一种评价脓毒症的生物标志物的筛选方法与流程

本发明属于生物标记物技术领域，尤其涉及一种评价脓毒症的生物标志物的筛选方法。

背景技术：

目前，脓毒症是由于免疫系统对于侵袭性感染的应答而成为一种异质性综合征。当伴随器官系统性功能紊乱或心血管性休克，会出现严重的脓毒症或脓毒症性休克，这是严重病患发病率和死亡率的主要原因。报道显示，脓毒症是非冠脉icu病患最主要的死因。脓毒症是缺乏可靠的诊断标准的异质性疾病，由于血培养的阳性率较低，许多病例的诊断依赖于相对主观的临床环境，导致诊断出现变异性，诊断和启动治疗仍需要通过评估病史，感染症状及进展为急性器官衰竭可能性。生物标志物能帮助缩短这一过程，有提高脓毒症诊断和治疗的潜在价值。但是目前评价脓毒症的生物标志物的筛选的方法复杂，并且生物标记物的灵敏度低，在临床中诊断价值较小。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前评价脓毒症的生物标志物的筛选的方法复杂，并且生物标记物的灵敏度低，在临床中诊断价值较小。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种评价脓毒症的生物标志物的筛选方法。

本发明是这样实现的，一种评价脓毒症的生物标志物的筛选方法，所述评价脓毒症的生物标志物的筛选方法包括以下步骤：

步骤一，抽取确诊为脓毒症且无其他免疫疾病的患者的静脉血，将静脉血置于离心管中；将盛有静脉血的离心管置于离心机内离心；

步骤二，将离心管置于恒温水浴箱内，设定水浴温度为37℃，静置4～5min；使用玻璃小滴棒将纤维蛋白剥离到离心管的管壁上，同时将离心管再次置于离心机中进行二次离心；

步骤三，取1ml血清样本置于离心管中，加入2mltrizolreagent，振荡使二者融合，静置后进行剧烈振荡至离心管内无沉淀物；

步骤四，在离心管内加入1ml氯仿，振荡使二者融合，静置直至出现分层；将分层液体置于离心机中，设定离心温度为4℃、离心转速为6000～8000r/min进行10～12min离心，弃除上清液；

步骤五，在离心管中加入3ml乙醇，振荡后将离心管置于离心机内，设定离心温度为4℃，离心转速为8000～10000r/min进行3～5min离心，弃除上清液；对离心管内的液体进行干燥，至离心管内无液体残留；

步骤六，在离心管中加入rnase水，在55～60℃环境内孵育10～15min，进行血清样品中rna的提取，得到rna样本；

步骤七，检测rna样本的rna纯度，将检测结果与预设纯度进行对比，并将符合纯度要求的样本置于冰箱中在-80℃环境下进行保存；

步骤八，将步骤七保存的rna样本取出，将rna样本反转录合成cdna，进行标记crna的合成；

步骤九，将步骤八得到的合成的crna溶于结合缓冲液中，并加入蛋白酶抑制剂，以超声破碎仪震破细胞，于4℃环境下离心15～20min，移除细胞碎片，过滤上清液；

步骤十，将步骤九过滤后的上清液注入已事先通过结合缓冲液的金属螯合层析管柱，清洗缓冲液清洗管柱，以冲洗缓冲液冲洗，得到纯化物，并进行crna片段化；

步骤十一，将片段化的crna与芯片进行杂交，洗涤，进行芯片扫描，进行杂交后incrnas的检测，并依照预设标准进行符合要求的incrnas的初步筛选，得到多个评价脓毒症的生物标志物；

步骤十二，对得到多个评价脓毒症的生物标志物的诊断价值进行验证，扩大样本评价候选标志物对脓毒症的诊断价值，并对诊断价值进行排序；

步骤十三，选择诊断价值最高的生物标志物作为评价脓毒症的生物标志物，并对该生物标志物进行敏感度和特异度的测定，完成所述评价脓毒症的生物标志物的筛选。

进一步，步骤一中，所述将盛有静脉血的离心管置于离心机内离心的条件为：设定离心速率为2000～2500r/min，离心时间为3～5min。

进一步，步骤二中，所述将离心管再次置于离心机中进行二次离心的条件为：设置离心速率为3000～3500r/min，离心时间为2～3min。

进一步，步骤七中，所述检测rna样本的rna纯度时，使用nanodrop-2000进行检测。

进一步，步骤七中，所述预设纯度为1.26～1.42。

进一步，步骤八中，所述将rna样本反转录合成cdna的方法为：

(1)将rna样本在4℃环境下进行解冻；

(2)将rna反转录为cdna；

(3)采用聚合酶链式反应的方式不间断地对cdna进行扩增。

进一步，步骤(2)中，所述将rna反转录为cdna的条件为：设定反转录所需温度为50～60℃、反转录时间为20～25min。

进一步，步骤十中，所述结合缓冲液由nacl溶液和tris-hcl溶液混合而成。

进一步，步骤十中，所述进行crna片段化的方法，包括：

(1)获取纯化后的crna，在纯化后的crna中加入片段化试剂；

(2)将试剂置于90～94℃的环境下进行片段化处理；

(3)对片段化处理中的试剂进行观察，直至试剂出现形态变化，结束处理。

进一步，步骤十一中，所述芯片为带有脓毒症基因检测探针的基因芯片。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明通过脓毒症患者血清样本进行检测和分析，初步筛选得到血清标志物，并进行血清标志物的再次筛选，得到的标志物的诊断价值更高，能够提高脓毒症的早期预警的敏感性和特异性，预测脓毒症的病情进展，为临床早期干预提供了参考依据，最终实现降低脓毒症的死亡率。本发明的筛选方法具有良好的可重复性，因适合用于脓毒症诊断标志物的检测。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的评价脓毒症的生物标志物的筛选方法流程图。

图2是本发明实施例提供的对静脉血置于离心管中进行离心，分离得到血清的方法流程图。

图3是本发明实施例提供的进行血清样品中rna提取的方法流程图。

图4是本发明实施例提供的进行crna纯化的方法流程图。

图5是本发明实施例提供的进行crna片段化的方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种评价脓毒症的生物标志物的筛选方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的评价脓毒症的生物标志物的筛选方法包括以下步骤：

s101，抽取确诊为脓毒症且无其他免疫疾病的患者的静脉血，对静脉血置于离心管中进行离心，分离得到血清，置于4℃环境中保存，将其作为样本备用；

s102，进行血清样品中rna的提取，得到rna样本；检测rna样本的rna纯度，将检测结果与预设纯度进行对比，并将符合纯度要求的样本置于冰箱中在-80℃环境下进行保存；

s103，将保存的rna样本取出，将rna样本反转录合成cdna，标记crna的合成、纯化，并进行crna片段化；

s104，将片段化的crna与芯片进行杂交，洗涤，进行芯片扫描，进行杂交后incrnas的检测，并依照预设标准进行符合要求的incrnas的初步筛选，得到多个评价脓毒症的生物标志物；

s105，对得到多个评价脓毒症的生物标志物的诊断价值进行验证，扩大样本评价候选标志物对脓毒症的诊断价值，并对诊断价值进行排序；

s106，选择诊断价值最高的生物标志物作为评价脓毒症的生物标志物，并对该生物标志物进行敏感度和特异度的测定，完成所述评价脓毒症的生物标志物的筛选。

本发明实施例提供的步骤s102中，所述检测rna样本的rna纯度时，使用nanodrop-2000进行检测。

本发明实施例提供的步骤s102中，所述预设纯度为1.26～1.42。

本发明实施例提供的步骤s103中，所述将rna样本反转录合成cdna的方法，包括：

(1)将rna样本在4℃环境下进行解冻；

(2)设定温度为50～60℃、时间为20～25min，将rna反转录为cdna；

(3)采用聚合酶链式反应的方式不间断地对cdna进行扩增。

本发明实施例提供的步骤s103中，所述芯片为带有脓毒症基因检测探针的基因芯片。

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例1

本发明实施例提供的评价脓毒症的生物标志物的筛选方法如图1所示，作为优选实施例，如图2所示，本发明实施例提供的将静脉血置于离心管中进行离心，分离得到血清的方法包括：

s201，抽取确诊为脓毒症且无其他免疫疾病的患者的静脉血，将静脉血置于离心管中；将盛有静脉血的离心管置于离心机内离心；

s201，将离心管置于恒温水浴箱内，设定水浴温度为37℃，静置4～5min；

s203，使用玻璃小滴棒将纤维蛋白剥离到离心管的管壁上，同时将离心管再次置于离心机中进行二次离心。

本发明实施例提供的将盛有静脉血的离心管置于离心机内离心的条件为：设定离心速率为2000～2500r/min，离心时间为3～5min。

本发明实施例提供的将离心管再次置于离心机中进行二次离心的条件为：设置离心速率为3000～3500r/min，离心时间为2～3min。

实施例2

本发明实施例提供的评价脓毒症的生物标志物的筛选方法如图1所示，作为优选实施例，如图3所示，本发明实施例提供的进行血清样品中rna的提取的方法包括：

s301，取1ml血清样本置于离心管中，加入2mltrizolreagent，振荡使二者融合，静置后进行剧烈振荡至离心管内无沉淀物；

s302，在离心管内加入1ml氯仿，振荡使二者融合，静置直至出现分层；

s303，将分层液体置于离心机中，设定离心温度为4℃、离心转速为6000～8000r/min进行10～12min离心，弃除上清液；

s304，在离心管中加入3ml乙醇，振荡后将离心管置于离心机内，设定离心温度为4℃，离心转速为8000～10000r/min进行3～5min离心，弃除上清液；

s305，对离心管内的液体进行干燥，至离心管内无液体残留；

s306，在离心管中加入rnase水，在55～60℃环境内孵育10～15min，进行血清样品中rna的提取，得到rna样本。

实施例3

本发明实施例提供的评价脓毒症的生物标志物的筛选方法如图1所示，作为优选实施例，如图4所示，本发明实施例提供的对crna进行纯化的方法为：

s401，将获取的crna溶于结合缓冲液中，并加入蛋白酶抑制剂，以超声破碎仪震破细胞；

s402，于4℃环境下离心15～20min，移除细胞碎片，过滤上清液；

s403，将上清液注入已事先通过结合缓冲液的金属螯合层析管柱，清洗缓冲液清洗管柱，以冲洗缓冲液冲洗，得到纯化物。

本发明实施例提供的结合缓冲液由nacl溶液和tris-hcl溶液混合而成。

实施例4

本发明实施例提供的评价脓毒症的生物标志物的筛选方法如图1所示，作为优选实施例，如图5所示，本发明实施例提供的进行crna片段化的方法包括：

s501，获取纯化后的crna，在纯化后的crna中加入片段化试剂；

s502，将试剂置于90～94℃环境下进行片段化处理；

s503，对片段化处理的试剂进行观察，直至试剂出现形态变化，结束处理。

以上所述，仅为本发明较优的具体的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

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