鉴定牙周膜干细胞的试剂盒及方法与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，尤其是涉及一种鉴定牙周膜干细胞的试剂盒及方法。
背景技术：
：随着干细胞和再生医学的兴起，针对干细胞的基础和应用研究层出不穷。从胚胎干细胞，造血干细胞，骨髓干细胞到诱导多功能干细胞，都被验证为潜在的临床材料。口腔干细胞在近几年开始兴起。从21世纪开始，陆陆续续共有8种干细胞从人的牙科组织中被分离出来。牙周膜干细胞（pdlscs）作为口腔干细胞的一种，可以从成人的牙周膜组织中得到，材料可以来源于牙科手术丢弃物中得到。研究表明，相比于其他干细胞，pdlscs同样具有高度增殖和多向分化的潜能，可以在适当条件下分化成骨，成脂等。另外，pdlscs不具有伦理问题，也无致瘤性，故而被视为胚胎干细胞和诱导多功能干细胞的潜在替代物。pdlscs从组织中的分离培养过程，需要克服很多困难。口腔组织环境复杂，组织之间除了牙冠的包被以外没有明显界限。故而在从组织提取pdlscs时，需要避免组织之间的污染，才能得到牙周膜组织。另外，由于口腔组织中可以分离得到多种干细胞，他们在免疫表型，增殖和分化能力又大都相似，市场上也没有相应的产品和方法报道，用来区分表征牙周膜干细胞并与其他细胞做区分。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一个目的在于提供一种鉴定牙周膜干细胞的试剂盒，以至少缓解了现有技术中存在的技术问题之一。本发明的第二个目的在于提供一种鉴定牙周膜干细胞的方法。本发明提供了一种鉴定牙周膜干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测ckb基因和/或ckb蛋白的产品。进一步的，包括用于检测ckb基因的引物。进一步的，所述用于扩增ckb基因的引物具有seqidno.1和seqidno.2所示的核苷酸序列，或与seqidno.1和/或seqidno.2具有至少85%同一性的核苷酸序列。进一步的，所述用于扩增ckb基因的引物具有seqidno.3和seqidno.4所示的核苷酸序列，或与seqidno.3和/或seqidno.4具有至少85%同一性的核苷酸序列。进一步的，所述用于扩增ckb基因的引物具有seqidno.5和seqidno.6所示的核苷酸序列，或与seqidno.5和/或seqidno.6具有至少85%同一性的核苷酸序列。进一步的，所述用于扩增ckb基因的引物具有seqidno.7和seqidno.8所示的核苷酸序列，或与seqidno.7和/或seqidno.8具有至少85%同一性的核苷酸序列。进一步的，所述用于扩增ckb基因的引物具有seqidno.9和seqidno.10所示的核苷酸序列，或与seqidno.9和/或seqidno.10具有至少85%同一性的核苷酸序列。进一步的，所述用于扩增ckb基因的引物具有seqidno.11和seqidno.12所示的核苷酸序列，或与seqidno.11和/或seqidno.12具有至少85%同一性的核苷酸序列。进一步的，所述试剂盒还包括内参基因的检测引物。进一步的，所述内参基因包括gapdh。进一步的，所述内参基因的检测引物具有seqidno.13和seqidno.14所示的核苷酸序列，或与seqidno.13和/或seqidno.14具有至少85%同一性的核苷酸序列。此外，本发明还提供了一种鉴定牙周膜干细胞的方法，以待测生物样品的dna为模板，利用上述的试剂盒进行检测，根据ckb基因的相对表达水平，确定所述待测生物样品是否为牙周膜干细胞；当所述ckb基因的表达水平显著高时，所述待测生物样品为牙周膜干细胞；优选地，所述检测包括荧光定量pcr检测。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明的发明人通过实验发现，ckb基因和/或ckb蛋白在牙周膜干细胞中具有显著高表达的特性，因此，通过检测ckb基因和/或ckb蛋白在待测细胞样品中的表达情况，能够准确、有效地鉴定牙周膜干细胞。本发明提供的鉴定牙周膜干细胞的方法，以待测生物样品的dna为模板，利用本发明提供的试剂盒进行检测，根据ckb基因的相对表达水平，即可确定所述待测生物样品是否为牙周膜干细胞。该方法快捷简便，且不需要昂贵复杂的仪器和操作，临床应用范围广，能够为牙周膜干细胞的鉴别提供快速有效的手段，适于推广应用。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明实施例1提供的tmt蛋白质组学检测的ckb蛋白质表达的丰度的结果图；图2为本发明实施例2提供的用qpcr检测ckb的牙周膜干细胞和牙髓干细胞mrna相对表达量的结果图；图3为本发明实施例3提供的用qpcr检测ckb的牙周膜干细胞和牙龈干细胞mrna相对表达量的结果图；图4为本发明实施例4提供的引物1-6用qpcr扩增目的基因的扩增曲线；图5a为本发明实施例4提供的引物1用qpcr扩增目的基因的溶解曲线；图5b为本发明实施例4提供的引物2用qpcr扩增目的基因的溶解曲线；图5c为本发明实施例4提供的引物3用qpcr扩增目的基因的溶解曲线；图5d为本发明实施例4提供的引物4用qpcr扩增目的基因的溶解曲线；图5e为本发明实施例4提供的引物5用qpcr扩增目的基因的溶解曲线；图5f为本发明实施例4提供的引物6用qpcr扩增目的基因的溶解曲线。具体实施方式除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。根据本发明的一个方面，提供了一种鉴定牙周膜干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测ckb基因和/或ckb蛋白的产品。肌酸激酶b（ckb），由381个氨基酸组成，是一种参与能量稳态的细胞质酶，可以在机体内发挥可逆催化atp和多种磷酸根之间的磷酸转移的作用。ckb与细胞的增殖相关，敲除ckb的细胞发现细胞增殖受到抑制同时发生细胞凋亡。本发明的发明人通过实验发现，ckb基因和/或ckb蛋白在牙周膜干细胞中具有显著高表达的特性，因此，通过检测ckb基因和/或ckb蛋白在待测细胞样品中的表达情况，能够准确、有效地鉴定牙周膜干细胞。需要说明的是，“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如a和/或b包括（a和b）和（a或b）。ckb基因和/或ckb蛋白作为鉴定牙周膜干细胞的标志物的应用指的是，可以单独应用ckb基因作为鉴别标志物，或者单独应用ckb蛋白作为鉴别标志物，或者同时应用ckb基因和ckb蛋白作为鉴别标志物。上述三种选择均可特异性的实现牙周膜干细胞的鉴定。在本发明中，可以使用任意合适的检测上述基因和/或蛋白的产品、方法，其都视为包含在本发明的保护范围之内。例如，聚合酶链式反应（pcr），如qpcr；逆转录聚合酶链式反应（rtpcr）；原位杂交（fish）；转录介导的扩增（tma）；连接酶链式反应（lcr）；链置换扩增（sda）和基于核酸序列的扩增（nasba）；微阵列；southern或northern印迹；高通量测序方法。在一些优选的实施方式中，所述试剂盒包括用于检测ckb基因的引物。优选地，所述用于扩增ckb基因的引物具有seqidno.1和seqidno.2所示的核苷酸序列，或与seqidno.1和/或seqidno.2具有至少85%同一性的核苷酸序列；或者，所述用于扩增ckb基因的引物具有seqidno.3和seqidno.4所示的核苷酸序列，或与seqidno.3和/或seqidno.4具有至少85%同一性的核苷酸序列；或者，所述用于扩增ckb基因的引物具有seqidno.5和seqidno.6所示的核苷酸序列，或与seqidno.5和/或seqidno.6具有至少85%同一性的核苷酸序列；或者，所述用于扩增ckb基因的引物具有seqidno.7和seqidno.8所示的核苷酸序列，或与seqidno.7和/或seqidno.8具有至少85%同一性的核苷酸序列。所述用于扩增ckb基因的引物具有seqidno.9和seqidno.10所示的核苷酸序列，或与seqidno.9和/或seqidno.10具有至少85%同一性的核苷酸序列。所述用于扩增ckb基因的引物具有seqidno.11和seqidno.12所示的核苷酸序列，或与seqidno.11和/或seqidno.12具有至少85%同一性的核苷酸序列。本发明中的术语“同一性”指的是序列之间的相似性。“同一性”包括与本发明所述的seqidno.1至seqidno.12所示的核苷酸序列具有至少85%（例如可以为，但不限于85%、88%、90%、92%、95%、99%或者更高）同一性、并且具有相同功能的核苷酸序列。“与seqidno.1和/或seqidno.2具有至少85%同一性的核苷酸序列”指的是例如用于扩增ckb基因的引物，可以为seqidno.1和seqidno.2、或者为与seqidno.1具有至少85%同一性的核苷酸序列和seqidno.2、或者为与seqidno.2具有至少85%同一性的核苷酸序列和seqidno.1、或者为与seqidno.1具有至少85%同一性的核苷酸序列和与seqidno.2具有至少85%同一性的核苷酸序列。“与seqidno.3和/或seqidno.4具有至少85%同一性的核苷酸序列”、“与seqidno.5和/或seqidno.6具有至少85%同一性的核苷酸序列”、“与seqidno.7和/或seqidno.8具有至少85%同一性的核苷酸序列”、“与seqidno.9和/或seqidno.10具有至少85%同一性的核苷酸序列”以及“与seqidno.11和/或seqidno.12具有至少85%同一性的核苷酸序列”的释义同上，在此不再赘述。在本发明中，可以选择seqidno.1和seqidno.2、或者seqidno.3和seqidno.4、或者seqidno.5和seqidno.6、或者seqidno.7和seqidno.8、或者seqidno.9和seqidno.10、或者seqidno.11和seqidno.12作为检测ckb基因的引物，上述各组引物均能够实现对ckb基因的特异性检测。当选择seqidno.1和seqidno.2所示的核苷酸序列作为本发明提供的用于扩增ckb基因的引物时，具有更强的特异性及更高的灵敏度。本发明对各引物对之间的配比没有要求，例如可以为但不限于1:1、1:1.2或1:1.5，可以根据实际使用情况进行调整。在一些优选的实施方式中，所述试剂盒还包括内参基因的检测引物。通过对内参基因进行同步检测，能够进一步保证检测结果的有效率。优选地，所述内参基因包括gapdh。更优选地，所述内参基因的检测引物具有seqidno.13和seqidno.14所示的核苷酸序列，或与seqidno.13和/或seqidno.14具有至少85%同一性的核苷酸序列。当选择seqidno.13和seqidno.14所示的核苷酸序列作为本发明提供的用于扩增gapdh基因的引物时，具有更强的特异性及更高的灵敏度。此外，本发明提供的试剂盒中还可以包括pcr反应液和试剂盒说明书。所述pcr反应液包括dntp、mg2+、taq酶、荧光染料及buffer缓冲液等常规试剂。根据本发明的第二个方面，还提供了一种鉴定牙周膜干细胞的方法，以待测生物样品的dna为模板，利用上述的试剂盒进行检测，根据ckb基因的相对表达水平，确定所述待测生物样品是否为牙周膜干细胞；当所述ckb基因的表达水平显著高时，所述待测生物样品为牙周膜干细胞。本发明提供的鉴定牙周膜干细胞的方法，以待测生物样品的dna为模板，利用本发明提供的试剂盒进行检测，根据ckb基因的相对表达水平，即可确定所述待测生物样品是否为牙周膜干细胞。该方法快捷简便，且不需要昂贵复杂的仪器和操作，临床应用范围广，能够为牙周膜干细胞的鉴别提供快速有效的手段，适于推广应用。其中，ckb基因的表达水平显著高具体可以为：ckb基因归一化的表达值计算方法为：δct=|ctckb基因-ct内参基因|，通过计算en=2^（-δct），再进一步计算基因的相对表达值=2^（-δδct）=enckb基因/en内参基因。基因水平2^-δct值大于等于0.1，或者相对于对照组所述基因的2^-δδct值大于1.5的为牙周膜干细胞。本发明中待测生物样品例如可以为，但不限于细胞。在一些具体的实施方式中，鉴定牙周膜干细胞的方法包括如下步骤：（1）细胞培养后提取总rna，随后反转录成cdna；详细操作为：倒去细胞培养液，并有pbs洗涤3次，随后加入trizol进行细胞裂解。在冰上裂解细胞30min后，将细胞裂解液全部转移离心管中，并依次加入氯仿和异丙醇，在4℃，12000rpm离心取rna沉淀，并用75%乙醇洗涤1-2次，再次离心取rna沉淀。干燥后，用depc处理水重新溶解rna。定量后，加入随机引物和碱基，在37℃进行反转录反应15min，并在85℃终止反应5s。（2）荧光定量pcr扩增：使用针对ckb的引物检测ckbmrna的表达水平，采用的内参为gapdh基因，针对ckb的引物分别是seqidno：1-2、或者seqidno：3-4、或者seqidno：5-6、或者seqidno：7-8、或者seqidno：9-10、或者seqidno：11-12，针对gapdh的引物为seqidno：13-14；定量的计算用2^-△△ct值作为基因相对表达值，以gapdh作为内参进行相对表达的矫正。（3）结果判断：表达水平显著高的为牙周膜干细胞，表达水平显著低的为牙髓干细胞。下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。本发明实施例中用到的主要试剂信息如下：名称品牌产地dmem培养基bi以色列胎牛血清bi以色列0.25%胰酶（含edta）bi以色列青链双抗生素bi以色列pbsbi以色列8mureaxilongscientific中国teabthermofisherscientific美国dttmacklin中国iaamacklin中国trypsinsigma美国sep-pakc181ccvaccartridgewaters美国tmtlabelsthermofisherscientific美国5%hydroxylaminethermofisherscientific美国trizolcwbio中国异丙醇tgreag中国三氯甲烷tgreag中国无水乙醇tgreag中国depc水leagene中国rt-pcrkitcwbio中国ultrasybrmixturecwbio中国实施例1牙周膜干细胞和牙髓干细胞标志物的筛选1、本实施例采用了分别来自3组不同个体的牙周膜干细胞样品和对应的和牙髓干细胞样品。培养牙周膜干细胞和牙髓干细胞，细胞裂解后提取全蛋白。随后分别加入dtt，iaa和胰酶，37℃过夜反应后，得到肽段。随后加入tmt标签，在常温下进行标记，加入5%羟胺后反应15min终止反应。干燥后脱盐，再次干燥后在lc-ms/ms上进行肽段的检测。2、实验结果统计结果显示，牙周膜干细胞组的ckb蛋白丰度更高，牙髓干细胞组ckb丰度低（如图1所示）。实施例2牙周膜干细胞和牙髓干细胞鉴定标志物的鉴定1、牙周膜干细胞和牙髓干细胞的总rna提取本试验采用了分别来自3组不同个体的牙周膜干细胞样品和对应的牙髓干细胞样品。1）倒去培养皿/瓶中的培养基，pbs洗2-3次，加入0.7mltrizol溶液（红色），用枪吹散贴附在培养皿/瓶上的细胞，直接转移到1.5ml离心管中，再在培养皿加入0.5ml的trizol冲洗培养皿收获剩下未完全吹散下来的细胞，转移到同一离心管中震荡后，室温静置5min。2）直接加入200μl氯仿，漩涡震荡15s混匀后室温放置2-3min（或加入氯仿可以使蛋白、dna、脂类充分分离）。3）4℃，12000rpm离心20min。4）离心后，混合物分成三相，吸取上层水相约400μl至另一离心管。5）加入500μl异丙醇混匀，室温放置10min。6）4℃，12000rpm离心20min，rna形成白色小团沉于管底，弃上清。7）加入0.5-1.0ml无水乙醇，漂洗，倒掉，2次。8）在室温环境，无菌操作台中，吹干5-10min。9）用20μldepc处理水(无菌水)，吹匀。10）测od值定量rna浓度和纯度，od260/od280要在1.8-2.0之间。2、荧光定量pcr：在200μlpcr管配制反应体系：引物混合液1µl，mastermix混合物18µl，模板cdna1µl，加盖密封，将上述反应放荧光定量pcr仪中，第一步预变性95℃反应10min；第二步变性95℃反应10s；第三步退火60℃反应30s；第四步延伸72℃反32s；第二步到第四步循环40次；进入溶解程序，依次进行95℃反应15s；60℃反应1min；95℃反应15s；60℃反应15s；所述引物混合液分别含有seqidno：13-14所示的内参基因的引物以及seqidno：1-2所示的引物（引物1），其中，所有引物的浓度为2pmol/µl。该引物是经过大量试验优化获得，具有高灵敏度和高特异性，灵敏度试验表明ckb引物的扩增灵敏度可达15pg。所述反应液主要是含有1×ultrasybrmixture混合液，用gapdh作为参考基因组（δct）将ct值标准化，并使用建立的基于效率的δδct方法将每个样品与进行比较。为了评估表达强度，将归一化的ct值（δct）转换为归一化的表达值，根据下式：en=2^（-δct），计算2^（-δδct），作图分析。3、实例结果牙周膜干细胞样品组的平均值和牙髓干细胞样品组的平均值进行比较。mrna表达测试结果表明，牙周膜干细胞组ckb表达高，牙髓干细胞组ckb表达低（如图2所示）。实施例3牙周膜干细胞和牙龈干细胞中ckb标志物的鉴定本实施例采用的方法与实施例2并无不同，采用了分别来自3组不同个体的牙周膜干细胞样品和牙龈干细胞样品进行ckb标志物的鉴定。结果：牙周膜干细胞样品组的平均值和牙髓干细胞样品组的平均值进行比较。mrna表达测试结果表明，牙周膜干细胞组ckb表达高，牙龈干细胞组ckb表达低（如图3所示）。实施例4牙周膜干细胞和牙龈干细胞中ckb标志物的鉴定本实施例采用的方法与实施例3并无不同，采用了分别来自6组不同引物对干细胞样品进行ckb标志物的鉴定。所述引物混合液分别含有seqidno：13-14所示的内参基因的引物以及seqidno：1-2所示的引物（引物1）、或者seqidno：3-4（引物2）所示的引物、或者seqidno：5-6（引物3）所示的引物、或者seqidno：7-8（引物4）、或者seqidno：9-10（引物5）所示的引物、或者seqidno：11-12（引物6）所示的引物。结果：引物1-6都可以正常扩增，但是扩增的效率不同，先达到平台期的时间各不相同（如图4所示）。溶解曲线可以看出，不同引物在溶解时表现了不同的溶解状态，其中引物1表现最好，呈现单一尖峰（如图5a-5f所示）。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。sequencelisting<110>康妍葆(北京)干细胞科技有限公司<120>鉴定牙周膜干细胞的试剂盒及方法<160>14<170>patentinversion3.5<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<400>1gcagctcatcgacgaccacttc22<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2gggcactgcaggcaataagtta22<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3gagcacaagaccgacctcaa20<210>4<211>18<212>dna<213>人工序列<400>4gaggcgagacgggagtga18<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5gtacatcatgaccgtgggct20<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列<400>6gaggcgagacgggagtga18<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<400>7gatgagcacaagaccgacct20<210>8<211>18<212>dna<213>人工序列<400>8gaggcgagacgggagtga18<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<400>9tacatcatgaccgtgggctg20<210>10<211>17<212>dna<213>人工序列<400>10gccctgcaggttgtcgg17<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<400>11gtacatcatgaccgtgggct20<210>12<211>17<212>dna<213>人工序列<400>12gccctgcaggttgtcgg17<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列<400>13tacatcatgaccgtgggctg20<210>14<211>17<212>dna<213>人工序列<400>14ccgccctgcaggttgtc17当前第1页1 2 3 

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