一种防治瓜列当的活性物质及其提取方法与应用与流程

本发明涉及应用农业微生物与生物防治技术领域，具体涉及一种防治瓜列当的活性物质及其提取方法与应用。

背景技术：

瓜列当(orabancheaegyptaica)是全寄生性高等植物，广泛地分布在地中海地区、亚洲西部和欧洲东部，对当地的农作物生产造成巨大的影响，被认为是世界范围内危害最严重的寄生性杂草。我国瓜列当主要分布于新疆、吉林、甘肃、黑龙江、河北、山东、山西、陕西、辽宁、青海、内蒙古、四川等多个省份。我国新疆是瓜列当分布和危害严重的地区，其对甜瓜、西瓜和番茄可造成半成以上的减产。由于瓜列当没有独自的根，靠独特的器官“吸盘”截流寄主的水分和营养成分维持生长，使寄主生长受到影响，给农作物产量和品质造成严重损失。轮作、施肥、深耕、土壤暴晒和人工拔除等措施在一定程度上虽能够减轻列当危害，但费工费时，效果不佳。除了耐化学除草剂的转基因作物，现有化学除草剂不能区分作物和瓜列当。由于无法有效防除瓜列当，严重影响了新疆瓜类作物和工业番茄的生产。

微生物源除草剂是利用微生物产生的代谢产物进行杂草防治的一种新型生物除草剂。通常大多数微生物如细菌、放线菌、腐生类微生物、植物病原真菌以及藻类等都含有除草活性化合物，是开发除草剂的天然宝库。近几年利用天然化合物防治瓜列当已经成为研究的热点之一。利用微生物代谢产物，以及这些代谢产物的人工模拟化合物研究开发具有高活性﹑高选择性﹑高安全性天然除草剂将会是新型除草剂发展的重要方向之一。

我们的先前研究发现贝莱斯芽孢杆菌gdmccno.60755的发酵液具有防治瓜列当的作用，但是其发酵液中的成分很多，具体是哪一种物质成分发挥作用尚不明确。因此，有必要从贝莱斯芽孢杆菌gdmccno.60755的发酵液提取获得活性单体物质，从而提供一种有效防治瓜列当的微生物菌株及其活性次级代谢产物。

技术实现要素：

为了解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种防治瓜列当的活性物质及其提取方法与应用，通过从贝莱斯芽孢杆菌gdmccno.60755发酵液中提取出防治瓜列当的活性物质，确定了贝莱斯芽孢杆菌gdmccno.60755发酵液中的有效成分，得到的单体活性物质，为防治瓜列当提供了一个新的路径。

本发明所采用的技术方案如下：

根据本申请的一个方面，提供了一种防治瓜列当的活性物质的提取与鉴定方法，该方法包括以下步骤：

(1)将贝莱斯芽孢杆菌gdmccno.60755进行液体发酵，得到发酵液；

(2)使用大孔树脂对发酵液进行提取，得到提取液，将所述提取液进行减压蒸馏后，得到粗提物；

(3)将所述粗提物进行硅胶柱层析色谱分离，得到活性组分；

(4)将活性组分使用半制备高效液相色谱分离纯化，得到活性物质六氢-3-[(4-羟基苯基)甲基]吡咯并[1,2-α]吡嗪-1,4-二酮(l2-11-1)和六氢-7-羟基-3-(苯甲基)吡咯并[1,2-α]吡嗪-1,4-二酮(l2-11-2)。

进一步的，步骤(1)中，所述贝莱斯芽孢杆菌gdmccno.60755在nb培养液中进行液体发酵，

所述发酵包括：在温度25～30℃、以转速150～200r/min下振荡培养18～36h。

进一步的，步骤(2)中，所述大孔树脂为xad-16树脂；

所述提取的步骤包括：将发酵液接种于含有大孔树脂的nb培养液进行培养，将所述大孔树脂清洗、烘干后，用甲醇浸泡，得到提取液。

进一步的，步骤(2)中，将所述提取液进行旋转蒸发减压蒸馏后，得到粗提液，将粗提液用甲醇溶液溶解后，使用二氯甲烷萃取，将有机相浓缩后，得到所述粗提物。

在如上所述的本发明方法中，本领域技术人员应当理解所述有机溶剂包括多种不溶于水的在室温下是液态的有机溶剂，诸如氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、苯、丙酮、甲醇等，优选地，所述有机溶剂是二氯甲烷。

进一步的，步骤(3)和(4)中，将所述粗提物用甲醇溶解后，进行减压硅胶柱层析色谱分离而得到活性组分溶液，将所述活性组分溶液用高效液相色谱分离得到活性物质六氢-3-[(4-羟基苯基)甲基]吡咯并[1,2-α]吡嗪-1,4-二酮(l2-11-1)和六氢-7-羟基-3-(苯甲基)吡咯并[1,2-α]吡嗪-1,4-二酮(l2-11-2)。

进一步的，步骤(4)中，将所述活性物质使用质谱与核磁共振波谱进行分析。

根据本申请的另一个方面，提供了一种防治瓜列当的活性物质，所述活性物质包括六氢-3-[(4-羟基苯基)甲基]吡咯并[1,2-α]吡嗪-1,4-二酮和六氢-7-羟基-3-(苯甲基)吡咯并[1,2-α]吡嗪-1,4-二酮。

根据本申请的另一个方面，提供了所述的活性物质在抑制瓜列当种子萌发中的应用。

根据本申请的另一个方面，提供了六氢-3-[(4-羟基苯基)甲基]吡咯并[1,2-α]吡嗪-1,4-二酮在抑制瓜列当种子萌发中的应用。

根据本申请的另一个方面，提供了六氢-7-羟基-3-(苯甲基)吡咯并[1,2-α]吡嗪-1,4-二酮在抑制瓜列当种子萌发中的应用。

本发明的有益效果包括但不限于：

(1)本发明涉及的防治瓜列当的活性物质的提取方法，通过从贝莱斯芽孢杆菌gdmccno.60755发酵液中提取获得出防治瓜列当的活性物质，确定了贝莱斯芽孢杆菌gdmccno.60755发酵液中的有效成分，得到天然活性物质，为防治瓜列当提供了一个新的路径。

(2)本发明涉及的防治瓜列当的活性物质的提取方法，首次提取得到化合物六氢-3-[(4-羟基苯基)甲基]吡咯并[1,2-α]吡嗪-1,4-二酮和六氢-7-羟基-3-(苯甲基)吡咯并[1,2-α]吡嗪-1,4-二酮，为这两种天然化合物的开发研究提供了一个新的思路。

(3)本发明涉及到的应用，首次公开了化合物六氢-3-[(4-羟基苯基)甲基]吡咯并[1,2-α]吡嗪-1,4-二酮和六氢-7-羟基-3-(苯甲基)吡咯并[1,2-α]吡嗪-1,4-二酮抑制瓜列当种子萌发的作用，可以将这两种化合物直接用于防治瓜列当，对瓜列当的抑制作用显著。

附图说明

图1为本发明实施例中的化合物l2-11-1的核磁共振氢谱图；

图2为本发明实施例中的化合物l2-11-1的核磁共振碳谱图；

图3为本发明实施例中的化合物l2-11-2的核磁共振氢谱图；

图4为本发明实施例中的化合物l2-11-2的核磁共振碳谱图；

图5为本发明实施例中的化合物l2-11-2的正离子源质谱数据图；

图6为本发明实施例中的化合物l2-11-1的负离子源质谱数据图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，以下实施例仅为方便本领域技术人员理解本发明技术方案，实现或使用本发明所做的说明，并不以此限定本发明的保护范围。

本发明中，如未指定，所采用原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。实施例中的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

实施例中所用的菌株贝莱斯芽孢杆菌b.velezensis于2019年09月04日，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为gdmccno.60755。

实施例1活性物质的提取方法

(1)贝莱斯芽孢杆菌菌株b.velezensis的液体发酵

将保存的贝莱斯芽孢杆菌菌株转接到na培养基上，28℃下培养24h。挑取单菌落接种于装有5mlnb培养液的试管中，并在28℃、180r/min下振荡培养24h，得到一级种子发酵液。将一级种子发酵液转接到50ml/250ml的nb培养液中，于28℃、180r/min下振荡培养24h，得到二级种子发酵液；na培养基：蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，琼脂15g，水1000ml，ph7.2～7.4；nb液体培养基：蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，水1000ml，ph7.2～7.4。将发酵液以5％的接种量接种于装有9gxad-16大孔树脂和200mlnb培养液的1l三角瓶中，于28℃、180r/min下振荡培养培养5d。

(2)粗提物的提取

摒弃上述三角瓶中的发酵液，留下大孔树脂并用蒸馏水反复清洗直至干净，28℃下烘干。烘干后的树脂用甲醇浸泡得到甲醇浸提液，反复浸泡3次。收集浸提液进行旋转蒸发减压蒸馏，得到粗提物浸膏。用质量分数为50％的甲醇水溶液将粗提物浸膏再次溶解，用一倍体积的二氯甲烷萃取4次。收集有机相，真空浓缩，得到提取物浸膏6.5g，即为所述粗提物。

(3)化合物的分离纯化

将6.5g粗提物用石油醚-乙酸乙酯-甲醇体系进行减压硅胶柱层析，按照极性由小到大的顺序将粗提物分成20个组分，命名为l2-1～20，在活性跟踪(分别测试l2-1～20对瓜列当种子萌发的抑制活性)指导下，发现在石油醚:乙酸乙酯＝3:1作为流动相洗脱得到的组分(l2-11)有抑制活性，收集活性洗脱液(88mg)。

对馏分l2-11进行hplc半制备液相纯化，获得目标化合物l2-11-1和l2-11-2。其中hplc的条件是：采用agilent1260型半制备高压液相色谱仪，kromasil100-5-c18反相半制备色谱柱(10μm、10x250mm)，流速2.0ml/min，用色谱甲醇和水作为流动相，制备条件：40％甲醇/水等度洗脱20min，得到6.1mg化合物l2-11-1(保留时间tr＝9.1min)和20mg化合物l2-11-2(保留时间tr＝11.99min)。

将充分干燥的化合物l2-11-1和l2-11-2用500～600ul氘代丙酮完全溶解后转移至核磁管内密封，用于测试¹h-nmr和¹³c-nmr核磁共振波谱，核磁谱的测定由中国科学院微生物研究所代为完成测定。

实施例2化合物l2-11-1和l2-11-2结构鉴定

化合物l2-11-1：淡黄色油状固体，易溶于甲醇和氘代丙酮。根据质谱显示化合物的[m-h]^-分子离子峰为259.0(图6)，推断其分子式为c14h16n2o3，进一步通过其核磁共振氢谱(¹h-nmr)和碳谱(¹³c-nmr)与文献(j.nat.prod.1994,57,6,829–832)报道的已知化合物cyclo(prolyltyrosyl)进行对比分析，确定了其结构式如式ⅰ所示，化学名称为六氢-3-[(4-羟基苯基)甲基]吡咯并[1,2-α]吡嗪-1,4-二酮。

化合物l2-11-2：淡黄色油状固体，易溶于甲醇和氘代丙酮。根据质谱显示化合物的[m+h]⁺分子离子分为261.2(图5)，推断其分子式为c14h16n2o3，进一步通过其核磁共振氢谱(¹h-nmr)和碳谱(¹³c-nmr)与文献(j.am.chem.soc.1989,111,2,647–654)报道的已知化合物cyclo(4-hydroxyprolylphenylalanyl)进行对比分析，确定了其结构式如式ⅱ所示，化学名称为和六氢-7-羟基-3-(苯甲基)吡咯并[1,2-α]吡嗪-1,4-二酮。

本发明制备的化合物l2-11-1和l2-11-2氢谱(¹h-nmr)和碳谱(¹³c-nmr)如图1-4所述，具体数据见表1，l2-11-2的质谱数据图如图5-6所示。

表1化合物l2-11-1和l2-11-2的碳谱、氢谱nmr数据(acetone-d6)

综上，从贝莱斯芽孢杆菌b.velezensis中提取并分离了天然化合物l2-11-1和l2-11-2，经过进一步的纯化，结合高效液相色谱，质谱和核磁共振技术分析鉴定该化合物的结构特征。

实施例3天然化合物l2-11-1和l2-11-2对瓜列当种子萌发抑制作用测定a、瓜列当种子消毒：将瓜列当种子在75％的酒精中消毒1.5min后转至1％的次氯酸钠消毒12min，无菌滤纸上晾干备用。

b、溶液配制：将核磁管内溶液进行氮吹，吹干后测得l2-11-1和l2-11-2的质量分别为4mg和12mg。分别加入100μl甲醇进行溶解，在l2-11-1中加入4.39ml无菌水配成2mm母液，再将其稀释成1mm和0.5mm；在l2-11-2中加入13.16ml无菌水配成2mm母液，再将其稀释成1mm和0.5mm。

c、瓜列当种子萌芽抑制测定：于24孔板中每孔加入100粒左右消毒干燥的瓜列当种子，处理组分别加入0.5ml独脚金内酯(gr24)和0.5ml的2mm、1mm和0.5mm的化合物溶液，处理组最终浓度为1mm、0.5mm和0.25mm，对照组为0.5ml独脚金内酯(gr24)和0.5ml无菌水，每处理3次重复。25℃，遮光培养5d后，体式显微镜下观察瓜列当种子萌芽数量并记录。计算不同处理对瓜列当种子萌发抑制率，如表2所示。

表2不同浓度化合物对瓜列当种子萌发抑制率(％)的比较

由表2的结果可知，上述化合物l2-11-1和l2-11-2对瓜列当种子的萌发均有一定的抑制率，化合物l2-11-1对瓜列当种子的萌发的抑制作用较好，且浓度越高，对瓜列当种子的萌发的抑制作用越好。

以上对本发明所提供的防治瓜列当的活性物质及其提取方法与应用进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和优化，这些改进和优化也落入本发明权利要求的保护范围内。

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