一种基于微卫星标记的中华倒刺鲃亲子鉴定试剂盒及其方法与流程

本发明涉及鱼类育种和分子标记技术领域，涉及一种基于微卫星标记对中华倒刺鲃进行亲子鉴定的技术，具体为中华倒刺鲃亲子鉴定试剂盒及其微卫星pcr鉴定方法。

背景技术：

中华倒刺鲃(spinibarbussinensis)隶属于鲤形目(cypriniformes)、鲤科(cyprinidae)、倒刺鲃属(spinibarbus)，俗称“青波”，为长江上游干支流水系重要的经济鱼类之一，在乌江流域和赤水河中下游流域中的渔获物比例较高。中华倒刺鲃个体大、生性活泼，喜水质清澈的急流河滩，生长较快、杂食性，深受人民群众的喜爱。然而，近年来由于捕捞过度、水污染严重，以及水利工程建设及运行造成的栖息地破坏等因素影响，中华倒刺鲃野生资源日益枯竭，开展种资资源保护、恢复与资源增殖研究非常重要。

中华倒刺鲃资源的保护主要采用人工增殖的方式，即通过养殖中华倒刺鲃亲本，大规模繁殖出苗后，再人工放流至河流，补充其野生种群，迅速壮大野生资源量。由于中华倒刺鲃个体大、生长较快、饲养饵料来源广，适合于池塘、湖泊、水库、鱼类增殖站等开展集约化养殖。多年来，有关中华倒刺鲃营养特性、人工养殖和繁殖技术等的研究已非常成熟，基本可以实现规模化的成鱼生产，为苗种的大规模增殖放流奠定了基础。然而，一方面，中华倒刺鲃繁殖群体的持续圈养，容易造成亲本的近亲交配，从而造成种群的遗传多样性水平下降；另一方面，多省份多机构持续多年开展的增殖放流来源于不同的家系，如何快速有效辨别不同的中华倒刺鲃家系及来源，高效评估其增殖放流效果，已成为中华倒刺鲃种群资源恢复的主要障碍和重要课题之一。

微卫星(microsatellite)是一类广泛存在于真核生物基因组中的具有高度变异性的简单重复dna序列。它具有按照孟德尔方式分离、多态信息含量丰富、呈共显性遗传等特点，可简便快速的基因型检测，是一种广泛应用的遗传学分子标记。同时，由于微卫星标记的使用简单、结果稳定、费用低廉，已经在亲子鉴定中有较多的应用。目前，尚未发现将微卫星标记应用于中华倒刺鲃亲子鉴定的研究报道。本发明旨在基于微卫星标记建立中华倒刺鲃的亲子鉴定技术，为中华倒刺鲃的家系管理、种群遗传管理和增殖放流效果评估提供技术途径。

技术实现要素：

本发明涉及一种基于微卫星标记的中华倒刺鲃亲子鉴定试剂盒及其微卫星pcr鉴定方法。

本发明采用的技术方案如下：

提供用于基于微卫星标记的中华倒刺鲃亲子鉴定用引物组，分别为：zhdcb24、zhdcb27、zhdcb28、zhdcb29、zhdcb33、zhdcb35、zhdcb41、zhdcb43、zhdcb50、zhdcb57、zhdcb58、zhdcb66、zhdcb79、zhdcb80、zhdcb88，各引物的序列如下表：

。

按上述方案，每对引物的正向引物的5’端标记有荧光物质。所述的荧光物质可选择为fam荧光物质。

提供一种基于微卫星标记的中华倒刺鲃亲子鉴定试剂盒，包括taq酶pcr预先混合液、上述中华倒刺鲃亲子鉴定用引物组，其中taq酶pcr预先混合液主要成分为0.1u/μltaqdna聚合酶、2xpcr反应缓冲液、3mmmgcl2，以及0.4mmdntps；中华倒刺鲃基因组dna的浓度为30-50ng/ul；中华倒刺鲃亲子鉴定用引物组(15个引物)分别为：zhdcb24、zhdcb27、zhdcb28、zhdcb29、zhdcb33、zhdcb35、zhdcb41、zhdcb43、zhdcb50、zhdcb57、zhdcb58、zhdcb66、zhdcb79、zhdcb80、zhdcb88。

按上述方案，所述的中华倒刺鲃亲子鉴定试剂盒还包括双蒸水。

提供一种微卫星pcr鉴定方法，包括以下步骤：

(1)提取中华倒刺鲃个体样本的基因组dna：将中华倒刺鲃亲本的鳍条和子代鱼苗个体，采用高盐提取法获得每个个体的基因组dna，保存备用；

(2)pcr扩增：将中华倒刺鲃亲子鉴定用引物组中的15对微卫星引物zhdcb24、zhdcb27、zhdcb28、zhdcb29、zhdcb33、zhdcb35、zhdcb41、zhdcb43、zhdcb50、zhdcb57、zhdcb58、zhdcb66、zhdcb79、zhdcb80、zhdcb88中的每对引物的正向引物的5’端标记上fam荧光物质，利用上述引物组中的各标记荧光引物对步骤(1)获得的dna基因组进行梯度pcr扩增，扩增产物在测序仪上进行毛细管电泳，读取每个个体的等位基因大小，获取基因分型数据；

(3)中华倒刺鲃家系的亲子鉴定分析：基于步骤(3)获取的基因型数据转换成生物软件能够读取的格式，进行亲本和子代数据分析，根据子代基因型和亲本基因型之间的相关性，确定子代与亲本间的亲子关系。

按上述方案，所述的pcr扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃→52℃梯度温度(touchdown)退火30s，72℃延伸30s，进行10个循环；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，进行22个循环；最后72℃再延伸20min。

按上述方案，所述的pcr反应体系为：5.0ultaq酶pcr预先混合液(主要成分为0.1u/μltaqdna聚合酶、2xpcr反应缓冲液、3mmmgcl2，以及0.4mmdntps)、1.0ul模板基因组dna(浓度30-50ng/ul)、上下游扩增引物各0.4ul(浓度10um)，加3.2ulddh2o至总体积10ul。

本发明基于精心筛选的15个多态性微卫星位点，获得清晰、稳定的效果后，开展荧光标记微卫星引物(根据实验室自行筛选分离中华倒刺鲃微卫星序列中筛选出扩增稳定、结果清晰，特异性强、杂合度高的引物)，共筛选出15对：zhdcb24、zhdcb27、zhdcb28、zhdcb29、zhdcb33、zhdcb35、zhdcb41、zhdcb43、zhdcb50、zhdcb57、zhdcb58、zhdcb66、zhdcb79、zhdcb80、zhdcb88)进行pcr扩增实验，获取亲本和子代的微卫星分型信息，获得家系中亲本和子代的基因型数据，最后开展亲子鉴定分析，分析亲本和子代基因型间的相关性，从而确定子代与亲本间的亲子关系关系。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

(1)本发明利用荧光标记的微卫星位点与毛细管电泳技术相结合，依据高通量测序的微卫星分型，对中华倒刺鲃家系进行了亲子分析；

(2)本发明筛选的15个多态性微卫星位点，主要为三碱基或四碱基重复单元的位点，其扩增效果稳定、清晰，为后期数据规整提供了较客观的依据。

(3)本发明的建立为中华倒刺鲃种质鉴定、家系遗传管理和增殖放流效果评估提供了一种新的技术手段。

附图说明

图1为引物zhdcb027测序图(依次为亲本f1(基因型为203/207)、亲本m1(基因型为199/203)、子一代z1-1(基因型为199/207))，子一代两个等位基因分别来自父本和母本，符合孟德尔分离定律

图2为引物zhdcb043测序图(依次为亲本f1(基因型为228/232)、亲本m1(基因型为228/232)、子一代z1-1(基因型为228/228))，子一代两个等位基因分别来自父本和母本，符合孟德尔分离定律

图3为引物zhdcb080测序图(依次为亲本f1(基因型为274/274)、亲本m1(基因型为274/278)、子一代z1-1(基因型为274/278))，子一代两个等位基因分别来自父本和母本，符合孟德尔分离定律

具体实施方式

实施例：

下面结合实例，对本发明作进一步说明。

一种基于微卫星标记的中华倒刺鲃亲子鉴定方法，其步骤是：

(1)提取中华倒刺鲃个体样本的基因组dna：将经过人工配对获取的家系6尾亲本和96尾子代鱼苗的样品取出来，按照高盐法提取基因组dna。具体步骤为：剪取0.5g左右的鳍条组织(子代鱼苗个体用全部鱼苗用做)，用双蒸水洗净保存样品沾附的酒精，充分剪碎，放入1.5ml离心管中；向离心管中加入500μl的细胞裂解液和6μl的蛋白酶k，在55℃水浴过夜消化，前30分钟摇动数次；加500μl氯化钠(4.5mol/l)，300μl氯仿，摇床中速混匀20分钟，在13000rpm，10℃下离心10分钟；转移上清液到新管(大概850μl左右)，加595μl无水异丙醇，摇床中速混匀20分钟，在13000rpm，10℃下离心10分钟，倒掉上清；加500μl75％的乙醇，在55℃水浴消化5分钟，在13000rpm，10℃下离心20分钟，倒掉上清；将离心管置于超净工作台中干燥1小时，加入50～100μl的te8.0，4℃过夜溶解dna，放置于-20℃冰箱保存备用。

(2)筛选多态性微卫星位点：根据实验室自行筛选分离的中华倒刺鲃微卫星序列，设计合成系列上下游引物，并分别对8个中华倒刺鲃个体(步骤(1)提取的基因组dna)进行pcr扩增，筛选出扩增稳定、结果清晰，特异性强、杂合度高的引物。其pcr反应体系为：5.0ul2×powertaqpcr预先混合液(主要成分为0.1u/μltaqdna聚合酶、2xpcr反应缓冲液、3mmmgcl2，以及0.4mmdntps)、1.0ul模板基因组dna(浓度30-50ng/ul)、上下游扩增引物各0.4ul(浓度10um)，加3.2ulddh2o至总体积10ul。pcr扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃→52℃梯度温度(touchdown)退火30s，72℃延伸30s，进行10个循环；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，进行22个循环；最后72℃再延伸20min。获得的pcr产物进行定量稀释后，取1ulpcr稀释产物，加入7ul甲酰胺(含4‰荧光内标liz500)变性后，在abi3730xldna测序仪上进行毛细管荧光电泳检测和基因分型。本发明共筛选出15对可用中华倒刺鲃微卫星引物：zhdcb24、zhdcb27、zhdcb28、zhdcb29、zhdcb33、zhdcb35、zhdcb41、zhdcb43、zhdcb50、zhdcb57、zhdcb58、zhdcb66、zhdcb79、zhdcb80、zhdcb88。有关中华倒刺鲃微卫星引物序列、重复单元及退火变性信息，请见表1；

表115个微卫星位点信息表

本发明对每个引物进行了具体验证，结果表明各引物均符合孟德尔分离定律，其中：以引物zhdcb027，zhdcb043，zhdcb080为例进行具体分析如下：图1为引物zhdcb027测序图(依次为亲本f1(基因型为203/207)、亲本m1(基因型为199/203)、子一代z1-1(基因型为199/207))，子一代两个等位基因分别来自父本和母本，符合孟德尔分离定律；图2为引物zhdcb043测序图(依次为亲本f1(基因型为228/232)、亲本m1(基因型为228/232)、子一代z1-1(基因型为228/228))，子一代两个等位基因分别来自父本和母本，符合孟德尔分离定律；图3为引物zhdcb080测序图(依次为亲本f1(基因型为274/274)、亲本m1(基因型为274/278)、子一代z1-1(基因型为274/278))，子一代两个等位基因分别来自父本和母本，符合孟德尔分离定律。

(3)荧光标记的微卫星引物进行pcr扩增：将步骤(2)中的15对微卫星引物中的每对引物的正向引物的5’端标记上fam荧光物质，利用标记荧光引物对步骤(1)获得的dna基因组进行梯度pcr扩增，其pcr反应体系为：5.0ul2×powertaqpcr预先混合液(主要成分为0.1u/μltaqdna聚合酶、2xpcr反应缓冲液、3mmmgcl2，以及0.4mmdntps)、1.0ul模板基因组dna(浓度30-50ng/ul)、上下游扩增引物各0.4ul(浓度10um)，加3.1ulddh2o至总体积10ul。pcr扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃→52℃梯度温度(touchdown)退火30s，72℃延伸30s，进行10个循环；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，进行22个循环；最后72℃再延伸20min。获得的pcr产物进行定量稀释后，取1ulpcr稀释产物，加入7ul甲酰胺(含4‰荧光内标liz500)变性后，在abi3730xldna测序仪上进行毛细管荧光电泳检测，采用软件读取每个个体的等位基因大小，获取基因分型的原始数据。依据测序仪获得的分型结果，利用软件genemarkerv2.2.0(hollandandparson，2011)读取个体等位基因大小，并依据微卫星的重复单元组成进行人工校正。

(4)中华倒刺鲃家系的亲子鉴定分析：对步骤(3)获取的人工校对后的基因型数据，利用软件cervus3.0.7(kalinowskietal.,2010)对亲本和子代数据进行等位基因频率计算、模拟分析和亲子关系分析，通过待测子代与亲本间的基因型似然率(loglikelihoodratio，lod)值来分析其相关性，并在95％置信水平下，确定待测子代与亲本间的关系。结果显示，对双亲未知时单亲本而言，15个位点的非亲权累积排除概率(ne-1p)为0.9682947；对已知单亲基因型时的另一亲本而言，15个位点的非亲权累积排除概率(ne-2p)为0.99839823；当双亲未知时的父母本组合而言，15个位点的非亲权累积排除概率(ne-pp)为0.99997443。中华倒刺鲃15个微卫星位点遗传多样性和排除概率信息，详见表2。为确保鉴定结果准确，依据lod值大于0，且与家系记录数据相一致，才能确认为亲子关系。结果显示，96尾子代中有92尾子代个体确认了亲子关系，鉴定准确率为95.83％。以上结果表明，利用本发明的基于微卫星标记的中华倒刺鲃亲子鉴定试剂盒及其方法能高效快捷实现中华倒刺鲃家系的亲子鉴定分析、种质管理和增殖放流效果评估的要求。

表2.中华倒刺鲃15个微卫星位点遗传多样性和非亲权排除概率信息

注：ns表示不显著偏离(p＞0.05)，*表示显著偏离(p＜0.05)

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

说明书核苷酸和氨基酸序列表

<110>水利部中国科学院水工程生态研究所

<120>一种基于微卫星标记的中华倒刺鲃亲子鉴定试剂盒及其方法

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