(2.5mm)5kod酶1上游引物(10μmol)1.5下游引物(10μmol)1.5mgso42模板10ng/μl1.0ddh2o33总体积50pcr扩增程序为：94℃预变性2min；94℃变性15s，60℃退火30s，68℃延伸2min，共35个循环；68℃延伸5min。扩增产物经浓度为1.5％(w/v)的琼脂糖凝胶回收，条带大小选用全式金公司生产的trans2kplus作为参照，通过平末端载体连接转化后，挑取3个克隆进行测序检测，经序列比对分析，筛选出spsb基因同等型1。该spsb基因同等型1在cdna的克隆中发现，主要特点是在该cdna序列含有该基因第9内含子的完整保留，可利用这个特异序列开发分子标记，应用于该基因型的鉴定、表达等应用，可作为分子育种的标记开发。实施例2甘蔗spsb基因cdna序列的克隆及测序分析1、样本rna的提取及cdna的合成本发明以甘蔗yz14-401成熟期叶片作为检测对象，以全式金公司提供的easypureplantrnakit提取总rna，最后用灭过菌的超纯水溶解，检测后4℃保存，选用first-strandcdnasynthesissupermix试剂盒合成cdna，利用东洋纺(上海)生物科技有限公司的kod酶进行pcr扩增。用紫外光光度计测定rna样品在260nm、280nm处的od值。计算rna含量和od260/od280的比值，评估rna提取质量；rna检测完毕后，取出一定量稀释至10ng/μl，以备cdna的合成模板用。2、引物设计从ncbi上获得已公布的spsb基因序列，genbankid为jn584485，利用primer5.0软件在cds区域及seqidno.2上设计引物，该引物能够扩增出包含spsb基因的部分内含子和外显子。其引物spsb2351-2序列如下：上游引物：5’–cgtggcgaaaacatggaacta–3’(seqidno.7)下游引物：5’–acattgaatgttcaaaatatgg–3’(seqidno.8)3、pcr扩增取已稀释是cdna1.0μl作为模板，pcr所用的试剂为东洋纺(上海)生物科技有限公司的kod酶，反应体系为50μl，混匀后在pcr仪上进行扩增，pcr反应体系见表1所示。pcr反应程序为：94℃预变性2min；35个循环94℃变性15s，60℃退火30s，68℃延伸2min；68℃延伸5min。扩增产物经浓度为1.5％(w/v)的琼脂糖凝胶回收，条带大小选用全式金公司生产的trans2kplus作为参照，通过平末端载体连接转化后，挑取3个克隆进行测序检测，经序列比对分析，筛选出spsb基因同等型1。实施例3甘蔗spsb基因cdna序列的克隆及测序分析1、样本rna的提取及cdna的合成本发明以甘蔗yz14-401成熟期叶片作为检测对象，以全式金公司提供的easypureplantrnakit提取总rna，最后用灭过菌的超纯水溶解，检测后4℃保存，选用first-strandcdnasynthesissupermix试剂盒合成cdna，利用东洋纺(上海)生物科技有限公司的kod酶进行pcr扩增。用紫外光光度计测定rna样品在260nm、280nm处的od值。计算rna含量和od260/od280的比值，评估rna提取质量；rna检测完毕后，取出一定量稀释至10ng/μl，以备cdna的合成模板用。2、引物设计从ncbi上获得已公布的spsb基因序列，genbankid为jn584485，利用primer5.0软件在cds区域及seqidno.2上设计引物，该引物能够扩增出包含spsb基因的部分内含子和外显子。其引物spsb2351-3序列如下：上游引物：5’–cgtggcgaaaacatggaacta–3’；(seqidno.8)下游引物：5’–aagtgaattgcagtgg–3’。(seqidno.10)3、pcr扩增取已稀释是cdna1.0μl作为模板，pcr所用的试剂为东洋纺(上海)生物科技有限公司的kod酶，反应体系为50μl，混匀后在pcr仪上进行扩增，pcr反应体系见表1所示。pcr反应程序为：94℃预变性2min；35个循环94℃变性15s，60℃退火30s，68℃延伸2min；68℃延伸5min。扩增产物经浓度为1.5％(w/v)的琼脂糖凝胶回收，条带大小选用全式金公司生产的trans2kplus作为参照，通过平末端载体连接转化后，挑取3个克隆进行测序检测，经序列比对分析，筛选出spsb基因同等型1。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。序列表<110>云南省农业科学院甘蔗研究所<120>甘蔗spsb基因同等型1及其鉴定方法与应用<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2449<212>dna<213>人工序列()<400>1cgtggcgaaaacatggaactaggtcgtgattctgacaccggtggccaggtgaaatatgtc60gtcgaacttgcaagagcgatgtcaatgatgcctggagtgtacagggtggacctcttcact120cgtcaagtgtcatctcctgacgtggactggagttatggtgagccaaccgagatgttatgc180tccggttccaatgatggagaggggatgggtgagagtgctggagcctacattgtgcgcata240ccgtgtgggccacgggataaatacctcaagaaagaagcactgtggccttacctccaagaa300tttgtcgatggagctctggcgcatatcctgaacatgtccaaggctctgggagagcaggtt360ggaaatgggaggccagtactgccttatgtgatacatggacactatgccgatgctggagat420gttgctgctctccttt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