一种具有缓解脓毒血症的鼠李糖乳杆菌发酵多糖提取物的制备方法与流程

本发明属于食品发酵技术领域，具体涉及一种具有缓解浓度血症的鼠李糖乳杆菌发酵多糖提取物的制备方法。

背景技术：

脓毒血症是一种由感染引起的全身感染性炎症疾病。严重的脓毒血症和感染性休克是危重病人常见的危及生命的原因。虽然最近在感染性休克的治疗方面取得了进展，并且制定了国际公认的指导原则，但是其死亡率仍然高达30%-60%。目前脓毒血症的致病原理尚不清楚，导致其预防和治疗工作难以推进。虽然其治疗方式在抗生素治疗、呼吸机管理、复苏策略和血糖维持等方面取得一定的进展，但是脓毒血症仍然是icu中的主要死亡原因。

益生菌是一类能够定值宿主肠道并对机体产生有益作用的活性微生物的总称。有报道指出，益生菌不仅能够调节肠道菌群，还具有抗炎作用，其中发挥主要作用的就是益生菌分泌的多糖。随着科技的创新和研究的开展，多糖的生产工艺和制备方法的调整和改进将更加有利于对其进行深入研究。

技术实现要素：

为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种具有缓解脓毒血症的鼠李糖乳杆菌发酵多糖提取物的制备方法。

本发明所提供的鼠李糖多糖乳杆菌提取物的原料主要包括培养鼠李糖乳杆菌的原料。具体包括：乳清蛋白粉、葡萄糖,淀粉、蔗糖、牛肉膏、酵母提取物5.0、乙酸钠、柠檬酸二铵、吐温,硫酸镁,硫酸锰。这些原料按照一定的比例混合可以使鼠李糖乳杆菌生长状态最好。

本发明的另一个目的就是提出具有缓解脓毒血症的鼠李糖乳杆菌多糖的提取。技术方案是这样实现的：

步骤1、培养鼠李糖乳杆菌多糖发酵专业培养基的配置，按照乳清蛋白粉15.0g/l、葡萄糖15g/l,淀粉5.0g/l、蔗糖3.0g/l、牛肉膏5.0g/l、酵母提取物5.0g/l、乙酸钠5.0g/l、柠檬酸二铵2.0g/l、吐温80ml/l,硫酸镁0.5g/l,硫酸锰0.25g/l的配比配置液体培养基，115℃灭菌15分钟。

步骤2、在灭好菌的多糖培养基中接入鼠李糖乳杆菌，在37℃的培养箱中静止培养24小时，使菌活浓度达到2.0x1011cfu/ml。

步骤3、将培养好的含有鼠李糖乳杆菌的发酵液进行高压匀浆破碎，收集破碎之后的破碎液，利用0.22微米的滤膜过滤，收集清液。

步骤4、在过滤之后的清液中加入无水乙醇，使无水乙醇的终浓度为总体积的70%，150rpm搅拌30分钟以后，离心收集沉淀，上述步骤重复3遍，收集的沉淀采用10倍质量的蒸馏水进行溶解。

步骤5、向溶解的液体中加入1%的767医用活性炭脱色，脱色的问题维持在30-50℃，处理的时间为1-2小时，脱色完毕之后过滤收集上清液，并在上清液中加入无水乙醇，使无水乙醇的终浓度为70%，过滤收集沉淀。

步骤6、将收集的沉淀放置于70-80℃的烘箱中进行烘干，待其重量不在变化的时候，将已经烘干为粉末的多糖产品取出。

优选的，上述步骤1中多糖发酵专用培养基的灭菌条件为115℃，15分钟。

步骤2中鼠李糖乳杆菌的培养培养温度为37℃，发酵时间为24小时。

步骤3中采用的是高压匀浆破碎，利用0.22微米的滤膜过滤。

步骤5中采用1%的767医用活性炭进行脱色，脱色温度为30-50℃，脱色时间为1-2个小时。

步骤6中烘干的温度为70-80℃。

本发明的有益效果在于，与现有技术相比，本发明融入的新的工艺技术，优点在于

1.益生菌发酵多糖。益生菌是通过定殖在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。通过调节宿主黏膜与系统免疫功能或通过调节肠道内菌群平衡，促进营养吸收保持肠道健康的作用，从而产生有利于健康作用的单微生物或组成明确的混合微生物。有相关的报道指出，一些益生菌发酵产生的多糖具有一定的消炎作用。经过细胞体外实验和小鼠体内实验的验证，证实鼠李糖乳杆菌发酵多糖具有缓解脓毒血症的作用。

2.益生菌发酵多糖提取物的制备。利用水提醇沉的方法提取发酵液中的多糖。将发酵液进行高压匀浆破碎，采用0.22微米的滤膜过滤沉淀，收集破碎液，量取一定体积的破碎液，在其中加入终浓度为70%的无水乙醇，150rpm搅拌30分钟以后，离心收集沉淀以后。此步骤重复进行3次以后，将收集的所有沉淀用10倍质量的蒸馏水进行溶解。在溶解液中加入1%的767医用活性炭进行脱色，脱色时的温度保持在30-50℃，脱色的时间在1-2个小时。在脱色完成以后，过滤收集上清液，量取上清液的体积，加入无水乙醇使无水乙醇终浓度为70%，过滤收集沉淀，将沉淀将沉淀放置在70-80℃的烘箱中进行烘干，最终获得粉末状产品。

附图说明

图1：每组还存活的小鼠进行取血处理，检测小鼠血液中炎性因子的变化。

图2：未加干扰的模型组小小鼠肺部的干湿比明显下降，但是使用发酵产物灌胃的小鼠的肺部干湿比有所升高，且高剂量组比低剂量组的效果更好一些。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。

实施例1

称取15g的乳清蛋白粉、15g的葡萄糖、5g淀粉、3g蔗糖、5g牛肉膏、酵母提取物5g、乙酸钠5g、2g柠檬酸二胺、1ml的吐温80、0.5g的硫酸镁和0.5g的硫酸锰之后加入1l的纯净水，充分搅拌均匀，115℃灭菌15分钟。

待培养基冷却到常温的时候，在无菌超净台中将鼠李糖乳杆菌接种到培养基中，随后放置于37℃的培养箱中培养24小时，此时活菌的菌活达到2x10¹¹。

将发酵液进行高压破碎，破碎液采用0.22微米的滤膜进行过滤，收集过滤液。收集到900ml滤液。

在过滤液加入2100ml的无水乙醇使无水乙醇的终浓度为70%，150rpm搅拌30分钟以后，收集沉淀，重复上述操作3遍，总共收集到约20g的沉淀，收集的沉底采用200ml的蒸馏水进行溶解。

向溶解产物中加入2g的767医用活性炭进行脱色，脱色的时间为2小时，处理的温度30℃。脱色完毕以后收集上清液，并加入约466ml的无水乙醇使无水乙醇的终浓度为70%，收集到约16g的沉淀。

将收集到的16g沉淀置于70℃烘箱里进行烘干，烘干成粉末状，收集粉末。

实施例1中鼠李糖乳杆菌发酵多糖提取物对缓解小鼠脓毒血症症状的实验如下：

实验对象：选择100只balb/c小鼠，进行分组，分组空白组、建模组、低剂量组和高剂量组，每组25只小鼠。

空白组注射生理盐水，建模组注射量为20mg/kglps，低剂量组为10mg/kg，高剂量组为20mg/kg。

实验的第一天，除去空白组小鼠灌胃生理盐水之外，其他所有组的小鼠都注射20mg/kg的lps，注射完成以后，空白组和建模组小鼠灌胃同剂量的生理盐水，低剂量组小鼠注射10mg/kg的鼠李糖乳杆菌发酵多糖提取物，高剂量组的小鼠注射20mg/kg的鼠李糖乳杆菌发酵多糖提取物。第二天观察每组小鼠的存活率。

空白组与建模组相比，具有显著性差异，说明建模成功，高低剂量组和建模相比也具有显著性差异，说明在给小鼠灌胃鼠李糖乳杆菌发酵多糖提取物之后，可以显著降低由lps导致的小鼠脓毒血症的死亡率。

小鼠注射lps诱导小鼠脓毒血症模型，最明显的就是导致小鼠肺部发炎水肿，所以缓解脓毒血症的鼠李糖乳杆菌多糖发酵产物缓解脓毒血症的另一个重要指标就是发酵产物能否提高小鼠肺部的干湿比。

实施例2

称取30g的乳清蛋白粉、30g的葡萄糖、10g淀粉、6g蔗糖、10g牛肉膏、酵母提取物10g、乙酸钠10g、4g柠檬酸二胺、2ml的吐温80、1g的硫酸镁和1g的硫酸锰之后加入2l的纯净水，充分搅拌均匀，115℃灭菌15分钟。

待培养基冷却到常温的时候，在无菌超净台中将鼠李糖乳杆菌接种到培养基中，随后放置于37℃的培养箱中培养24小时，此时活菌的菌活达到2x10¹¹。

将发酵液进行高压破碎，破碎液采用0.22微米的滤膜进行过滤，收集过滤液。收集到1.5l滤液。

在过滤液加入3.5l的无水乙醇使无水乙醇的终浓度为70%，150rpm搅拌30分钟以后，收集沉淀，重复上述操作3遍，总共收集到约36g的沉淀，收集的沉底采用360ml的蒸馏水进行溶解。

向溶解产物中加入3.6g的767医用活性炭进行脱色，脱色的时间为2小时，处理的温度30℃。脱色完毕以后收集上清液，并加入约840ml的无水乙醇使无水乙醇的终浓度为70%，收集到约25g的沉淀。

将收集到的25g沉淀置于70℃烘箱里进行烘干，烘干成粉末状，收集粉末。

上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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