原因不明复发性流产相关易感基因多态性检测试剂盒的制作方法

2021-02-02 18:02:46|

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本发明属于分子生物学和医学领域，具体涉及一种基于多重荧光pcr技术用于原因不明复发性流产相关易感基因多态性检测的试剂盒、检测方法及其应用。

背景技术：

自然流产是孕早期最常见的并发症，流行病学研究发现，约1%-5%的孕妇会出现复发性流产，复发性流产（recurrentspontaneousabortion，rsa）是指连续发生2次或2次以上的自然流产，其发病原因极其复杂，排除胚胎染色体异常，子宫畸形或宫腔粘连等原因，而60%-70%无法找到明确的原因，临床上称不明原因复发性自然流产（unexplainedrecurrentspontaneousabortion，ursa），给孕妇带来极大的身心伤害，影响了其家庭幸福和社会稳定，已成为影响生殖健康的重大公共卫生和社会问题，采用个体化医学的思路，在明确病因学诊断后有针对性地给予个性化治疗，并重视对保胎治疗成功rsa患者所生婴儿进行出生缺陷筛查和胎儿宫内发育监测，从而可进一步取得理想疗效，因此，流产的基础研究和应用研究已成为人口健康科学研究优先考虑的重要内容。

同时近几年越来越多的研究发现，约70%的散发性自然流产其胚胎染色体异常，被认为是最常见的早期自然流产病因，但在rsa患者中，胚胎染色体异常的概率只占25%～32%，只能解释小部分rsa的病因，另外，解剖因素、内分泌因素、感染因素、男方特有因素，环境因素和精神心理因素等不同的因素都不同程度引起自然流产，但不同研究者对病因的分类和作用强度尚未形成共识，总之，rsa的病因较多且各因素之间错综复杂，且仍有部分患者病因未明，给临床诊断和治疗带来很大困难，探讨rsa的病因有助于进一步认识rsa的发病过程，提高该病的诊断、治疗及预防。随着现代医学的不断发展，尤其是现代分子细胞技术的进步，rsa的病因学研究更加深入，会使得rsa的诊断与治疗进一步完善,临床医生应在详细了解患者及其配偶相关病史基础上，针对不同患者进行相应辅助检查，以便快速、准确查明病因，指导治疗。

随着分子生物技术的发展，传统细胞培养后，染色体核型g-显带技术是目前自然流产查因的主要技术手段，但其技术要求高，费时费力，操作过程极易受到外界环境污染，从而影响对结果的判断，＜３-５ｍｂ的染色体异常无法检测到，且存在10-40%的样本因培养失败、细菌或真菌感染、母血污染等原因而未能给出检测结果。因此，目前认为核型分析无法检测的染色体异常，可由荧光原位杂交技术（fluorescenceinsituhybridization,fish）、多重探针连接依赖性扩增技术(multiplexligation-dependentprobeamplification,mlpa)、染色体微阵列分析（chromosomalmicroarrayanalysis，cma）、细菌人工染色体标记－聚苯乙烯微球鉴别/分离技术（bobs^tm）等来替代核型分析。但fish和mlpa技术存在无法检测出结构异常和检测的染色体数目和基因组覆盖度有限，cma和bobs^tm技术不适合作为一线检测，存在检测成本高，检测技术难度大的缺点，与之相比，基于熔解曲线的荧光pcr技术具有较高的性价比，此技术是在在普通pcr的基础上增加荧光标记的探针，随着pcr产物的不断增加，荧光的强度不断增强，则可以检测到一个荧光增长曲线，pcr结束后进行融解分析，根据熔解曲线的不同来对样品进行分型。该方法因其快速、通量大、使用成本低、结果准确，并且实现了真正的闭管操作而受到普遍的关注。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种简单、中通量、高效能、低成本的适合中国人群的原因不明复发性流产相关易感基因多态性检测试剂盒。本发明包括用于检测原因不明复发性流产相关易感基因2个多态性位点同时检测，还适用于一般荧光pcr仪，从而准确对中国人群原因不明复发性流产相关的易感基因2个多态性位点进行基因分型。其包括：

1）用于检测原因不明复发性流产相关的易感基因mthfr基因的c677t位点和mthfr基因的a1298c位点的pcr扩增引物的混合液；

2）针对上述2个snp位点的探针混合液，所述mthfr基因的c677t位点的探针5’端的荧光基团为fam，3’端的淬灭基团为bhq1；所述mthfr基因的a1298c位点的探针5’端的荧光基团为rox，3’端的淬灭基团为bhq2；

3）dntp；

4）10×pcr缓冲液；

5）25mmmg²⁺离子；

6）faststarttaq酶；

7）去离子水。

所述检测mthfr基因的c677t位点的pcr扩增引物序列一致，具体序列如seqidno.1至seqidno.2所示。

所述检测mthfr基因的a1298c位点的pcr扩增引物序列一致，具体序列如seqidno.3至seqidno.4所示。

所述检测mthfr基因的c677t位点的pcr探针序列一致，具体序列如seqidno.5所示。

所述检测mthfr基因的a1298c位点的pcr探针序列一致，具体序列如seqidno.6所示。

进一步的，以针对所述mthfr基因的c677t位点和mthfr基因的a1298c位点而设计的探针的终浓度分别为0.1μm、0.16μm。

本发明的又一目的在于提供一种检测原因不明复发性流产相关的易感基因多态性检测方法，其包括：

（1）提取待测样本的基因组dna；

（2）将骤（1）得到的dna加入到mthfr基因的c677t位点和mthfr基因的a1298c位点的pcr反应液中进行pcr扩增，并对扩增产物进行熔解分析，进行数据采集和分析，获得基因分型的结果。

本发明的另一目的在于提供前述任一项中国人群原因不明复发性流产相关的易感基因多态性检测试剂盒在复发性流产人群检测中的应用。

本发明的又一目的在于提供一种检测系统，其包含本发明所述试剂盒。

本发明的有益效果是:

1、本案发明人经大量研究和实践，通过google数据库、pubmed数据库及hgmd数据库检索对中国人群原因不明复发性流产相关的易感基因多态性位点进行了筛选和组合，并构建了本发明的试剂盒，利用该试剂盒，可针对2个不同基因的snp位点同时进行熔解分析，一次性获得不同的基因型，弥补目前现有突变检测方法的不足，其操作简便，成本低，且检测通量和检测结果的准确性等均有大幅提升，具有较高的规模化临床应用价值。

2、基于改良的分子信标探针用于熔解曲线方法的基础上，成功应用于mthfr基因的c677t和a1298c多态性位点检测，分别仅用一条改良的分子信标探针，建立了一种成本低廉、操作简单、结果判读清晰、易于临床推广的叶酸代谢基因多态性的检测试剂盒。本发明采用改良的分子信标探针结果多重荧光熔解曲线技术，建立了高效的扩增体系，无开盖污染、价格低廉、高效和准确。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明一典型实施方案中利用该中国人群原因不明复发性流产相关的易感基因多态性检测试剂盒进行基因检测的工艺流程图；

图2为本发明一典型实施方案中获得的融解峰值曲线结果；

图3为本发明一典型实施方案中获得的扩增曲线结果。

具体实施方式

下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。

一种中国人群原因不明复发性流产相关的易感基因多态性检测试剂盒、检测方法及其应用，它能针对目前中国人群复发性流产相关mthfr基因的c677t位点（rs1801133）和mthfr基因的a1298c位点（rs1801131）作为检测目标，提供一种操作简便，快速，成本低，且检测通量和检测结果的准确性等较之现有技术均有大幅提升的原因不明复发性流产相关的易感基因多态性检测方法。

本发明原因不明复发性流产相关的易感基因多态性检测试剂盒包括：引物混合液、pcr探针混合液、dntp、10×pcr缓冲液、25mmmg²⁺离子、去离子水、fasttaq酶。

从上述描述可知，本发明的有益效果在于：基于改良的分子信标探针用于熔解曲线方法的基础上，成功应用于mthfr基因的c677t和a1298c多态性位点检测，分别仅用一条改良的分子信标探针，建立了一种成本低廉、操作简单、结果判读清晰、易于临床推广的叶酸代谢基因多态性的检测试剂盒。本发明采用改良的分子信标探针结果多重荧光熔解曲线技术，建立了高效的扩增体系，无开盖污染、价格低廉、高效和准确。

表1mtfhr基因c677t和a1298c位点引物和探针序列

进一步的，pcr引物浓度和探针浓度进行优化配置，使其能够在熔解反应时兼顾各个位点的产量，所述mthfr基因的c677t和a1298c位点引物浓度终浓度分别为0.4μm、0.5μm，所述mthfr基因的c677t位点和mthfr基因的a1298c位点而设计的探针的终浓度分别为0.1μm、0.16μm。

进一步的，所述mthfr基因的c677t探针标记fam荧光基团和bhq1淬灭基团，所述mthfr基因的a1298c探针标记rox荧光基团和bhq2淬灭基团。

本发明的mthfr基因的c677t和a1298c位点的扩增片段长度、具体的引物序列和探针序列，可参考表1。

基于该试剂盒的检测方法为：通过多重pcr扩增，使被检测样本的2个目的片段得到扩增富集，所述pcr扩增富集条件设置为：95℃下预变性10min；95℃下变性30s，50-55℃退火90s，72℃延伸5min，40个循环。之后，再进行熔解曲线分析，熔解程序为：95℃30s；40℃下5min；40℃-80℃采集fam和rox通道荧光信号。

结果判断：根据熔解峰对应的tm值进行结果判断，每条探针检测出野生型、杂合突变和纯合突变3种峰型。最终优选mthfr基因的c677t位点：fam通道dtm65℃±0.6℃，a1298c位点：rox通道dtm72℃±0.5℃。

本具体实施方式具有成本低廉、操作简单、结果判读清晰、易于临床推广，适合原因不明复发性流产相关易感基因多态性检测。采用改良的分子信标探针结合多重荧光熔解曲线技术，建立了高效的扩增体系，无开盖污染、价格低廉、高效和准确。

以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

参照图1至图3所示，在本实施例中，提供了一种适用于原因不明复发性流产相关易感基因mtfhr的c677t和a1298c位点多态性检测的试剂盒（96人份），其可在体外完成中国人群原因不明复发性流产相关易感基因多态性的筛查。

1、检测样本

样本来源于苏州市立医院生殖与遗传中心、妇产科、妇女保健科等原因不明复发性流产的样本dna文库，库中所有患者样本收集前均签署了知情同意书，并承诺配合后续的诊疗和随访。

2、检测方案

本方案采用病例对照研究的方法，对170例苏南地区不明原因复发性流产者（病例组）和170例正常妇女（对照组），利用pcr荧光探针技术检测mthfr基因c677t、a1298c位点的单核苷酸多态性。

3、检测结果

病例组mthfrc677t位点的tt基因型的发生频率（34.1%）显著高于对照组（17%），ｔ等位基因频率（58.8%）同样高于对照组（45.3%），差异均有统计学意义（p<0.05），而病例组mthfr基因a1298c位点的cc基因型频率和ｃ等位基因频率与对照组的相比，差异均无统计学意义（p>0.05），参见表2,3。

针对mthfr基因c677t位点，设定入组人群中cc基因型者发生原因不明复发性流产的风险为对照（设定数值为1.0）。携带ct基因型者发生流产的风险为对照的1.266倍，95％ci值为（0.76～2.10），但差异无统计学意义（ｐ＝0.36）；携带tt基因型者发生流产的风险为对照组的2.895倍，９５％ci值为（1.58～5.32），差异有统计学意义（ｐ＝0.001）。

表2mthfr基因型频率分布比较［ｎ（％）］

表3mthfr等位基因频率分布比较［ｎ（％）］

综上所述，本研究提示mthfr基因c677t位点多态可能是苏南地区汉族人原因不明复发性流产发病的遗传风险因素，因此，妊娠前进行mthfrc677t位点多态的检测，并根据基因型有针对性地增加叶酸的补服，可有效避免治疗的盲目性，对于原因不明复发性流产夫妇具有重要的指导意义。

本发明的筛查方法及试剂盒使用方便，操作简单，成本低，检测结果直接可靠，适合于中国人群原因不明复发性流产相关基因多态性检测的大规模筛查。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>苏州市立医院

<120>原因不明复发性流产相关易感基因多态性检测试剂盒

<140>2020107659922

<141>2020-08-03

<160>6

<170>siposequencelisting1.0