一种利用嗜联苯红球菌提高玉米秸秆酶解效率的方法与流程

本发明涉及生物转化领域，尤其涉及一种利用嗜联苯红球菌提高玉米秸秆酶解效率的方法。

背景技术：

近些年来，世界范围内出现能源危机，环境污染日趋严重，人们不得不寻找新的绿色能源来代替化石燃料。在众多新能源中，生物质能一直被人们所青睐，据测算全球年产生约1500亿吨的生物质，包括植物基淀粉、农业废弃物和木质纤维素等。在我国，每年农作物玉米秸秆产量有7亿吨左右，用含有纤维素的玉米秸秆生产燃料越来越受到研究者的关注。

玉米秸秆主要成分是木质纤维素，木质纤维素通常包含三个主要成分：纤维素、半纤维素和木质素。通过酶解纤维素可以转化为葡萄糖，用于乙醇和有机酸的生产，但是木质纤维素中的木质素阻碍了纤维素酶和纤维素的接触，导致酶解效率低的问题。为了提高酶解效率，目前有研究表明，从里氏木霉中提取的木质素过氧化物酶对玉米秸秆进行预处理能够特异性的降解木质素组分，从而提升纤维素酶的效果，但是木质素过氧化物酶的成本过高且生产困难，难以将其应用于大规模的生物预处理。

技术实现要素：

为了解决以上问题，本发明的目的是提供一种利用嗜联苯红球菌提高玉米秸秆酶解效率的方法，不仅能够明显提高纤维素酶的水解效率，而且具有操作简单，成本低，能够适用于玉米秸秆的大规模处理的特点。

为实现上述目的，本发明所设计的一种利用嗜联苯红球菌提高玉米秸秆酶解效率的方法，包括步骤：

(1)制备玉米秸秆粉末

将玉米秸秆晒干并粉碎得到玉米秸秆粉末；

(2)制备嗜联苯红球菌粗酶液

在培养液中接种活化后的嗜联苯红球菌，并培养至od600≥2.0，收集培养液的上清液得到嗜联苯红球菌粗酶液；

(3)玉米秸秆的预处理

向玉米秸秆粉末中加入嗜联苯红球菌粗酶液，处理3～10天；

(4)玉米秸秆的酶解处理

向预处理后的玉米秸秆粉末中添加纤维素酶，进行酶解反应；

其中嗜联苯红球菌，菌株命名为嗜联苯红球菌b403(rhodococcusbiphenylivoransb403)，保藏编号为cctccno：m2019087，保藏日期为2019年1月25日；保藏地址为中国.武汉.武汉大学；单位名称：中国典型培养物保藏中心。

作为优选方案，所述步骤(2)中培养液为lb培养基和无机盐培养基的混合培养基，所述lb培养基和所述无机盐培养基的体积比为1～2：1～2。

作为优选方案，所述步骤(2)中，将嗜联苯红球菌培养至od600为2.5～3.5。

作为优选方案，所述纤维素酶的添加量为0.004～0.006g/ml。

作为优选方案，所述酶解反应的温度为30～40℃，酶解反应的时间为2～4小时。

本发明的优点在于：与现有玉米秸秆酶解方法相比，本发明首先制备嗜联苯红球菌粗酶液，然后利用嗜联苯红球菌粗酶液对玉米秸秆进行预处理，研究表明经嗜联苯红球菌粗酶液预处理后，玉米秸秆材料具有明显的结构损伤变化，这些变化增加了纤维素酶对纤维素的可及性，提高了纤维素酶的水解效果。

附图说明

图1为嗜联苯红球菌在四种培养基中的生长曲线图，图中，a：lb培养基加入木质素，b：添加无机盐的lb培养基加入木质素，c：无机盐培养基加入木质素，d：无机盐培养基；

图2为预处理后玉米秸秆电子显微镜图片；图2a和图2c为对比例步骤(3)预处理后的玉米秸秆粉末的电子显微图；图2b和图2d为实施例1步骤(3)中经过嗜联苯红球菌预处理后的米秸秆的电子显微图；

图3为预处理后玉米秸秆表面原子力显微镜图片；图3a为对比例步骤(3)预处理后玉米秸秆的原子力显微图；图3b为根据图3a构建的三维图像；图3c为实施例1步骤(3)中经过嗜联苯红球菌预处理后的玉米秸秆的原子力显微图；图3d为根据图3c构建的三维图像。

具体实施方式

为更好地理解本发明，以下将结合附图和具体实例对发明进行详细的说明。

实施例1

一种利用嗜联苯红球菌提高玉米秸秆酶解效率的方法，包括步骤：

(1)制备玉米秸秆粉末

将玉米秸秆晒干并粉碎得到玉米秸秆粉末；

(2)制备嗜联苯红球菌粗酶液

配置添加无机盐的lb培养基，接种活化后的嗜联苯红球菌菌落，在设定28℃、200rpm的培养箱中培养12h，od600值达到2.5，准备冰盒，在无菌操作台中将菌液装入灭菌干燥的50ml离心管，使用低温高速离心机在4℃、8000rpm条件下分离菌体和菌液，获得的上清液作为嗜联苯红球菌粗酶液；

添加无机盐的lb培养基：lb培养基50ml+无机盐培养基50ml；

其中lb培养基：每100mllb培养基含有胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，nacl1g。溶质溶解后用5mol/lnaoh调ph至7.0后在121℃高压下蒸汽灭菌20min；

无机盐培养基：每1l培养基含有硝酸钾190mg，硝酸铵165mg，磷酸二氢钾17mg，硫酸镁37mg，氯化钙44mg，硫酸锰2.3mg，硫酸铜0.025mg，硫酸亚铁0.027mg。溶质溶解后在121℃高压下蒸汽灭菌20min；

为了探究嗜联苯红球菌的优选培养液，分别配制配置三种培养基，如表1所示，分别为lb培养基(a)、添加无机盐的lb培养基(b)和无机盐培养基(c)。每组配置培养基150ml，添加酸性木质素，添加量为5mg/ml。另外设置对照组(d)，使用无机盐培养基，不添加酸性木质素。

表1生长曲线培养基组分表

结果如图1所示，嗜联苯红球菌在添加无机盐的lb培养基(b)中活性较高、生长较活跃。

(3)对玉米秸秆预处理：

向1l的锥形瓶中加入50g玉米秸秆粉末，再加入500ml嗜联苯红球菌粗酶液，在28℃、200rpm条件下进行预处理，共处理10天，预处理完成之后，过滤、冲洗、烘干后收集玉米秸秆粉末；

(4)酶解

取经过预处理后的玉米秸秆粉末1g，纤维素酶的添加量为0.005g/ml，再添加10ml的pbs缓冲液，在37℃条件下反应3h。

对比例：对比例与实施例1的区别仅在于，对比例在步骤(3)中将500ml红球菌粗酶液替换为500ml的无菌水，在此不再赘述对比例的详细步骤。

实施例2

玉米秸秆酶解效率计算

将实施例1嗜联苯红球菌预处理后的玉米秸秆粉末与对比例经无菌水预处理的玉米秸秆粉末分别用纤维素酶进行酶解处理，并设置不添加纤维素酶的对照组，每3h测定还原糖浓度，绘制还原糖含量变化曲线，结果为，酶处理3h后纤维素酶酶解的还原糖浓度达到最高，对照组基本没有还原性糖产生，说明基本没有秸秆成分溶解的情况，用嗜联苯红球菌对秸秆原料进行预处理后，纤维素酶的水解效果得到明显高于经无菌水预处理的玉米秸秆，为了比较不同处理对纤维素酶解的影响，引入如下公式(1)进行还原糖浓度变化的计算：

式中c为还原糖浓度的提高量，a为对比例测得的还原性糖含量；b为实施例1测得还原性糖含量。

经过计算，本发明经嗜联苯红球菌预处理使纤维素酶产糖量提高了8％。

实施例3

扫描电子显微镜观察预处理秸秆

将实施例1步骤(3)预处理后的玉米秸秆粉末和对比例步骤(3)预处理后的玉米秸秆粉末分别运用扫描电子显微镜观察玉米秸秆材料的表面结构，对比不同预处理后玉米秸秆微观结构的变化。

结果如图2所示，嗜联苯红球菌预处理的玉米秸秆发生了明显的结构改变，对比例玉米秸秆材料(图2a和图2c)表面结构更加完整，有明显的片层状结构附着在玉米秸秆表面，观察断面发现破碎截面整齐基本无分层现象，孔洞分布均匀且边缘光滑。而在经过嗜联苯红球菌预处理的玉米秸秆材料表面(图2b和图2d)，材料表面不再完整，一些片状结构脱落了并留下了明显的痕迹，断层边缘发现明显的分层现象，孔洞更多，部分孔洞变大，同时孔洞的形状变得不规则，也让相邻的孔洞因为面积扩大也有变为一个大孔洞的趋势。由此可知，在嗜联苯红球菌的预处理过程中，秸秆表面的稳定结构被破坏，使秸秆材料内部暴露出来，提升了纤维素酶与纤维素底物的接触面积，秸秆材料的空洞变大，从而增加了材料的比表面积，增加了纤维素酶的可及性，可及性的增加使得纤维素被纤维素酶充分的水解，最终增加了还原性糖的产量。

实施例4

原子力显微镜观察预处理秸秆

将实施例1步骤(3)预处理后的玉米秸秆粉末和对比例步骤(3)预处理后的玉米秸秆粉末分别运用原子力显微镜观察玉米秸秆材料的表面结构，进一步对比不同预处理后玉米秸秆微观结构的变化。

在结合图3所示，对比例玉米秸秆表面(图3a)均匀地排列了许多白色基团，而在经嗜联苯红球菌预处理的茎玉米秸秆表面(图3c)，无法观察到这些基团，大多观察到交叉排列的链状结构，这些链状结构排列杂乱。整齐排列的基团是木质素的典型外观，它们紧密排列以抵抗对茎结构的外部损害，防止纤维素酶吸附在内部纤维素上并水解纤维素。链状结构则是纤维素微纤丝堆叠缠绕的结果。玉米秸秆材料表面的结构差异，表明玉米秸秆经过嗜联苯红球菌预处理后，表面的木质素被去除了从而暴露出了内部的纤维素结构，由此可知，嗜联苯红球菌预处理可以暴露茎的内部结构并增加纤维素对纤维素酶的可及性，这有利于纤维素酶将纤维素转化为单个糖分子的功能。

另外，构建了玉米秸秆表面的三维结构图像(如图3b，3d)，并测量了表面粗糙度(ra)。表面粗糙度(ra)指的是材料表面上微小的峰和谷的小间距和不均匀性。现有的研究指出材料越光滑，表面粗糙度值越小。从图3b和图3d中能明显看出，经无菌水处理的玉米秸秆表面(图3b)更加平整，整体的起伏不大，经测定ra＝8.00。而经嗜联苯红球菌预处理(图3d)，玉米秸秆表面突出的部分更多了，嗜联苯红球菌对木质素的降解使得秸秆表面结构不再完整，表面也更加粗糙，经测定ra＝9.37。由此可知，对比例玉米秸秆具有规则且致密的表面结构，所以有较小的ra值，均匀且规则排列的木质素结构保护了玉米秸秆的内部结构，阻碍了纤维素酶对纤维素的吸附，纤维素酶酶解效率低下，而经嗜联苯红球菌预处理后的玉米秸秆表面更加粗糙且不完整，ra值也因此变大。

综上所述，嗜联苯红球菌的预处理可以促进玉米秸秆的纤维素酶水解，水解后还原糖的含量增加了8％。在结构分析中，电子显微镜图像清楚地表明，经嗜联苯红球菌预处理后，玉米秸秆材料具有明显的结构损伤变化，包括表面结构的剥离，孔的增加和整体破碎程度的增加。原子力显微镜图像显示，经过嗜联苯红球菌预处理，秸秆材料表面的木质素结构不再完整，暴露出更多的内部纤维素结构，这些变化增加了纤维素酶对纤维素的可及性。嗜联苯红球菌粗酶液对玉米秸秆结构的破坏使纤维素酶和纤维素更好地结合，充分发挥纤维素酶的功能，提高了纤维素酶的水解效果。

与现有玉米秸秆酶解方法相比，本发明提高玉米秸秆酶解效率的方法具有的优点为：

(1)本发明首先制备嗜联苯红球菌粗酶液，然后利用嗜联苯红球菌粗酶液对玉米秸秆进行预处理，研究表明经嗜联苯红球菌粗酶液预处理后，玉米秸秆材料具有明显的结构损伤变化，这些变化增加了纤维素酶对纤维素的可及性，提高了纤维素酶的水解效果。

(2)相比于木质素过氧化物酶预处理的方法，本发明直接将嗜联苯红球菌的培养液作为嗜联苯红球菌粗酶液，无需进行蛋白纯化步骤，操作简单，而且嗜联苯红球菌粗酶液的成本远远低于木质素过氧化物酶的成本，本发明更适合于玉米秸秆的大规模集中处理。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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