用于检测B族链球菌的引物、探针、试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及病原微生物的检测技术领域，尤其涉及用于检测b族链球菌的引物、探针、试剂盒及检测方法。

背景技术：

b族链球菌(groupbstreptococcus，gbs)学名是无乳链球菌(s.agalactiae),在1938年首次被发现，它能引起牛乳房炎，其细胞壁中多糖物质又属于抗原构造分类中的b族，故目前一般采用b族链球菌(groupbstreptococcus，gbs)来替代无乳链球菌原名。

b族链球菌为革兰氏阳性链状球菌，大多为b溶血。链球菌细胞壁有c物质(细胞壁c多糖物质)和s物质(gbs表面荚膜多糖，capsularpolysaccharide，cps)，前者有组特异性，后者为型特异性。按c物质不同，链球菌分为18个族，gbs只是其中一族。按s物质不同，gbs迄今已分离鉴定了10种血清型：i型(包括ia、ib型)；ii型；iii型；iv型；v型、vi型、vii型、viii型和ix型，其中ix型为近年发现的一个新血清型。

1938年fry首次报告3例感染b族链球菌引起产后心内膜炎的死亡，证实b族链球菌为人类的致病菌。经过几十年的研究，发现b族链球菌可引起新生儿败血症、肺炎、脑膜炎，甚至死亡。若孕妇发生生殖道b族链球菌感染，则会致使孕妇发生流产或者早产等情况，并且会限制胎儿的生长发育，严重者甚至会致使胎儿宫内死亡。在感染后存活的新生儿，还有可能有严重的神经系统后遗症，包括脑积水、智力障碍、小头畸形、耳聋等。

孕妇gbs感染与早产、胎膜早破、产褥感染和新生儿败血症等疾病的发生密切相关。

近二十年来，美国、英国、芬兰等国家的gbs感染为新生儿感染的首位，发生率分别高达61％、28％、30％，病死率达20％～50％。申阿东等报道由gbs引起的新生儿肺炎占25.71％。根据感染发生的时间分为早发疾病、晚发疾病及复发疾病。由早发疾病引起的新生儿病死率为11.1％，晚发疾病者为27.8％。

基于gbs感染引起孕妇和新生儿相关症状、疾病的严峻性，产前筛查gbs显得尤为重要。而分娩传播是新生儿感染gbs的主要途径。因此通过抗生素预防能够有效降低gbs垂直传播引发新生儿早期侵入性感染。美国疾病预防控制中心(thecentersfordiseasecontrolandprevention，cdc)制定了围产期gbs的防治指南，所以目前已经很大程度的减少了围产期孕妇gbs感染的发生率。

目前，国内外对于gbs的预防方案都主要采用的是抗生素预防。但是近几年来，全球gbs的耐药性逐年上升。

1998年-2001年间，美国及加拿大地区，gbs对红霉素的耐药性由7％上升至25％，2003年达到37％。在我国，广州地区1999年分离的gbs菌株对红霉素和林可霉素耐药率即分别达到45％和26％，这与国内抗生素的滥用密不可分。

在gbs的治疗过程中，由于妊娠妇女带菌率大约为10％-30％，对于全部妊娠妇女注射抗生素的预防方法显然会导致抗生素不必要的使用。因此在孕妇产前进行gbs筛检显得尤为必要。

1996年美国疾病控制中心(cdc)与其他机构共同制定了《围产期b族链球菌感染筛查及防治指南》，并于2002年和2010年进行了修改，很大程度上减少了围产期b族链球菌感染的发生率和危害，发病率从90年代早期1.7/1000个新生儿降低到了近些年的0.34-0.37/1000个新生儿。

长期以来我国对gbs的感染现状重视不够，然而近期国内报道了一些gbs感染导致死亡的病例，邓江红等对北京儿童医院234例感染肺炎死亡的新生儿肺部组织石蜡标本进行了gbs检测，其检出率为65％，该结果显示新生儿肺炎死亡病例中，gbs是第一位的致病菌。

再者，由于国内抗生素的滥用，使得全国范围对围产期gbs的筛检几乎空白，如今国家不断的出台相关的政策，对抗生素的临床应用与管理进行严格监控，加之gbs的危害比较严重，这使得gbs的筛检尤为重要且必要。

国内围产期gbs感染的预防工作可以借鉴美国cdc2010年发布的gbs预防指南，对于怀孕35-37周的孕妇进行阴道和直肠的gbs筛检，这样能够提高预防效率，节省资源，同时能够大量减少不必要的抗生素使用。近几年来，全球gbs的耐药性逐年上升。在gbs的治疗过程中，由于妊娠妇女带菌率大约为10％～30％，对于全部妊娠妇女注射抗生素的预防方法显然会导致抗生素不必要的使用，因此在孕妇产前进行gbs筛检显得尤为必要。

gbs的检出率依赖于多项因素，多数学者建议从宫颈、阴道及肛周联合取材以提高阳性率。认为越接近产时筛查gbs阳性率越高，故美国妇产科协会(acog)、美国儿科协会(aap)建议对怀孕35～37周的所有孕妇进行检测。检测方法主要有细菌培养、抗原测定、分子生物学检测等。

目前，gbs的检测方法主要有细菌的分离培养、免疫学诊断和分子生物学诊断，三种方法具有以下特点：

1)病原体的分离培养是当前gbs检测的金标准，但分离培养法对技术要求较高，费用较昂贵，耗时长，在临床检测中应用不多。

2)免疫学诊断诊断还存在滞后性，不能准确反映当前是否感染或携带病原体，难以满足早期诊断的要求。

3)病原体核酸检测：具有快速、准确、检测窗口短、高灵敏度等优点，能够对gbs作出早期诊断，给疫情的快速分析和控制提供有力的技术支撑。其中实时定量pcr检测平台已成为最简捷和可靠的核酸检测方法。

但目前仍缺乏能够准确、灵敏地检测b族链球菌的荧光定量pcr试剂盒产品。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供用于检测b族链球菌的引物、探针、试剂盒及检测方法，该引物、探针所针对的靶基因片段较小，特异性较强，且灵敏度较高。

本发明提供的用于检测b族链球菌的引物、探针，由seqidno:1～2所示核苷酸序列的引物和seqidno:3所示核苷酸序列的探针组成。

本发明选择b族链球菌surfaceimmunogenicprotein(sip)基因保守区域、β-珠蛋白基因(hbb，内标)保守区域，设计特异性引物和探针，利用实时荧光定量pcr技术，制成b族链球菌实时荧光定量pcr检测试剂盒，并介绍了其使用方法。

本发明中，seqidno:1～2所示核苷酸序列的引物对和seqidno:3所示核苷酸序列的探针针对b族链球菌(gbs)sip基因的保守区域设计，所述gbs特异性靶基因片段长度为121bp；序列为：ctctcaatacaatttcggaaggtatgacaccagaagcagcaacaacgattgtttcgccaatgaagacatattcttctgcgccagctttgaaatcaaaagaagtattagcacaagagcaagc(seqidno.7)。

本发明所述的引物和探针具有良好的准确性、灵敏度和重复性，能够准确、快速地检测人阴道分泌物、泌尿道分泌物中的b族链球菌(gbs)。

本发明中，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

具体的，seqidno:3所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团fam，3’端标记有荧光淬灭基团bhq1。

本发明还提供了所述引物、探针在制备用于检测b族链球菌的试剂盒中的应用。

本发明还提供了用于检测b族链球菌的试剂盒，包括所述的引物、探针。

本发明提供的试剂盒中，还包括对内参基因hbb检测的引物和探针；

所述针对内参基因hbb检测的引物的核苷酸序列如seqidno:4～5所示；所述针对内参基因hbb检测的探针的核苷酸序列如seqidno:6所示。所述hbb特异性靶基因片段序列为：tctgactcctgaggagaagtctgccgttactgccctgtggggcaaggtgaacgtggatgaagttggtggtgaggccctgggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcatg(seqidno：8)。本发明提供的试剂盒中，seqidno:6所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团rox，3’端标记有荧光淬灭基团bhq2。

本发明提供的试剂盒中还包括荧光定量pcr检测试剂和/或样本提取试剂；

所述荧光定量pcr检测试剂包括qpcrmastermix酶混合液、qpcrmastermix反应缓冲液；所述qpcrmastermix酶混合液包括taq酶和ung酶，所述taq酶为anstarttaqdna聚合酶，所述ung酶为尿嘧啶-n-糖基化酶；

所述样本提取试剂包括naoh、tritonx-100和te缓冲液。

所述样本提取试剂中，naoh终浓度为0.01～0.5％，更优选为0.1％；tritonx-100终浓度为0.01～0.5％，更优选为0.1％。

本发明提供的试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照；

本发明的阴性对照品为灭菌水；

本发明的阳性对照品为含有b族链球菌靶基因和hbb基因片段的质粒溶液。

其中，含有gbs/hbb靶基因片段的质粒溶液浓度为10000拷贝/μl，对应的ct值均在23左右。

本发明所述试剂盒应保存于-20℃，尽量减少反复冻融。

本发明还提供了b族链球菌的检测方法，以本发明所述的试剂盒，对待测样品dna进行实时荧光定量pcr检测，产生s型扩增曲线则为阳性。

具体地，本发明提供的b族链球菌的检测方法，包括：

(1)核酸提取：向阴道分泌物、泌尿道分泌物样本收集管中加入1ml生理盐水，充分振荡洗涤棉拭子，然后将棉拭子靠壁挤干丢弃，取500μl液体转移至1.5ml的离心管中，13000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀中加入1ml生理盐水，打散沉淀，13000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀中加入已振荡混匀的样本提取试剂50μl，漩涡振荡器上振荡打散沉淀(必要时用枪头轻轻打散沉淀)，100℃干浴或者水浴10分钟，13000rpm离心5分钟，上清液用于pcr反应(吸取时不用触动管子底部的沉淀物)。

(2)实时定量荧光pcr：利用上述gbs实时荧光定量pcr检测试剂盒进行pcr扩增反应，分别以提取的待检样品dna、阳性对照和阴性对照为模板，与试剂盒的反应混合液混合，进行实时荧光定量pcr反应，检测荧光信号。

本发明所述方法中，所述实时荧光定量pcr的体系包括：

所述实时荧光定量pcr的程序包括：

50℃2分钟；

95℃5分钟预变性；

95℃15秒→60℃35秒，45个循环。

其中，所述引物终浓度为100～1000nm，更优选为500nm；所述荧光探针浓度为10-500nm，更优选为200nm。

对于结果的判断，具体包括：

①应满足：阳性对照，fam通道有明显的扩增，具有典型s型扩增曲线，且ct值小于30；阴性对照，fam通道、rox通道ct值＝45(或显示为undet)或无典型s型扩增曲线，进行后续判断，否则应进行问题查找；

②待检样品dna的扩增曲线ct值<38且有典型s型扩增曲线，为阳性结果；

③待检样品dna的扩增曲线ct值等于45(或显示为undet)或无典型s型扩增曲线，为阴性结果；

④待检dna样品的扩增曲线38≤ct值<45，为灰色区域，如重测结果仍为ct值<45，且有典型s型扩增曲线，则判定为阳性结果；如ct值仍不显示或无典型s型扩增曲线，则判定为阴性结果。

本发明所述的引物和探针可用于多种来源样品中b族链球菌的检测。对生物样品的检测可以判断该样品是否被b族链球菌感染，而对非生物样品的检测可以判断该样品是否被b族链球菌。因此，本发明所述的试剂盒可用于样品的非诊断目的的检测。本发明中，所述检测的样品来自阴道、医疗器械、药品、食品或化妆品。一些具体实施例中，所述的待测样品阴道分泌物或泌尿道分泌物。

本发明的有益效果至少包括：

(1)发明针对gbs/hbb的保守区域，共特异性设计了4条引物和2条taqman探针，与目的基因的保守区域结合，具有很高的特异性，与铜绿假单胞菌菌株cmcc10104、金黄色葡萄球菌菌株cmcc26001、干酪乳杆菌株cmcc34103、大肠埃希氏菌株cmcc44103、变形杆菌株cmcc49102、伤寒沙门氏菌株cmcc50096、福氏志贺氏菌株cmcc51573、白色念珠菌株cmcc98001、人型支原体(mh)、单纯疱疹病毒1/2型(hsv-1/2)、人乳头瘤病毒(hpv)、人巨细胞病毒(hcmv)、肺炎支原体(mp)、生殖支原体(mg)均没有交叉反应；

(2)靶标基因片段较短，均在80～150bp之间，若过短可能会影响ung酶的去污染效果，若过长会造成反应效率下降，因此本发明既能有效避免污染，又能保证反应的高效性和灵敏度，均能检测到低至5个拷贝的gbsdna；

(4)在反应管内加入人类β-珠蛋白基因特异性引物探针，可有效监控样本采样、样本提取、pcr检测全过程，克服提取过程中加入外标，不能有效监控样本采样成功与否的弊端。

本发明的试剂盒非常适合临床使用和推广，对我国临床b族链球菌感染的辅助诊断具有重要的意义。

附图说明

图1为实施例4特异性实验的荧光检测结果，各检测曲线对应的模板为1：铜绿假单胞菌菌株cmcc10104，2：金黄色葡萄球菌菌株cmcc26001、3：干酪乳杆菌株cmcc34103、4：大肠埃希氏菌株cmcc44103、5：变形杆菌株cmcc49102、6：伤寒沙门氏菌株cmcc50096、7：福氏志贺氏菌株cmcc51573、8：白色念珠菌株cmcc98001、9：人型支原体(mh)、10：单纯疱疹病毒1/2型(hsv-1/2)、11：人乳头瘤病毒(hpv)、12：人巨细胞病毒(hcmv)、13：肺炎支原体(mp)、14：生殖支原体(mg)、15：b族链球菌；

图2为实施例5灵敏度实验中gbs(fam通道)荧光检测结果，各检测曲线1～6对应的模板是人基因组梯度稀释的gbs靶基因质粒溶液，对应的浓度依次为1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹、1.0×10⁰拷贝/μl；

图3为实施例6重复性试验中企业精密度参考品(r1)的荧光检测结果。

具体实施方式

本发明提供了用于检测b族链球菌的引物、探针、试剂盒及检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：用于快速检测gbs的引物探针对的设计

下载ncbi中b族链球菌sip基因序列、hbb基因序列，利用vectornti软件、dnastar、ncbi等进行序列比对，选择最保守的区域，并对该区域进行blast比对，设计引物对和探针，序列如下：

表1引物和探针序列

实施例2：用于快速检测gbs的实时荧光定量pcr试剂盒的建立

用于快速检测gbs的实时荧光定量pcr试剂盒，包括表1所示的引物和探针(seqidno.1-6)、荧光定量pcr检测试剂、样本提取试剂阳性对照品、阴性对照品、说明书和盒体。

其中引物gbs-f、gbs-r、hbb-f、hbb-r终浓度500nm。

其中探针gbs-p、hbb-r浓度为200nm。

其中gbs-p探针荧光基团为fam，猝灭基团为bhq1，hbb-p探针荧光基团为rox，猝灭基团为bhq1。

其中，所述荧光定量pcr检测试剂包括qpcrmastermix酶混合液、qpcrmastermix反应缓冲液；所述qpcrmastermix酶混合液包括taq酶和ung酶，所述taq酶为anstarttaqdna聚合酶，所述ung酶为尿嘧啶-n-糖基化酶；

其中样本提取试剂为含0.1％naoh、0.1％tritonx-100的te缓冲液。

其中阳性对照品，为含有gbs/hbb靶基因片段的质粒溶液，浓度为10000拷贝/μl，对应的ct值均在在23左右。

其中gbs特异性靶基因片段序列为：

ctctcaatacaatttcggaaggtatgacaccagaagcagcaacaacgattgtttcgccaatgaagacatattcttctgcgccagctttgaaatcaaaagaagtattagcacaagagcaagc(seqidno.7)。

其中hbb特异性靶基因片段序列为：

tctgactcctgaggagaagtctgccgttactgccctgtggggcaaggtgaacgtggatgaagttggtggtgaggccctgggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcatg(seqidno.8)。

其中阴性对照品为灭菌水。

实施例3：gbs核酸检测试剂盒的快速检测方法

利用实施例2的试剂盒快速检测人阴道分泌物、泌尿道分泌物中的gbs，具体步骤如下：

(1)核酸提取：向阴道分泌物、泌尿道分泌物样本收集管中加入1ml生理盐水，充分振荡洗涤棉拭子，然后将棉拭子靠壁挤干丢弃，取500μl液体转移至1.5ml的离心管中，13000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀中加入1ml生理盐水，打散沉淀，13000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀中加入已振荡混匀的样本提取试剂50μl，漩涡振荡器上振荡打散沉淀(必要时用枪头轻轻打散沉淀)，100℃干浴或者水浴10分钟，13000rpm离心5分钟，上清液用于pcr反应(吸取时不用触动管子底部的沉淀物)。

(2)实时定量荧光pcr：利用上述gbs实时荧光定量pcr检测试剂盒进行pcr扩增反应，反应体系为：

实时荧光定量pcr的程序包括：

50℃2分钟；

95℃5分钟预变性；

95℃15秒→60℃35秒，45个循环。

fam、rox通道用于收集检测荧光信号。

(3)结果判断：

①应满足：阳性对照，fam通道、rox通道均有明显的扩增，具有典型s型扩增曲线，且ct值小于30；阴性对照，fam通道ct值＝45(或显示为undet)或无典型s型扩增曲线，进行后续判断，否则应进行问题查找；

②待检样品dna的扩增曲线ct值<38且有典型s型扩增曲线，为阳性结果；

③待检样品dna的扩增曲线ct值等于45(或显示为undet)或无典型s型扩增曲线，为阴性结果；

④待检dna样品的扩增曲线38≤ct值<45，为灰色区域，如重测结果仍为ct值<45，且有典型s型扩增曲线，则判定为阳性结果；如ct值仍不显示或无典型s型扩增曲线，则判定为阴性结果。

实施例4：特异性实验

利用实施例2中的试剂盒、实施例3的方法分别对铜绿假单胞菌菌株cmcc10104、金黄色葡萄球菌菌株cmcc26001、干酪乳杆菌株cmcc34103、大肠埃希氏菌株cmcc44103、变形杆菌株cmcc49102、伤寒沙门氏菌株cmcc50096、福氏志贺氏菌株cmcc51573、白色念珠菌株cmcc98001、人型支原体(mh)、单纯疱疹病毒1/2型(hsv-1/2)、人乳头瘤病毒(hpv)、人巨细胞病毒(hcmv)、肺炎支原体(mp)、生殖支原体(mg)、b族链球菌进行pcr检测，结果见图1，结果表明，仅含gbs/hbb靶基因片段的质粒溶液，即阳性对照品为阳性，其余管均为阴性。结果表明，本发明的检测试剂盒特异性高，能准确地、特异地将gbs检测出来。

实施例5：灵敏度实验

选取以含有人基因组的te溶液为基质，梯度稀释1.0×10⁰～1.0×10⁵拷贝/μl浓度的gbs质粒作为样品，用本发明实施例2中的试剂盒、实施例3的方法进行检测。检测结果如图2所示，结果表明，本试剂盒对gbs的最低检出限浓度为1.0×10⁰拷贝/μl，即最低检出限为5拷贝。

实施例6：重复性试验

取企业参考品中的精密度参考品r1，用实施例2中的试剂盒、实施例3的方法进行检测，连续重复10次试验，检测结果见图3、表2所示，结果显示阳性对照的100倍稀释品ct值变异系数均小于5％。

表2

以上结果表明，本发明试剂盒具有准确性好、灵敏度高、重复性强、使用方便的特点，适合临床使用。

对比例1

表3对照引物和探针序列

取阳性对照品(即含gbs靶基因片段的质粒溶液)，测定其浓度并计算拷贝数，按照10倍的浓度梯度稀释，选取1.0×10⁰～1.0×10⁶拷贝/μl的浓度作为样品，用表示4所示的对照引物和探针进行检测。

结果表明，对照引物和探针对gbs的最低检出限浓度为100拷贝/μl(相当于浓度10000个菌/ml)，即最低检出限为500拷贝。

结果显示，对照引物和探针反应效率偏低，灵敏度不足。

实施例7：妇科用药对样本检测影响

选择市面上常见的妇科用药及清洁品，包括消糜栓、硝呋太尔制霉素阴道软胶囊、美妇康卡波姆凝胶、宫炎洁卡波姆凝胶、氧氟沙星凝胶、氧氟沙星凝胶、甲硝唑呋喃酮栓、洁尔阴洗液，进行试验，验证其对试剂盒检测的影响。

结果表明，0.1mg/ml消糜栓、10mg/ml硝呋太尔制霉素阴道软胶囊、10mg/ml美妇康卡波姆凝胶、10mg/ml宫炎洁卡波姆凝胶、10mg/ml氧氟沙星凝胶、10mg/ml甲硝唑呋喃酮栓、0.1％洁尔阴洗液，对检测不存在干扰，能够准确检测出药品中是否存在gbs感染。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中生方政生物技术股份有限公司

<120>用于检测b族链球菌的引物、探针、试剂盒及检测方法

<130>mp1916188

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ctctcaatacaatttcggaagg22

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gcttgcycttgtgctaatac20

<210>3

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

atgacaccagaagcagcaacaacgatt27

<210>4

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

tctgactcctgaggagaagtctgcc25

<210>5

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

catgcccagtttctattggtctcctt26

<210>6

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

ccttgccccacagggcagtaacgg24

<210>7

<211>121

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

ctctcaatacaatttcggaaggtatgacaccagaagcagcaacaacgattgtttcgccaa60

tgaagacatattcttctgcgccagctttgaaatcaaaagaagtattagcacaagagcaag120

c121

<210>8

<211>138

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

tctgactcctgaggagaagtctgccgttactgccctgtggggcaaggtgaacgtggatga60

agttggtggtgaggccctgggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagac120

caatagaaactgggcatg138

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