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您当前的位置： 一种认知障碍和运动障碍相关基因的捕获方法和试剂盒与流程
2021-02-02 18:02:46|
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起点商标网 本发明属于分子诊断领域，涉及一种用于认知障碍和运动障碍相关基因的捕获方法和试剂盒，具体涉及血液中的分子标志物的检测及其分子诊断应用。
背景技术：
：认知是机体认识和获取知识的智能加工过程，涉及学习、记忆、语言、思维、精神、情感等一系列随意、心理和社会行为。认知障碍指与上述学习记忆以及思维判断有关的大脑高级智能加工过程出现异常，从而引起严重学习、记忆障碍，同时伴有失语或失用或失认或失行等改变的病理过程。最常见引起认知障碍的疾病为各种疾病引起的痴呆，痴呆的患病率高，致残、致死率高，为增龄性疾病，已成为西方发达国家老年人群中仅次于癌症、心脏病和脑卒中的第四位死因，加之其病程长，医疗和照料负担重，直接和间接医疗费用均很高(2010年全球用于痴呆的总花费达6040亿美元)，已成为老龄化社会面临的重要卫生服务问题和社会经济负担问题。我国每年新发痴呆病例约为180万；根据2010年第六次全国人口普查结果，全国登记总人口为“13.4亿，其中65岁及以上人口占13.26％，根据65岁以上人群痴呆患病率(4.8％)，我国现有痴呆患者至少已达850万。运动障碍疾病(movementdisorders)又称锥体外系疾病(extrapyramidaldiseases),是一一组常见的神经系统疾病，其生要表现为随意运动调节功能障碍而肌力、感觉和小脑功能不受影响。最常见的帕金森病，临床表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势步态异常等。我国北京、西安上海三地流行病学调查显示65以上人群患病率为1.7％。估计全国每年新发患者数达10万以上，我国现有帕金森病患者人数约200万。测序技术可以帮助我们对认知障碍和运动障碍相关基因有更全面的了解，研究发现，多种认知障碍疾病可能伴随步态异常等运动障碍表现，而运动障碍疾病也可伴发认知功能异常，认知障碍和运动障碍在遗传背景和发病机制上存在共线性部分，而现有测序技术中还未出现对认知障碍和运动障碍相关基因的目标区域共同捕获测序，因此如需检测认知障碍和运动障碍相关基因需要对待测样品进行分开测序，成本均较高，步骤繁琐，分析工作量大，不利于高通量的对认知障碍和运动障碍相关基因进行测序分析。认知障碍和运动障碍的复杂度也体现在临床上的挑战。到目前为止，还不存在对于认知障碍和运动障碍早期阶段确定诊断的诊断试验。基因表达调控网络系统在癌症研究领域取得引人注目的进展，在许多肿瘤组织中如肺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌等，某些基因的表达水平与其来源正常组织存在稳定而明显的差异。不同组织来源的肿瘤，甚至同一组织来源不同分化状态的加瘤，基因表达谱都不尽相同，表明基因表达具有明显的组织特异性和发育阶段特异性。因为神经退行性疾病病理上的直接特征是疾病特异性蛋白质的过量表达，所以推测特异性基因的异常改变了功能蛋白的表达水平，从而引起了疾病。现已越来越多的研究发现特异基因能够成为诊断帕金森的生物标志物，如以下申请号的专利公开的：201510713527.3、201510464905.9、201510463593.x、201510463617.1、201510809837.5。大部分疾病都是多基因调控的疾病，为了提高疾病的诊断准确率，将大量基因联合诊断成为必然，因此需要发掘更多与帕金森病相关的分子比标志物以便临床应用。技术实现要素：为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于认知障碍和运动障碍早期诊断的分子标志物。相比传统的帕金森症的诊断方法，使用基因标志物来诊断认知障碍和运动障碍的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。本发明的第一目的在于提供一种认知障碍和运动障碍相关基因的捕获探针组，缓解了现有技术中缺少一种能够有效捕获认知障碍和运动障碍相关基因的技术手段的问题。本发明的第二目的在于提供一种用于文库构建的试剂盒，缓解了现有技术中缺少一种能够有效捕获认知障碍和运动障碍相关基因的产品的问题。本发明的第三目的在于提供一种,上述捕获探针组、试剂盒方法在认知障碍和运动障碍相关基因筛查中的用途，以达到更深入的对认知障碍和运动障碍相关基因进行研究的目的。为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案:一种认知障碍和运动障碍相关基因的捕获探针组，所述捕获探针组捕获的基因和所述基因的染色体坐标信息如下表1所示:表1基因序列其中，所涉及到的具体的基因信息为：所述捕获探针组的设计按照如下规则:(a)探针长度为120bp；(b)探针设计合并相邻区域；(c)探针设计区间为目标区间向两翼扩展20bp；(d)探针参考为基因组正义链；(e)探针两翼的共有序列如seqidno.1和seqidno.2所示；(f)探针设计中通过比对全基因组信息确保探针特异性；(g)探针gc含量以30％-70％为标准，gc含量变化幅度偏离标准含量每增加10％,探针在该区域探针数量增加50％。(h)在基因组非捕获区域有近似序列的探针，每有一个近似序列，则该区域探针数量增加100％；所述近似序列为与探针序列的同源性至少为95％的序列。优选的，所述捕获探针组中的探针经过标记物标记，优选为经过生物素标记。优选的，所述试剂盒包含上述的捕获探针组；优选地，所述试剂盒还包括用于富集捕获的靶序列的pcr扩增引物:所述pcr扩增引物具有如seqidno.3和seqidno.4所示序列。优选的，所述试剂盒还包括用于多样本杂交捕获的接头用于文库杂交前封闭hybblock，所述试剂盒为安捷伦agilentsureselectqxtlibraryprepkit基因组dna建库试剂盒。优选的，所述试剂盒还包括与探针上的标记物亲和的磁珠；优选地，所述试剂盒中的捕获探针组中的探针经生物素标记，所述磁珠为亲和素偶联的磁珠，所述磁珠优选为链霉亲和素偶联的磁珠；优选地，所述试剂盒还包含用于提供杂交捕获反应的离子环境的缓冲液；优选地，所述试剂盒还包含用于洗脱物理吸附或非特异性杂交的清洗液。本发明同时提供上述试剂盒在知障碍和运动障碍相关基因筛查中的用途；优选地，所述测序为基于illumina测序平台的双末端测序，然后将测序结果与数据库进行对比。进一步的，本发明还提供了一种诊断认知障碍和运动障碍的工具，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测表1所述基因转录水平的针对表1所述基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的表1所述基因的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括表1所述基因在内的多个基因(例如，与帕金森症等认知障碍和运动障碍相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括表1所述基因在内的多个蛋白质(例如与帕金森症等认知障碍和运动障碍相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与帕金森症的标志物同时检测，可大大提高帕金森症等认知障碍和运动障碍诊断的准确率。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:本发明提供的认知障碍和运动障碍相关基因的捕获探针组包含了69个基因的编码区域，能针对特定的编码区域进行捕获，并进行高深度测序，使测序目标基因精准，测序成本降低。本发明提供的用于文库构建的试剂盒中包含上述捕获探针组，能够有效的捕获相关基因，可以降低相关基因的检测成本并且提高检测的灵敏度。本发明提供的上述捕获探针组、试剂盒方法在相关基因筛查中的用途，可以更深入的对认知障碍和运动障碍相关基因特点进行研究，不仅包括筛查样本中是否包含某些特点，还可以进一步的对这些基因的的snp(单核苷酸突变)，indel(碱基的插入缺失)cnv(拷贝数变异)进行分析。具体实施方式下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。需要说明的是，实施例中的反应体系和反应条件仅是一种举例。实施例中各步骤中的反应体系和反应条件均可以在可接受的范围内进行调整，以优化反应条件，本发明对此不做限制；探针长度根据合成的平台长度会有差异，本实施例中探针的长度为120bp,可以理解的是，只要复合本发明提供的探针的设计规则即可。实施例1认知障碍和运动障碍相关基因的捕获探针组本实施例提供了-组用于捕获认知障碍和运动障碍相关基因的捕获探针，该捕获探针组捕获的基因和所述基因的染色体坐标信息如下表所示:所述捕获探针组的设计按照如下规则:(a)探针长度为120bp；(b)探针设计合并相邻区域；(c)探针设计区间为目标区间向两翼扩展20bp；(d)探针参考为基因组正义链；(e)探针两翼的共有序列如seqidno.1和seqidno.2所示；编号序列(5‘-3’)seqidno.1gaagcgaggatcaactseqidno.2cattgcgtgaaccga(f)探针设计中通过比对全基因组信息确保探针特异性；(g)探针gc含量以30％-70％为标准，gc含量变化幅度偏离标准含量每增加10％,探针在该区域探针数量增加50％。(h)在基因组非捕获区域有近似序列的探针，每有一个近似序列，则该区域探针数量增加100％；所述近似序列为与探针序列的同源性至少为95％的序列。实施例2用于文库构建的试剂盒本实施例提供了一种构建痴呆相关基因的文库的试剂盒，该试剂盒包含如下试剂:①实施例1提供的痴呆相关基因的捕获探针组，并且该探针组经过生物素标记；和用于捕获杂交靶序列的经链霉亲和素标记的磁珠②用于多样本杂交捕获的接头用于文库杂交前封闭hybblock，所述试剂盒为安捷伦agilentsureselectqxtlibraryprepkit基因组dna建库试剂盒。③所述试剂盒还包括用于富集捕获的靶序列的pcr扩增引物:所述pcr扩增引物具有如seqidno.3和seqidno.4所示序列：编号序列(5‘-3’)seqidno.3gaagcgaggatcaactseqidno.4tcggttcacgcaatg⑤用于提供杂交捕获反应的离子环境的缓冲液(hybbuffer):10xsspe，10xdenhardt’s，10mmedta和0.2％sds。⑥用于洗脱物理吸附或非特异性杂交的清洗液washbufferl:1xssc/0.1％sds和washbuffer2:0.1mnaoh。最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。序列表<110>福建医科大学附属协和医院<120>一种认知障碍和运动障碍相关基因的捕获方法和试剂盒<130>jsp11901682<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>16<212>dna<213>（人工序列）<400>1gaagcgaggatcaact16<210>2<211>15<212>dna<213>（人工序列）<400>2cattgcgtgaaccga15<210>3<211>16<212>dna<213>（人工序列）<400>3gaagcgaggatcaact16<210>4<211>15<212>dna<213>（人工序列）<400>4tcggttcacgcaatg15当前第1页1 2 3
背景技术：
：认知是机体认识和获取知识的智能加工过程，涉及学习、记忆、语言、思维、精神、情感等一系列随意、心理和社会行为。认知障碍指与上述学习记忆以及思维判断有关的大脑高级智能加工过程出现异常，从而引起严重学习、记忆障碍，同时伴有失语或失用或失认或失行等改变的病理过程。最常见引起认知障碍的疾病为各种疾病引起的痴呆，痴呆的患病率高，致残、致死率高，为增龄性疾病，已成为西方发达国家老年人群中仅次于癌症、心脏病和脑卒中的第四位死因，加之其病程长，医疗和照料负担重，直接和间接医疗费用均很高(2010年全球用于痴呆的总花费达6040亿美元)，已成为老龄化社会面临的重要卫生服务问题和社会经济负担问题。我国每年新发痴呆病例约为180万；根据2010年第六次全国人口普查结果，全国登记总人口为“13.4亿，其中65岁及以上人口占13.26％，根据65岁以上人群痴呆患病率(4.8％)，我国现有痴呆患者至少已达850万。运动障碍疾病(movementdisorders)又称锥体外系疾病(extrapyramidaldiseases),是一一组常见的神经系统疾病，其生要表现为随意运动调节功能障碍而肌力、感觉和小脑功能不受影响。最常见的帕金森病，临床表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势步态异常等。我国北京、西安上海三地流行病学调查显示65以上人群患病率为1.7％。估计全国每年新发患者数达10万以上，我国现有帕金森病患者人数约200万。测序技术可以帮助我们对认知障碍和运动障碍相关基因有更全面的了解，研究发现，多种认知障碍疾病可能伴随步态异常等运动障碍表现，而运动障碍疾病也可伴发认知功能异常，认知障碍和运动障碍在遗传背景和发病机制上存在共线性部分，而现有测序技术中还未出现对认知障碍和运动障碍相关基因的目标区域共同捕获测序，因此如需检测认知障碍和运动障碍相关基因需要对待测样品进行分开测序，成本均较高，步骤繁琐，分析工作量大，不利于高通量的对认知障碍和运动障碍相关基因进行测序分析。认知障碍和运动障碍的复杂度也体现在临床上的挑战。到目前为止，还不存在对于认知障碍和运动障碍早期阶段确定诊断的诊断试验。基因表达调控网络系统在癌症研究领域取得引人注目的进展，在许多肿瘤组织中如肺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌等，某些基因的表达水平与其来源正常组织存在稳定而明显的差异。不同组织来源的肿瘤，甚至同一组织来源不同分化状态的加瘤，基因表达谱都不尽相同，表明基因表达具有明显的组织特异性和发育阶段特异性。因为神经退行性疾病病理上的直接特征是疾病特异性蛋白质的过量表达，所以推测特异性基因的异常改变了功能蛋白的表达水平，从而引起了疾病。现已越来越多的研究发现特异基因能够成为诊断帕金森的生物标志物，如以下申请号的专利公开的：201510713527.3、201510464905.9、201510463593.x、201510463617.1、201510809837.5。大部分疾病都是多基因调控的疾病，为了提高疾病的诊断准确率，将大量基因联合诊断成为必然，因此需要发掘更多与帕金森病相关的分子比标志物以便临床应用。技术实现要素：为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于认知障碍和运动障碍早期诊断的分子标志物。相比传统的帕金森症的诊断方法，使用基因标志物来诊断认知障碍和运动障碍的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。本发明的第一目的在于提供一种认知障碍和运动障碍相关基因的捕获探针组，缓解了现有技术中缺少一种能够有效捕获认知障碍和运动障碍相关基因的技术手段的问题。本发明的第二目的在于提供一种用于文库构建的试剂盒，缓解了现有技术中缺少一种能够有效捕获认知障碍和运动障碍相关基因的产品的问题。本发明的第三目的在于提供一种,上述捕获探针组、试剂盒方法在认知障碍和运动障碍相关基因筛查中的用途，以达到更深入的对认知障碍和运动障碍相关基因进行研究的目的。为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案:一种认知障碍和运动障碍相关基因的捕获探针组，所述捕获探针组捕获的基因和所述基因的染色体坐标信息如下表1所示:表1基因序列其中，所涉及到的具体的基因信息为：所述捕获探针组的设计按照如下规则:(a)探针长度为120bp；(b)探针设计合并相邻区域；(c)探针设计区间为目标区间向两翼扩展20bp；(d)探针参考为基因组正义链；(e)探针两翼的共有序列如seqidno.1和seqidno.2所示；(f)探针设计中通过比对全基因组信息确保探针特异性；(g)探针gc含量以30％-70％为标准，gc含量变化幅度偏离标准含量每增加10％,探针在该区域探针数量增加50％。(h)在基因组非捕获区域有近似序列的探针，每有一个近似序列，则该区域探针数量增加100％；所述近似序列为与探针序列的同源性至少为95％的序列。优选的，所述捕获探针组中的探针经过标记物标记，优选为经过生物素标记。优选的，所述试剂盒包含上述的捕获探针组；优选地，所述试剂盒还包括用于富集捕获的靶序列的pcr扩增引物:所述pcr扩增引物具有如seqidno.3和seqidno.4所示序列。优选的，所述试剂盒还包括用于多样本杂交捕获的接头用于文库杂交前封闭hybblock，所述试剂盒为安捷伦agilentsureselectqxtlibraryprepkit基因组dna建库试剂盒。优选的，所述试剂盒还包括与探针上的标记物亲和的磁珠；优选地，所述试剂盒中的捕获探针组中的探针经生物素标记，所述磁珠为亲和素偶联的磁珠，所述磁珠优选为链霉亲和素偶联的磁珠；优选地，所述试剂盒还包含用于提供杂交捕获反应的离子环境的缓冲液；优选地，所述试剂盒还包含用于洗脱物理吸附或非特异性杂交的清洗液。本发明同时提供上述试剂盒在知障碍和运动障碍相关基因筛查中的用途；优选地，所述测序为基于illumina测序平台的双末端测序，然后将测序结果与数据库进行对比。进一步的，本发明还提供了一种诊断认知障碍和运动障碍的工具，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测表1所述基因转录水平的针对表1所述基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的表1所述基因的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括表1所述基因在内的多个基因(例如，与帕金森症等认知障碍和运动障碍相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括表1所述基因在内的多个蛋白质(例如与帕金森症等认知障碍和运动障碍相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与帕金森症的标志物同时检测，可大大提高帕金森症等认知障碍和运动障碍诊断的准确率。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:本发明提供的认知障碍和运动障碍相关基因的捕获探针组包含了69个基因的编码区域，能针对特定的编码区域进行捕获，并进行高深度测序，使测序目标基因精准，测序成本降低。本发明提供的用于文库构建的试剂盒中包含上述捕获探针组，能够有效的捕获相关基因，可以降低相关基因的检测成本并且提高检测的灵敏度。本发明提供的上述捕获探针组、试剂盒方法在相关基因筛查中的用途，可以更深入的对认知障碍和运动障碍相关基因特点进行研究，不仅包括筛查样本中是否包含某些特点，还可以进一步的对这些基因的的snp(单核苷酸突变)，indel(碱基的插入缺失)cnv(拷贝数变异)进行分析。具体实施方式下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。需要说明的是，实施例中的反应体系和反应条件仅是一种举例。实施例中各步骤中的反应体系和反应条件均可以在可接受的范围内进行调整，以优化反应条件，本发明对此不做限制；探针长度根据合成的平台长度会有差异，本实施例中探针的长度为120bp,可以理解的是，只要复合本发明提供的探针的设计规则即可。实施例1认知障碍和运动障碍相关基因的捕获探针组本实施例提供了-组用于捕获认知障碍和运动障碍相关基因的捕获探针，该捕获探针组捕获的基因和所述基因的染色体坐标信息如下表所示:所述捕获探针组的设计按照如下规则:(a)探针长度为120bp；(b)探针设计合并相邻区域；(c)探针设计区间为目标区间向两翼扩展20bp；(d)探针参考为基因组正义链；(e)探针两翼的共有序列如seqidno.1和seqidno.2所示；编号序列(5‘-3’)seqidno.1gaagcgaggatcaactseqidno.2cattgcgtgaaccga(f)探针设计中通过比对全基因组信息确保探针特异性；(g)探针gc含量以30％-70％为标准，gc含量变化幅度偏离标准含量每增加10％,探针在该区域探针数量增加50％。(h)在基因组非捕获区域有近似序列的探针，每有一个近似序列，则该区域探针数量增加100％；所述近似序列为与探针序列的同源性至少为95％的序列。实施例2用于文库构建的试剂盒本实施例提供了一种构建痴呆相关基因的文库的试剂盒，该试剂盒包含如下试剂:①实施例1提供的痴呆相关基因的捕获探针组，并且该探针组经过生物素标记；和用于捕获杂交靶序列的经链霉亲和素标记的磁珠②用于多样本杂交捕获的接头用于文库杂交前封闭hybblock，所述试剂盒为安捷伦agilentsureselectqxtlibraryprepkit基因组dna建库试剂盒。③所述试剂盒还包括用于富集捕获的靶序列的pcr扩增引物:所述pcr扩增引物具有如seqidno.3和seqidno.4所示序列：编号序列(5‘-3’)seqidno.3gaagcgaggatcaactseqidno.4tcggttcacgcaatg⑤用于提供杂交捕获反应的离子环境的缓冲液(hybbuffer):10xsspe，10xdenhardt’s，10mmedta和0.2％sds。⑥用于洗脱物理吸附或非特异性杂交的清洗液washbufferl:1xssc/0.1％sds和washbuffer2:0.1mnaoh。最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。序列表<110>福建医科大学附属协和医院<120>一种认知障碍和运动障碍相关基因的捕获方法和试剂盒<130>jsp11901682<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>16<212>dna<213>（人工序列）<400>1gaagcgaggatcaact16<210>2<211>15<212>dna<213>（人工序列）<400>2cattgcgtgaaccga15<210>3<211>16<212>dna<213>（人工序列）<400>3gaagcgaggatcaact16<210>4<211>15<212>dna<213>（人工序列）<400>4tcggttcacgcaatg15当前第1页1 2 3
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