一种检测山羊环状RNA中分子标记的方法及其应用与流程

本发明涉及山羊标记辅助选择技术领域，涉及一种检测山羊环状rna中分子标记的方法及其应用。

背景技术：

我国山羊饲养历史悠久，是常见的居民肉食来源。近年来，全球山羊养殖规模不断扩大，尤其中国更是山羊养殖大国。随着消费者对于健康饮食要求的不断增长，由于羊肉具有健康、安全的营养特性，促使其在肉类消费中的比重不断上升。包括体重体尺在内的生长性状是山羊生产中最为重要的经济性状。因此，研究如何通过选育提高山羊的生长性状对于山羊产业和山羊育种研究来说都具有十分重要的意义。

单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,snp)指的是由个体间基因组中同一位置单个核苷酸(a、t、c和g)发生变异所引起的dna序列的多态性，主要包括碱基的转换、颠换、插入或缺失等四种形式。snp具有数量多、分布广、杂合率低、遗传稳定性好、适用于高通量自动化检测等特点。因此，snp可作为分子育种、基因定位、群体进化等研究的首选工具。分子标记辅助选择(marker-assistedselection，mas)利用与特定性状相关联的分子标记作为辅助手段进行选择育种。具有快速、准确、不受环境影响的优点，从而加快育种速度，尤其对于低遗传力性状和难以测量的性状具有更大的优势。随着应用基因组学、分子生物学和分子遗传学理论技术的不断发展，mas技术能有效的加快山羊重要经济性状的选择进展，可对我国山羊产业的可持续发展将带来巨大的经济效益。

环状rna(circularrna,circrna)是一类新型的内源性非编码rna，它是在mrna前体剪切过程中，外显子和(或)内含子的5’端与3’端以反向剪切形式连接，形成的共价闭合环状结构。circrna广泛存在于真核细胞内，具有物种保守性、组织特异性和稳定性等特点。circrna调控卵泡发育的研究较为有限。capel等人研究发现小鼠精子决定基因sry可编码circrna；在孕产妇衰老过程中，人类卵巢颗粒细胞中circrna可能在葡萄糖代谢、有丝分裂细胞周期和卵巢激素生成等过程中发挥作用；circrna-9119可通过mirna介导的信号通路参与山羊子宫内膜上皮细胞中ptgs2基因的表达调控。迄今为止，尚无有关山羊环状rnacirc_zcchc24作为产羔数、生长性状的分子标记的研究报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种检测山羊环状rna中分子标记的方法及其应用，本发明发掘了三种与山羊产羔数或/和生长性状关联的分子标记，它们同时与山羊产羔数或/和生长性状相关联，为山羊产羔数、生长性状的分子标记辅助育种提供了新的分子标记。

本发明的目的之一在于提供三种与山羊产羔数或/和生长性状关联的分子标记，所述的分子标记位于山羊环状rnacirc_zcchc24的dna序列中，所述分子标记的核苷酸序列如序列表seqidno.1所示，该序列长度为2045bp，所述三种分子标记包括：在该序列中第651bp处存在一处g>a碱基突变(命名为g.651g>a)、在第1082bp处存在一处g>t碱基突变(命名为g.1082g>t)、在第1310bp处存在一处a>g碱基突变(命名为g.1310a>g)。

作为优选之一，所述序列中第651bp处的g或a的碱基多态性位点，表现为gg、ga或aa三种基因型，其中g优势等位基因。

作为优选之二，所述序列中第1082bp处的g或t的碱基多态性位点，表现为gg、gt或tt三种基因型，其中g优势等位基因。

作为优选之三，所述序列中第1310bp处的a或g的碱基多态性位点，表现为aa、ga或gg三种基因型，其中a优势等位基因。

本发明的目的之二在于提供所述的分子标记在山羊产羔数或/和生长性状标记辅助选择中的应用。所述的分子标记在山羊产羔数性状、生长性状标记至少一个性状上的应用均在本发明的保护范围之内。

本发明的目的之三在于提供一种山羊环状rna中与产羔数或/和生长性状相关联的分子标记的检测试剂盒，包括：

用于扩增包含g.651g>a位点的seqidno.2所示序列的引物对：上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seqidno.4和seqidno.5所示；用于检测g.651g>a位点的snapshot单碱基延伸引物如seqidno.8所示；

用于扩增包含g.1082g>t和g.1310a>g位点的seqidno.3所示序列的引物对：上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seqidno.6和seqidno.7所示；用于检测g.1082g>t位点的snapshot单碱基延伸引物如seqidno.9所示；用于检测g.1310a>g位点的snapshot单碱基延伸引物如seqidno.10所示。

本发明的目的之四在于提供使用所述检测试剂盒检测山羊环状rna中与产羔数或/和生长性状相关分子标记的方法，包括以下步骤：

步骤1、以从待测山羊血液样本中提取的基因组dna为模板，通过选自所述seqidno.4～5和seqidno.6～7所示pcr引物对构建pcr扩增体系，对如seqidno.2和seqidno.3所示序列进行pcr扩增，并对pcr产物进行纯化处理；

步骤2、以所述纯化的pcr产物为模版，通过选自所述seqidno.8～10所示snapshot单碱基延伸引物构建snapshot反应体系进行单碱基延伸反应，并对反应制备的单碱基延伸产物进行纯化处理；

步骤3、使用遗传学分析仪检测所述纯化后的单碱基延伸产物，并使用基因分析软件对结果进行分析。

优选地，所述步骤1中pcr扩增体系包括：pcrmix为10μl，0.5μmol/l上游引物，0.5μmol/l下游引物，模板dna2为50ng，加去离子水补充至20μl；所述pcr扩增条件为：95℃预变性4min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸10s，35个循环；72℃延伸5min。

优选地，所述步骤2中所述纯化的pcr产物为经sap和exoi酶处理后pcr产物；snapshot反应体系还包括reactionmix试剂；pcr扩增条件为96℃变性10s，50℃退火5s，60℃延伸30s，25个循环。

本发明的目的之五在于提供所述的检测试剂盒在山羊产羔数或/和生长性状标记辅助选择中的应用。

本发明的有益效果：

本发明发掘了与山羊产羔数或/和生长性状关联的分子标记，位于山羊环状rnacirc_zcchc24的dna序列中，所述分子标记的核苷酸序列如序列表seqidno.1所示，该序列长度为2045bp，在该序列中第113bp处存在一处g>a碱基突变；本发明首次发掘了该分子标记，同时与两个性状(山羊产羔数、生长性状)相关联，实现了对山羊产羔数、生长性状进行早期选择，检测方法快速、准确，且不受养殖环境条件因素影响。

附图说明

图1是山羊环状rnacirc_zcchc24中seqidno.2和seqidno.3序列片段琼脂糖凝胶电泳图谱，1：如seqidno.2所示序列，2：如seqidno.3所示序列；

图2是本发明中山羊环状rnacirc_zcchc24中g.651g>a位点的genemapperv4.0软件读取结果图；a图：gg基因型；b图：ga基因型；c图：aa基因型；

图3是本发明中山羊环状rnacirc_zcchc24中g.1082g>t位点的genemapperv4.0软件读取结果图；a图：gg基因型；b图：gt基因型；c图：tt基因型；

图4是本发明中山羊环状rnacirc_zcchc24中g.1310a>g位点的genemapperv4.0软件读取结果图；a图：aa基因型；b图：ga基因型；c图：gg基因型。

具体实施方式

实施例1山羊环状rnacirc_zcchc24中snp检测方法的建立。

1、山羊基因组dna的提取：

本发明的试验山羊品种为波尔山羊、麻城黑山羊和黑头羊(波尔山羊与麻城黑山羊杂交品种)，样本来源于湖北省农业科学院畜牧兽医研究所种羊场。山羊基因组dna采用血液基因组dna提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司生产)进行提取，具体步骤参照试剂盒说明书。对提取出的dna进行浓度和质量检测，置于-40℃下保存备用。

2、snp遗传标记检测片段的获得：

(1)pcr扩增

根据山羊环状rnacirc_zcchc24的基因组序列中的snp遗传标记检测序列(如seqidno.1所示)设计两对引物，扩增两个多态性位点的片段(图1)，其中片段1为包含g.651g>a位点的seqidno.2所示序列，片段2为包含g.1082g>t和g.1310a>g位点的seqidno.3所示序列。引物如下：

用于扩增片段1的上游引物：5’-aggcatacatgtgtgaggtg-3’(核苷酸序列如seqidno.4所示)，下游引物：5’-gcctggcactggcgaagtac-3’(核苷酸序列如seqidno.5所示)；用于扩增片段2的上游引物：5’-actggatggggtcactgggg-3’(核苷酸序列如seqidno.6所示)，下游引物：5’-cacgcctccaggttgatacag-3’(核苷酸序列如seqidno.7所示)。

分别以波尔山羊、麻城黑山羊和黑头羊基因组dna为模板，利用上述引物进行pcr扩增，pcr反应体系为：pcrmix为10μl，0.5μmol/l上游引物，0.5μmol/l下游引物，模板dna为50ng，加去离子水补充至20μl。pcr反应程序为：95℃预变性4min；然后95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸15s，共35个循环；72℃延伸5min，16℃保存。

(2)pcr产物纯化

上述pcr产物用凝胶回收试剂盒gelextractionkit(上海生工生物工程有限公司)进行纯化，具体步骤参见说明书。

3、snapshot方法检测分子标记：

根据山羊环状rnacirc_zcchc24的基因组序列设计用于检测g.651g>a位点的snapshot单碱基延伸引物(核苷酸序列如seqidno.8所示)；用于检测g.1082g>t位点的snapshot单碱基延伸引物(核苷酸序列如seqidno.9所示)；用于检测g.1310a>g位点的snapshot单碱基延伸引物(核苷酸序列如seqidno.10所示)。

在15μl纯化后的pcr产物中加入5usap和2uexoi，震荡混匀，37℃保温1h，然后75℃保温15min以灭活sap和exoi酶；使用snapshotmultiplexkit(appliedbiosystems)将处理后的15μlpcr产物吸出3μl进行snapshot检测，pcr反应体系10μl，reactionmix试剂5μl，sap和exoi酶处理后pcr产物3μl，延伸引物各0.5μl，去离子水1μl，pcr扩增程序为96℃变性10s，50℃退火5s，60℃延伸30s，25个循环，4℃保存；将snapshot产物稀释20倍，稀释体系为hi-diformamide9.25μl，gs-120liz0.25μl,snapshot产物0.5μl，反应体系为95℃变性5min，冰浴4min；配制含有350μlhi-di甲酰胺和50μlmatrix标准品的混合液，95℃变性5min，迅速冰冷5min，平分2管，分装至上机板后对3730xldnaanalyzer仪器进行光谱校正；使用3730xldnaanalyzer对制备好的样品进行毛细管电泳并搜集信号；最后使用genemapperv4.0软件对实验结果进行分析(如图2-4所示)。

实施例2本发明制备的分子标记在山羊群体中的多态性分布检测。

本实施例分别在波尔山羊、黑头羊和麻城黑山羊群体中检测山羊环状rnacirc_zcchc24的基因组序列中的g.651g>a、g.1082g>t和g.1310a>g位点的多态性，检测结果如表1所示。

表1-山羊circ_zcchc24中snp位点在群体中的基因型频率和等位基因频率：

由表1结果可知：g.651g>a、g.1082g>t和g.1310a>g三个多态性位点，除了g.1082g>t位点在波尔山羊群体中不存在tt基因型，其他位点在波尔山羊、黑头羊和麻城黑山羊群体中均表现为三种基因型，其中g.651g>a和g.1082g>t位点基因型以纯合型占据优势，g.1310a>g位点以杂合型占据优势。g.651g>a和g.1082g>t位点在三个山羊群体中等位基因g均为优势等位基因，g.1310a>g位点中等位基因a与g频率相差不大，等位基因a稍占优势，为优势等位基因。

实施例3本发明制备的分子标记与山羊产羔数性状的关联分析及应用。

为了确定山羊环状rnacirc_zcchc24的基因组序列中g.651g>a、g.1082g>t和g.1310a>g三个多态性位点与波尔山羊、黑头羊和麻城黑山羊产羔数性状差异是否相关，采用实施例1建立的方法进行多态性检测，分析山羊上述三个位点的三种基因型与产羔数性状的相关性。采用sas统计软件(sasinstituteinc,version9.1)glm程序进行不同snp基因型组合的方差分析，并进行显著性检验，所采用模型为：

yijklm＝μ+pi+sj+fk+gl+mm+eijklm；

yijklm为性状表型值，μ为平均值，pi为第i个胎次的影响(i＝1、2、3、4)，sj为基因型效应，fk为第k个羊场的影响(k＝1、2)，gl为影响第l个基因型(l＝1-3)，mm为母畜效应，eijklm为残差效应。统计分析结果如表2所示：

表2-山羊g.651g>a位点与产羔数性状的关联分析：

注：同行比较中，不同小写字母代表差异显著(p<0.05)；*代表差异显著(p<0.05)。

由表2可知，在黑头羊群体中，g.651g>a位点的aa基因型的总体产羔数显著高于ga基因型和gg基因型(p<0.05)。aa基因型个体的总体产羔数较高，ga和gg基因型个体的总体产羔数较低，加性效应和显性效应达到显著水平(p<0.05)。

表3-山羊g.1082g>t位点与产羔数性状的关联分析：

注：同行比较中，不同大写字母代表差异显著(p<0.01)；**代表差异极显著(p<0.01)。

由表3可知，在波尔山羊群体中，g.1082g>t位点的gt基因型的头胎产羔数极显著高于gg基因型(p<0.01)。gt基因型个体的头胎产羔数较高，gg基因型个体的产羔数较低。而tt基因型则没有产羔数记录，加性效应达到极显著水平(p<0.01)。g.1082g>t位点在黑头羊和麻城黑山羊群体中各基因型的头胎产羔数和总体产羔数均无显著差异。

综上所述，g.651g>a位点在黑头羊总体产羔数性状中，aa基因型个体的产羔数性状较好，g.1082g>t位点在波尔山羊头胎产羔数性状中，gt基因型个体的产羔数性状较好。因此，在早期检测中，当黑头羊个体在山羊环状rnacirc_zcchc24的基因组序列中g.651g>a位点出现aa基因型，或波尔山羊个体在g.1082g>t位点出现gt基因型时，则表明该个体具有较好的产羔数性状潜力。

实施例4本发明制备的分子标记与周岁生长性状的关联分析及应用。

为了确定山羊环状rnacirc_zcchc24的基因组序列中g.651g>a、g.1082g>t和g.1310a>g三个多态性位点与黑头羊周岁生长性状差异是否相关，采用实施例1建立的方法进行多态性检测，分析山羊三个位点的三种基因型与黑头羊周岁体重、体尺等生长性状的相关性。采用sas统计软件(sasinstituteinc,version9.1)glm程序进行位点基因型与周岁生长性状的关联分析，并进行显著性检验，所采用模型为：

yikjlm＝μ+gi+fk+aj+sl+pm+eikjlm

y为性状表型值，μ为单个性状的平均值，gi为基因型效应，fk为场次固定效应，aj为年龄固定效应，sl为性别固定效应，pm为胎次固定效应，e为随机误差。

在100只黑头羊群体中进行g.651g>a、g.1082g>t和g.1310a>g位点三种基因型与周岁生长性状间的关联分析，统计分析结果如表4、表5和表6所示。

表4-山羊g.651g>a位点与黑头羊周岁生长性状的关联分析：

注：同行比较中，不同小写字母代表差异显著(p<0.05)，不同大写字母代表差异极显著(p<0.01)，**代表差异极显著(p<0.01)。

由表4可知，在黑头羊群体中，g.651g>a位点的ga基因型在山羊周岁体高性状中显著高于aa基因型(p<0.05)，极显著高于gg基因型(p<0.01)，而aa基因型和gg基因型在周岁身高性状中无显著性差异，周岁体高性状的显性效应达到极显著水平(p<0.01)。

表5-山羊g.1082g>t位点与黑头羊周岁生长性状的关联分析：

注：同行比较中，不同小写字母代表差异显著(p<0.05)，不同大写字母代表差异极显著(p<0.01)，**代表差异极显著(p<0.01)。

由表5可知，在黑头羊群体的周岁体重性状中，g.1082g>t位点的tt基因型极显著高于gg基因型(p<0.01)，显著高于gt基因型(p<0.05)，gt基因型极显著高于gg基因型(p<0.01)，且加性效应为极显著水平(p<0.01)；在周岁体高性状中，gt基因型显著高于gg基因型(p<0.05)；在周岁体斜长性状中，tt基因型极显著高于gg基因型和gt基因型(p<0.01)，gt基因型极显著高于gg基因型(p<0.01)，且加性效应为极显著水平(p<0.01)；在周岁胸围和管围性状中，gt基因型显著高于gg基因型(p<0.05)。

表6-山羊g.1310a>g位点与黑头羊周岁生长性状的关联分析：

注：同行比较中，不同小写字母代表差异显著(p<0.05)，不同大写字母代表差异极显著(p<0.01)。

由表5可知，在黑头羊群体的周岁体高性状中，g.1310a>g位点的ga基因型显著高于aa基因型(p<0.05)，极显著高于gg基因型(p<0.01)。

综上所述，山羊环状rnacirc_zcchc24的基因组序列中g.651g>a、g.1082g>t和g.1310a>g三个多态性位点与黑头羊周岁生长性状中体重、体高、体斜长、胸围和管围指标中的一项或多项存在显著或极显著差异。在早期检测中，当个体g.651g>a位点出现ga基因型、g.1082g>t出现tt基因型或gt基因型、g.1310a>g位点出现ga基因型，则表明该个体具有较好的生长性状潜力。

所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

序列表

seqidno.1

atcccaggctttggtccaagcctacacgagagagaaaagaggcccagagagggaaagggctgggccagagtcacagagcagggtgtccagggagccaagaagagtgagggctgtatcctccagggaggagtgccggacctccagaggcatacatgtgtgaggtgtgggctctgtcctggttggaggaggggtgtcttgattccctgggaccagctctcagcttactaccctcccttcctacactgaggggacacagaaaaagaactggtatgcccaagaactggagcctagtaacctgagccccgtgcccaggtttgtcatcagcccctgggaagctacctctttctagtcttggcctggccccgggagaagggtctcatggccagccttactgcaggccccacctttgctgaattccagtgtgcctggccgcccagagcccgtgactcctataaatagaggctgtatacaccaggagggggcctgggccacgtctgctttgaagccaggcaagacatctggttcctgtcaactggaggtgggagaggtgagagaggtgggccgtttcctccccgggcttccagagagctggcccagactgggctgagggctccccggacccactgtgcacaggcgtcggcctgcaggagr(g/a)ccaggcaaagtgccgaacttcagtgtcctcttctgtacagtggaaacgaggctgcgagctggtcaccccaccagcacacggcagagatgcggctctcgtaggtggctttctgctgcttgtcttacctcctggcagcgtgtaaagaactaatgatcaccaccgtcaccatcatcatgtactgagtacttcgccagtgccaggcaggaaataaagggctatgttagcctcctagaaacccttggaggtagctgtcattactcctgtttactggatggggtcactggggtcccgagtggttcactggcttgtccatggatgcacaactcgagcagggatttgaacatgggctccaggaagctggagcccacaggtgactaaagagtcagtatgaaactaggaatgaaaccaccatatgacccagaaatcccack(g/t)cctaggcatataccctgaggaaacgaaaattgaaaaagacacacgtatcccattgttcattgcaacactatttgaactatagaacatggaagcaacctagatgtccgtcaacagatgaatgaataaaaagttgtgtacatatacacaatggaatattatcagccataaaaagaaacacatttgagtcagttctaatgaggtggatgaacttagaacctattatacagr(g/a)gtgaagtaagtcagaaagagaaaaataaacattatattctaatgcatatatacagaatctagaaaaatggtgctgaagaatttatttgcagggcagcaatggagaaacagacttagggaatagacttatggacaggggagaggggaggagagggtgagatgtatggaaagagtaacatggaaacttatattaccatatgtaaaatagatagccaacgggaatttgctgtatggctcaggaaactcaaacgggctctgtatcaacctggaggcgtgggatggggagggagatgggaggggggttcagaagagaggggatatatgtatacctatggctgattcgtgttgaggtttgacagaaagcaacaaaattctgtaaagcaattatccttcaataaaaaataagaaaaaagaaaaatcagggaagacaaaaaacaaagactgggtatgaatgcgcgtgtgtgtaggagcctgtggaagcacggctgcaccttgggccgggcccccaggcctcacagcctccgtccccctcaggcgctgggcagcagcgtgtacaagagcgcctcaccctacggctccctcagcaacatcgccgacggcctcagctccctcaccgagcacttctccgacctgaccctcgcctccgagacccgcaagcccagcaagcggcccccacccaactacctgtgccacctgtgcttcaacaaagggcactacatcaaggactgcccccagg

seqidno.2：

aggcatacatgtgtgaggtgtgggctctgtcctggttggaggaggggtgtcttgattccctgggaccagctctcagcttactaccctcccttcctacactgaggggacacagaaaaagaactggtatgcccaagaactggagcctagtaacctgagccccgtgcccaggtttgtcatcagcccctgggaagctacctctttctagtcttggcctggccccgggagaagggtctcatggccagcctcactgcaggccccacctttgctgaattccagtgtgcctggccgcccagagcccgtgactcctataaatagaggctgtatacaccaggagggggcctgggccacgtctgctttgaagccaggcaagacatctggttcctgtcaactggaggtgggagaggtgagagaggtgggccgtttcctccccgggcttccagagagctggcccagactgggctgagggctccccggacccactgtgcacaggcgtcggcctgcaggagr(g/a)ccaggcaaagtgccgaacttcagtgtcctcttctgtacagtggaaacgaggctgcgagctggtcaccccaccagcacacggcagagatgcggctctggtaggtggctttctgctgcttgtcttacctcctggcagcgtgtaaagaactaatgatcaccaccgtcaccatcatcatgtactgagtacttcgccagtgccaggc

seqidno.3：

actggatggggtcactggggtcccgagtggttcactggcttgtccatggatgcacaactcgagcagggatttgaacatgggctccaggaagctggagcccacaggtgactaaagagtcagtatgaaactaggaatgaaaccaccatatgacccagaaatcccack(g/t)cctaggcatataccctgaggaaacgaaaattgaaaaagacacacgtatcccattgttcattgcaacactatttgaactatagaacatggaagcaacctagatgtccgtcaacagatgaatgaataaaaagttgtgtacatatacacaatggaatattatcagccataaaaagaaacacatttgagtcagttctaatgaggtggatgaacttagaacctattatacagr(g/a)gtgaagtaagtcagaaagagaaaaataaacattatattctaatgcatatatacagaatctagaaaaatggtgctgaagaatttatttgcagggcagcaatggagaaacagacttagggaatagacttatggacaggggagaggggaggagagggtgagatgtatggaaagagtaacatggaaacttatattaccatatgtaaaatagatagccaacgggaatttgctgtatggctcaggaaactcaaacgggctctgtatcaacctggaggcgtg

seqidno.4：

aggcatacatgtgtgaggtg

seqidno.5：

gcctggcactggcgaagtac

seqidno.6：

actggatggggtcactgggg

seqidno.7：

cacgcctccaggttgatacag

seqidno.8：

ttttttttttttttttttttttttttttcgtcggcctgcaggag

seqidno.9：

ttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttatatgacccagaaatcccac

seqidno.10：

ttttttttttttttttttttttatttttctctttctgacttacttcac

序列表

<110>湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120>一种检测山羊环状rna中分子标记的方法及其应用

<141>2020-10-12

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2051

<212>dna

<213>caprahircus

<400>1

atcccaggctttggtccaagcctacacgagagagaaaagaggcccagagagggaaagggc60

tgggccagagtcacagagcagggtgtccagggagccaagaagagtgagggctgtatcctc120

cagggaggagtgccggacctccagaggcatacatgtgtgaggtgtgggctctgtcctggt180

tggaggaggggtgtcttgattccctgggaccagctctcagcttactaccctcccttccta240

cactgaggggacacagaaaaagaactggtatgcccaagaactggagcctagtaacctgag300

ccccgtgcccaggtttgtcatcagcccctgggaagctacctctttctagtcttggcctgg360

ccccgggagaagggtctcatggccagccttactgcaggccccacctttgctgaattccag420

tgtgcctggccgcccagagcccgtgactcctataaatagaggctgtatacaccaggaggg480

ggcctgggccacgtctgctttgaagccaggcaagacatctggttcctgtcaactggaggt540

gggagaggtgagagaggtgggccgtttcctccccgggcttccagagagctggcccagact600

gggctgagggctccccggacccactgtgcacaggcgtcggcctgcaggagrgaccaggca660

aagtgccgaacttcagtgtcctcttctgtacagtggaaacgaggctgcgagctggtcacc720

ccaccagcacacggcagagatgcggctctcgtaggtggctttctgctgcttgtcttacct780

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tcgccagtgccaggcaggaaataaagggctatgttagcctcctagaaacccttggaggta900

gctgtcattactcctgtttactggatggggtcactggggtcccgagtggttcactggctt960

gtccatggatgcacaactcgagcagggatttgaacatgggctccaggaagctggagccca1020

caggtgactaaagagtcagtatgaaactaggaatgaaaccaccatatgacccagaaatcc1080

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