一种检测miRNA的自产生共反应剂信号放大电化学发光体系的制作方法

2021-02-02 18:02:03|

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本发明属于mirna检测技术领域，具体涉及一种检测mirna的自产生共反应剂信号放大电化学发光体系。

背景技术：

microrna(mirna)作为一种非编码rna(non-codingrna)在胚胎发育、细胞凋亡、基因转录、蛋白修饰、信号传递、机体免疫及疾病发生等生理或病理过程中发挥重要的调控功能。因此，mirna的高灵敏、准确分析已成为人们研究的重点与热点。

但目前的研究方法仍面临诸多问题，例如探针的稳定性和灵敏度差、操作复杂、噪音大、成本高等，如何实现高灵敏地mirna的准确分析成为研究的趋势。电化学发光检测技术具有背景信号低，稳定性高等优点，被广泛地应用于核酸、蛋白等肿瘤标志物的检测。传统的电化学发光方法需要再溶液中另外添加共反应剂，且灵敏度等方面的表现也有待提高。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测mirna的自产生共反应剂信号放大电化学发光体系，利用所述体系，可实现目标mirna的高灵敏、高特异性的电化学发光检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种检测mirna的自产生共反应剂信号放大电化学发光体系，所述体系包括依次连接的传感器基底、固定探针和巯基乙醇封板；所述体系中还包括修饰有生物素的探针、链霉亲和素和葡萄糖氧化酶修饰的纳米金、血红素hemin和luminol；

所述传感器基底包括电镀一层au纳米花的fto电极；

所述固定探针包括发卡dna；

所述固定探针和修饰有生物素的探针可发生取代反应。

优选的，所述固定探针包括如seqidno.1所示的发卡dna。

优选的，修饰有生物素的探针包括如seqidno.2所示的核苷酸序列的探针。

优选的，所述传感器基底的制备方法，包括：利用打孔胶带包裹清洗后干燥的fto玻璃，浸入电解质中进行电镀；所述电解质中包括0.05m磷酸盐缓冲液、0.054mkcl和5mmhaucl4。

优选的，所述清洗包括将fto玻璃切成宽和长为1cm×4cm的矩形后，用去离子水洗涤，再浸入含有2mkoh的沸腾2-丙醇中20min，水洗涤后再超声清洗15min。

优选的，利用循环伏安法进行所述电镀，参数设定为：电压-0.8～0.3v、循环50次、扫描速率为0.1v/s；加热溶液至60℃并保持氮气氛围。

优选的，所述链霉亲和素和葡萄糖氧化酶修饰的纳米金的制备方法，包括：将纳米金溶液与等体积的葡萄糖氧化酶溶液和链霉亲和素溶液混合后，于4℃保持24h，将离心后得到的沉淀分散于缓冲液中，得链霉亲和素和葡萄糖氧化酶修饰的纳米金。

优选的，所述纳米金溶液的体积为500μl，溶液中纳米金的粒径为30nm，葡萄糖氧化酶溶液的浓度为15mg/ml，链霉亲和素溶液的浓度为1mg/ml。

本发明提供了一种检测mirna的自产生共反应剂信号放大电化学发光体系，利用大表面积的纳米传感基底，通过构建修饰发卡结构的捕获探针实现了靶标mirna存在时共反应剂(h2o2)的自产生，并且结合链置换核酸等温信号放大策略对信号进行放大，可实现目标mirna的高灵敏、高特异性的电化学发光检测。具体的当溶液中出现靶mirna时，固定探针的发卡结构被打开，在生物素探针的存在下，打开的发卡dna与生物素探针发生取代反应，进而替换出靶rna，由此靶rna在生物素探针的存在下发生循环利用，最终在传感界面产生大量的带有生物素的双链dna，并与带有亲和素和葡萄糖氧化酶的纳米金结合，催化溶液中的葡萄糖和氧气反应，产生大量的双氧水，并且打开的发卡dna末端含有大量的g四联体结构并与溶液中的血红素hemin形成hemin/g四联体结构，该结构具有类过氧化物酶的作用，能够催化双氧水产生过氧自由基，产生的过氧自由基与基底溶液中的luminol反应产生ecl信号，实现了mirna的高灵敏检测。利用本发明所述体系进行mirna的检测时，可提高检测的准确性和灵敏度，同时排除人为干扰因素。

附图说明

图1为fto电极表面电沉积金纳米花后扫描(sem)电镜图；

图2为自产生共反应剂信号放大型ecl传感方法对mirna检测的原理图；

图3为ecl响应曲线和工作曲线；

图4为检测选择性曲线及稳定性曲线；

图5为不同肿瘤细胞提取液中mirna的检测。

具体实施方式

本发明提供了一种检测mirna的自产生共反应剂信号放大电化学发光体系，所述体系包括依次连接的传感器基底、固定探针和巯基乙醇封板；所述体系中还包括修饰有生物素的探针、链霉亲和素和葡萄糖氧化酶修饰的纳米金、血红素hemin，葡萄糖和luminol；

所述传感器基底包括电镀一层au纳米花的fto电极；

所述固定探针包括发卡dna；

所述固定探针和修饰有生物素的探针可发生取代反应。

本发明所述体系中传感器基底、固定探针和巯基乙醇封板构成ecl传感器，其结构优选为在fto(掺杂氟的sno2导电玻璃)电极表面电镀一层au纳米花作为传感器的基底，然后组装一层发卡dna作为固定探针，再加入巯基己醇(mch)封板。本发明所述传感器基底的制备方法，优选包括：利用打孔胶带包裹清洗后干燥的fto玻璃，浸入电解质中进行电镀；所述电解质中包括0.05m磷酸盐缓冲液、0.054mkcl和5mmhaucl4。本发明所述清洗优选包括将fto玻璃切成宽和长为1cm×4cm的矩形后，用去离子水洗涤以除去微小碎片，再浸入含有2mkoh的沸腾2-丙醇中20min，水洗涤后再超声清洗15min。本发明所述干燥的温度优选为60℃。

本发明优选用打孔器在胶带上打孔，用所述胶带包裹上述fto玻璃(电极)后，留出圆孔大小的面用于沉积纳米金花。本发明在进行所述电镀前优选向所述电解质中充入n2，以除去氧气。本发明优选利用循环伏安法进行所述电镀，参数设定为：电压-0.8～0.3v、循环50次、扫描速率为0.1v/s；加热溶液至60℃并保持氮气氛围。随着反应的进行的金纳米花在fto表面上生长。无色玻璃逐渐转变成金色，表明金纳米花成功地沉积在fto上，得fto-au电极。

本发明所述链霉亲和素和葡萄糖氧化酶修饰的纳米金(god-au-sa)的制备方法，优选包括：将纳米金溶液与等体积的葡萄糖溶液和链霉亲和素溶液混合后，于4℃保持24h，将离心后得到的沉淀分散于缓冲液中，得链霉亲和素和葡萄糖氧化酶修饰的纳米金。本发明所述纳米金溶液的体积优选为500μl，溶液中纳米金的粒径优选为30nm，葡萄糖氧化酶溶液的浓度优选为15mg/ml，链霉亲和素溶液的浓度优选为1mg/ml。

本发明所述ecl传感器的制备方法，优选包括：在制备的fto-au电极上滴涂10μl10μm的固定探针，室温下过夜，之后将电极浸润在pbs溶液中2min以除去未能键合的过量固定探针。随后用10μl1mm巯基乙醇封板(mch)封闭电极上剩余的反应位点，1h后浸入pbs溶液中2min。

本发明实施例中以mirna-21为例，构建所述体系，其中所述固定探针的核苷酸序列如seqidno.1所示：tttttttcaacatcagtctgataagctaggcgggttgggtagcttatcagact；修饰有生物素的探针的核苷酸序列优选如seqidno.2所示：biotin-5’-ctgataagctacccaacccgcctagcttatcagactgatgtgggtagggcgggttggg-3’。本发明对所述固定探针和修饰有生物素的探针的来源并没有特殊限定，优选由大连宝生物合成。

本发明所述体系的原理如图2所示，通过探针dna的设计，当溶液中出现靶标mirna时，固定探针的发卡结构被打开，在修饰有生物素的探针存在的情况下，打开固定探针的发卡结构，从而与修饰有生物素的探针发生取代反应，进而替换出靶mirna，由此靶mirna在修饰有生物素的探针的存在时被循环利用，实现了信号放大作用，提高了检测的灵敏度。同时利用核酸链替换反应对核酸序列极高的序列准确性要求，提高了检测的特异性和选择性。核酸循环反应之后，最终在传感界面产生大量的带有生物素的双链dna，与带有亲和素和葡萄糖氧化酶的纳米金结合，金纳米颗粒表面的葡萄糖氧化酶催化溶液中的葡萄糖和氧气反应，产生大量的双氧水，并且打开的发卡dna末端含有大量的g四联体结构并与溶液中的血红素hemin形成hemin/g四联体结构，该结构具有类过氧化物酶的作用，能够催化双氧水产生ecl共反应剂过氧自由基，构建了自产生共反应剂的ecl检测体系，提高了检测的操作便利，同时排除了人为干扰因素。

本发明还提供了上述体系在检测mirna中的应用。

本发明所述mirna优选包括mirna-21(seqidno.3)：5’-uagcuuaucagacugauguuga-3’。

本发明在利用上述体系在检测mirna-21时，优选的取10μlmicrorna-21、10μl10μm生物素修饰的探针滴加在电极表面，37℃孵育2h后，pbs溶液清洗。加入10μl制备的god-au-sa、10μlhemin(10mm)37℃孵育2h后pbs溶液处理2min，最后将组装好的电极浸入在0.01mpbs(0.1mmluminol，20mm葡萄糖)溶液中反应1h后再进行ecl测试。

下面结合实施例对本发明提供的一种检测mirna的共反应剂信号放大电化学发光体系进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

本方法所用仪器装置为：微量紫外分光光度计(thermonanodrop-2000c，美国)，透射电子显微镜(jem-2100，日立)，扫描电子显微镜(zeisssupra55)，chi660b(上海辰华仪器公司，中国)电化学工作站，mpi-e多功能电化学和化学发光分析系统(中国西安)。

实验中采用三电极系统，fto(工作电极)，sce电极(参比电极)和铂丝电极(对电极)组成，光电倍增管电压设置为-600v(pmt)。

本方法所用实验试剂为：kcl、luminol、haucl4.4h2o、mch购于aladdin-reagent(中国上海)，mgcl2.6h2o、双氧水、氯高铁血红素(hemin)、三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(tcep)、葡萄糖氧化酶(god)、链霉亲和素(sa)、葡萄糖(sigma)购于沪剂(中国上海)，dna和rna由大连宝生物合成，序列如下：

固定探针(seqidno.1，dna1)：sh-5’-tttttttcaacatcagtctgataagctaggcgggttgggtagcttatcagact-3’；

修饰有生物素的探针(seqidno.2，dna2)：biotin-5’-ctgataagctacccaacccgcctagcttatcagactgatgtgggtagggcgggttggg-3’；

mirna-21(seqidno.3)：5’-uagcuuaucagacugauguuga-3’；

单碱基错配mirna-21(seqidno.4)：5’-uagcuuaucacacugauguuga-3’；

三碱基错配mirna-21(seqidno.5)：5’-uagcuuaucacugugauguuga-3’；

非互补序列(seqidno.6)：5’-guaugguaagcugaauacaacu-3’。

实施例1

制备fto-au电极

将fto玻璃切成1cm×4cm片大小，然后用去离子水洗涤以除去微小碎片。将它们全部浸入含有2mkoh沸腾的2-丙醇中保持20min，水洗涤后超声清洗15分钟并在60℃下干燥。将胶带用打孔器打孔后包裹fto电极，留出圆孔大小的面用于沉积纳米金。将fto玻璃片浸入5.0ml由0.05m磷酸盐缓冲液(ph＝2)，0.054mkcl和5mmhaucl4组成电解质中。电镀前向溶液中通入n2以除去氧气。循环伏安法参数设定为：电压-0.8-0.3v(vssce)、循环50次、扫描速率为0.1v/s。加热溶液至60℃并保持在氮气氛围下，随着反应的进行的金纳米花在fto表面上生长，无色玻璃逐渐转变成金色，表明金纳米花成功地沉积在fto上，其扫描电镜图如图1所示。

实施例2

ecl传感器的构建

在500μl30nm纳米金溶液中加入等体积的葡萄糖氧化酶(15mg/ml)与链霉亲和素(1mg/ml)4℃下保持24h后离心清洗分离，将得到的沉淀重新分散于缓冲液中得到链霉亲和素与葡萄糖氧化酶修饰的纳米金(god-au-sa)，4℃保存备用。

在制备的fto-au电极上滴涂10μl10μmdna1室温下过夜，之后将电极浸润在pbs溶液中2min以除去未能键合的过量dna1。随后用10μl1mmmch封闭电极上剩余的反应位点，1h后浸入pbs溶液中2min。

实施例3

对不同浓度的样品进行检测以及标准曲线的绘制

取10μl不同浓度的microrna-21(0,1fm,5fm,10fm,50fm,0.1pm,1pm,10pm)、10μl10μmdna2滴加在电极表面37℃孵育2h后，pbs溶液清洗。加入10μl制备的god-au-sa、10μlhemin(10mm)37℃孵育2h后pbs溶液处理2min，最后将组装好的电极浸入在0.01mpbs(0.1mmluminol，20mm葡萄糖)溶液中反应1h后再进行ecl测试，测试结果如图3中a所示，随着待测液中microrna-21浓度的增加，检测的电化学发光响应信号也出现增强趋势，根据电化学发光响应信号与目标物浓度的关系作图得标准曲线(如图3中b所示)，并根据标准曲线计算线性回归方程为y＝720.855x+11937.582，其中y为鲁米诺的电化学发光强度(图3中b的纵坐标)，x为目标物microrna-21的浓度的对数(图3中b的横坐标)。

实施例4

对传感器的选择性测定及稳定性测定

(1)选择性实验：使用目标mirna-21(seqidno.3)、单碱基错配mirna-21(seqidno.4)、三碱基错配mirna-21(seqidno.5)、非互补序列()seqidno.6以及空白组(不存在目标mirna-21)来验证该传感器的选择性。

结果如图4所示，当存在过量的单碱基错配mirna-21(10pm)、三碱基错配mirna-21(10pm)及非互补序列(10pm)时，与空白试验相比，ecl信号响应非常微小。当目标mirna-21存在时，ecl信号强度显著增强。表明由于核酸链置换反应的高度序列依赖性，使得该传感器对于mirna-21的检测方法具有良好的选择性；

(2)稳定性实验：使用浓度为1pm的mirna-21样品反复检测多次，发现ecl信号响应变化非常稳定，证明检测体系具有比较好的稳定性。

实施例5

针对不同肿瘤细胞提取液中mirna的检测

实验中所使用的人宫颈癌细胞hela细胞以及人乳腺癌细胞mcf-7细胞由keygenbiotech(中国南京)提供。细胞在由dmem，10％胎牛血清(fbs)和1％链霉素和青霉素组成的培养液中培养，恒温孵育箱设定为37℃、5％co2、95％空气。

实验时使用指数生长期的细胞，使用前用冰冷的无菌pbs洗涤两次。rna通过试剂盒(invitrogenbiotechnology)提取得到。结果如图5所示，两种细胞中提取液中mirna的含量有所不同，相同细胞浓度下mcf-7细胞提取液的mirna-21含量要高于hela细胞，且随着细胞浓度的增加，两种细胞提取液中mirna-21的含量也随之增加。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>青岛科技大学

<120>一种检测mirna的自产生共反应剂信号放大电化学发光体系

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>53

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tttttttcaacatcagtctgataagctaggcgggttgggtagcttatcagact53