一种诺如病毒核酸检测试剂盒的制作方法

本发明属于诺如病毒核酸检测技术领域，具体来说是一种诺如病毒核酸检测试剂盒。

背景技术：

诺如病毒(norovirus，nv)是引起肠道急性病症的rna病毒，根据rna多聚酶区核苷酸序列的相似性，将nv分为5个基因型(gi～gv)，其中只有gi、gⅱ和giv可以感染人。诺如病毒已被很多国家认为是导致成人和儿童病毒性腹泻及肠胃炎的首要病原体，以手-粪-口为主，其次是直接接触传染，我国流行的人类诺如病毒主要以基因组ⅱ为主。感染临床表现为急性胃肠炎和渗透性腹泻病，病程一般为7天，发热持续3天，呕吐2～3天，腹泻5天，严重出现脱水症状。诺如病毒多在寒冷的冬季发病，所以又被称为冬季呕吐症。因为其不能在细胞或组织中培养，对诊断工作带来了一定的困难。

经过检索，中国发明专利：腹泻病原体多重基因检测体系及其试剂盒和应用(申请号为201710503230.3，申请日为2017.06.27)，该申请案公开了一种腹泻病原体多重基因检测体系及其试剂盒和应用。检测体系共有22对引物，其中包括19对腹泻病原体、2对人基因组内参和1对系统质控内参引物。腹泻病原体分别针对空肠弯曲菌、志贺菌、艰难梭菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、肠产毒性大肠埃希菌、大肠埃希菌o157、弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、人星状病毒、诺如病毒ii、人肠道腺病毒、轮状病毒等。可在同一反应体系内直接对粪便样本进行多种腹泻病原体的同步检测和分析，弥补了常规检测方法通量低、耗时长和检出率低等缺点，第一时间为临床提供全面、精准、低成本的病原学诊断，为个体化用药和精准医疗提供重要参考。但是该申请案针对多种引起腹泻的病原体(包括细菌和病毒)进行检测，所用方法为毛细管电泳，通过引物设计，不同的病原体可扩增不同长度的dna片段，将扩增产物从pcr仪取出后转移至毛细管电泳分析仪中分析扩增片段长度，不同长度dna片段电泳速度不同，从而区分不同的病原体。该申请案的不足之处：1.引物设计复杂，引物合成成本较高。2.检测过程耗时较长，需先提取核酸，再pcr扩增，再毛细管电泳分析片段长度进而分析可能感染的病原体。3.如若引物设计不够合理，不同目的基因扩增片段长度相差过小，则会因为电泳中的漂移问题，无法有效判断扩增片段的大小，进而带来检测误差。4.该方法仅包含诺如gⅱ型扩增引物，因此无法检测其他分型的诺如病毒。而目前不管是从临床个性化诊治还是国家疾控传染病监测需要，均需监测并区分患者所感染的诺如病毒型别。

技术实现要素：

1.发明要解决的技术问题

本发明的目的在于解决现有的诺如检测技术无法快速，准确，低成本地解决诺如病毒检测诊断并区分病毒分型的问题。

2.技术方案

为达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

本发明的一种诺如病毒核酸检测试剂盒，包括核酸扩增反应液、酶混合液、诺如病毒反应液、阳性对照液和阴性对照液。

优选的，所述诺如病毒反应液包括诺如病毒gⅰ上游引物、诺如病毒gⅰ下游引物、诺如病毒gⅰ探针p1、诺如病毒gⅰ探针p2、诺如病毒gⅱ上游引物、诺如病毒gⅱ下游引物、诺如病毒gⅱ探针、内参rnasep上游引物、内参rnasep下游引物和内参rnasep探针。

优选的，所述核酸扩增反应液包括核苷酸混合液、buffer、mgcl2溶液和depc水。

优选的，所述酶混合液包括ung酶5u/μl、dna聚合酶2.5u/μl、逆转录酶200u/μl、rna酶抑制剂40u/μl和酶稀释液。

优选的，所述阳性对照液包括诺如病毒病毒样颗粒、内参rnasep病毒样颗粒和tebuffer，所述阴性对照液为0.9％的氯化钠溶液。

优选的，所述诺如病毒gⅰ型上游引物的序列为gctagtggcgctggtca，所述诺如病毒gⅰ型下游引物的序列为attaacttgtccagcagtcgc，所述诺如病毒gⅰ型探针的序列为aatggatcctgtagcaggttcttcgaca，所述诺如病毒gⅱ型上游引物的序列为tatgaggaggtggccattg，所述诺如病毒gⅱ型下游引物的序列为ccggatcttggcctcct，所述诺如病毒gⅱ型探针的序列为cagggcgaccgaggaagacttctgtgaag。

优选的，所述内参上游引物的序列为agatttggacctgcgagcg，所述内参下游引物的序列为gagcggctgtctccacaagt，所述内参探针的序列为ttctgacctgaaggctctgcgcg。

一种诺如病毒核酸检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

s100、预处理，分别取出核酸扩增反应液、酶混合液、诺如病毒反应液、阳性对照和阴性对照，并在室温下融化，充分振荡混匀后瞬间离心；

s200、配置反应液并放在pcr反应管中，每个pcr反应管中20μl；

s300、提取核酸；

s400、加样，在步骤s200配置的反应液中分别加入待测样本、阳性对照和阴性对照核酸各5μl，盖紧管盖，瞬时离心；

s500、扩增和荧光信号检测，将步骤s400得到的pcr反应管放置在荧光定量pcr仪中进行扩增和荧光信号检测；

s600、结合内参检测结果判断样本检测结果。

优选的，所述步骤s200中的配置反应液为核酸扩增反应液12μl/人份、酶混合液4μl/人份、诺如病毒反应液4μl/人份。

优选的，所述步骤s500中的荧光定量pcr仪的扩增和荧光信号检测循环参数如下：

3.有益效果

采用本发明提供的技术方案，与现有技术相比，具有如下有益效果：

本发明的一种诺如病毒核酸检测试剂盒及使用方法，包括核酸扩增反应液、酶混合液、诺如病毒反应液、阳性对照液和阴性对照液，在同一反应体系中加入一条或多条不同荧光标记的探针和引物(针对诺如病毒的探针标记fam，针对内参基因的探针标记rox)，可以在同一反应体系中检测是否感染诺如病毒以及通过内参对样本整个过程进行监控，避免假阴性结果的误判。探针为包括5’端报告基团和3’端淬灭基团的寡核苷酸。当探针完整时，由于淬灭基团靠近报告基团而极大降低了报告基团发出的荧光。引物延伸时，与模板结合的探针被taq酶(5’→3’外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号，从而实现对诺如病毒在核酸水平上的检测。

附图说明

图1为本发明的诺如病毒反应液的组分表；

图2为本发明的酶混合液的组分表；

图3为本发明的核酸扩增反应液的组分表。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述，附图中给出了本发明的若干实施例，但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例，相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。

需要说明的是，当元件被称为“固设于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件；当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件；本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明；本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1

参照附图1-附图3，本实施例的一种诺如病毒核酸检测试剂盒，包括核酸扩增反应液、酶混合液、诺如病毒反应液、阳性对照液和阴性对照液。

其中，所述诺如病毒反应液包括诺如病毒gⅰ上游引物、诺如病毒gⅰ下游引物、诺如病毒gⅰ探针p1、诺如病毒gⅰ探针p2、诺如病毒gⅱ上游引物、诺如病毒gⅱ下游引物、诺如病毒gⅱ探针、内参rnasep上游引物、内参rnasep下游引物和内参rnasep探针。

其中，核酸扩增反应液包括核苷酸混合液、buffer、mgcl2溶液和depc水。

其中，酶混合液包括ung酶5u/μl、dna聚合酶2.5u/μl、逆转录酶200u/μl、rna酶抑制剂40u/μl和酶稀释液。

其中，阳性对照液包括诺如病毒病毒样颗粒、内参rnasep病毒样颗粒和tebuffer，所述阴性对照液为0.9％的氯化钠溶液。

其中，所述诺如病毒gⅰ型上游引物的序列为gctagtggcgctggtca，所述诺如病毒gⅰ型下游引物的序列为attaacttgtccagcagtcgc，所述诺如病毒gⅰ型探针的序列为aatggatcctgtagcaggttcttcgaca，所述诺如病毒gⅱ型上游引物的序列为tatgaggaggtggccattg，所述诺如病毒gⅱ型下游引物的序列为ccggatcttggcctcct，所述诺如病毒gⅱ型探针的序列为cagggcgaccgaggaagacttctgtgaag。

优选的，所述内参上游引物的序列为agatttggacctgcgagcg，所述内参下游引物的序列为gagcggctgtctccacaagt，所述内参探针的序列为ttctgacctgaaggctctgcgcg。

内参引物的tm值在55-60℃之间，gc含量在30-80％，两条引物的tm值差异小于5℃；扩增长度50-150bp之间；引物3’末端自身错配小于3bp；引物在非靶标序列中，无特异结合位点，或特异结合区域大于1000bp。探针的tm值在60-70℃之间，gc含量在30-80％；探针的5’端第一个碱基不能为g；探针无大于3bp的发夹结构。

本实施例的内参是对样本本身内参的检测，在样本中含有天然的人脱落细胞，因此含有大量的内参基因，由于内参基因独立于诺如病毒，因此无论样本中是否含有诺如病毒，其内参均为阳性。本实施例的内参会参与样本采集到rt-pcr的过程，可用于对样本采集、保存和运输以及核酸提取过程和扩增过程进行监控，避免假阴性判读结果的出现，而现有的呼吸道病毒检测试剂中的内参为外源的含有内参基因片段的慢病毒，不参与提取，只参与扩增，这样只能指示扩增的结果是否正常，完全不能避免样品采集，保存运输和核酸提取过程有误而导致的阴性结果的出现。

一种诺如病毒核酸检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

s100、预处理，分别取出核酸扩增反应液、酶混合液、诺如病毒反应液、阳性对照和阴性对照，并在室温下融化，充分振荡混匀后瞬间离心；

s200、配置反应液并放在pcr反应管中，每个pcr反应管中20μl；

s300、提取核酸；

s400、加样，在步骤s200配置的反应液中分别加入待测样本、阳性对照和阴性对照核酸各5μl，盖紧管盖，瞬时离心；

s500、扩增和荧光信号检测，将步骤s400得到的pcr反应管放置在荧光定量pcr仪中进行扩增和荧光信号检测；

s600、结合内参检测结果判断样本检测结果。

优选的，所述步骤s200中的配置反应液为核酸扩增反应液12μl/人份、酶混合液4μl/人份、诺如病毒反应液4μl/人份。

优选的，所述步骤s500中的荧光定量pcr仪的扩增和荧光信号检测循环参数如下：

采用实时荧光pcr技术，实时荧光pcr技术是在同一反应体系中加入一条或多条不同荧光标记的探针和引物(针对诺如病毒的探针标记fam，针对内参基因的探针标记rox)，可以在同一反应体系中检测是否感染诺如病毒以及通过内参对样本整个过程进行监控，避免假阴性结果的误判。探针为包括5’端报告基团和3’端淬灭基团的寡核苷酸。当探针完整时，由于淬灭基团靠近报告基团而极大地抑制报告基团发出荧光。引物延伸时，与模板结合的探针被taq酶(5’→3’外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号，从而实现对诺如病毒在核酸水平上的检测。

pcr反应过程中，若待检样本包含诺如病毒，则标记fam的探针产生荧光信号。另外，每个反应中含有内参基因，则标记的rox的探针应产生荧光信号，用于检测仪器故障、试剂因素、聚合酶活性因素等。

以上所述实施例仅表达了本发明的某种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制；应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围；因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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