环介导等温扩增检测并区分细粒棘球蚴和多房棘球蚴的引物组的制作方法

本发明涉及寄生虫的分子检测技术领域，特别是涉及环介导等温扩增检测并区分细粒棘球蚴和多房棘球蚴的引物组。

背景技术：

棘球蚴病是一种严重影响人民健康和畜牧业发展的人兽共患寄生虫病，由棘球蚴的幼虫感染所致，属于被忽视的热带病。世界卫生组织指出，全球每年因棘球蚴病死亡的人数约1.93万人，疾病负担约87.1万伤残调整生命年(disabilityadjustedlifeyear，daly)。另外，棘球蚴病严重影响畜牧业的发展，每年因该病造成的全球经济损失高达20亿美元。我国受棘球蚴病威胁的人口约五千万，血清学阳性率约12.04％，新疆、内蒙古高达20％以上。b超检查棘球蚴病患病率为1.08％，患者约38万人。家畜平均感染率约50％，每年给我国农畜产品造成超8亿元经济损失。棘球蚴病已成为影响我国西部地区农牧民身体健康和制约牧区经济发展的重要原因之一。人类因摄取受污染的食物、水源或土壤中含有的棘球蚴虫卵或直接接触动物宿主而感染此病。棘球蚴病主要有囊型、泡型、单囊型和多囊型四种形式，囊型和泡型是人类感染此病的两种最主要形式，其中囊型包虫病病原为细粒棘球蚴(echinococcusgranulosus)，泡型包虫病病原为多房棘球蚴(echinococcusmultilocularis)。棘球蚴病的诊断主要以超声波等影像学检查为依据，计算机断层扫描(ct)和/或核磁共振(mri)扫描辅助诊断或确诊。血清学检测对棘球蚴病的支持诊断和流行病学调查具有重要意义。活体组织检查与超声波引导下的穿刺可用于包虫与脓肿或肿瘤的鉴别诊断。以上检查方法存在灵敏度不高、漏检的缺点，尤其是在棘球蚴病的无症状潜伏期内。

为有效控制棘球蚴病，需要建立高度敏感、特异和简便的检测技术。聚合酶链反应(pcr)具有极高的灵敏度和特异性，并已应用于多种寄生虫病的诊断，但pcr需要精密仪器的配套使用，无法满足基层和现场检测的需求；此外，已有mgb探针实时定量pcr分型检测多房棘球蚴与细粒棘球蚴的方法，同样的需要专业的实验技术操作人员及专门的检测仪器(荧光定量pcr仪)，无法胜任基层和现场的检测需要。

notomitsugunori等在2000年开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法，即环媒介导的恒温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)，该技术除了高灵敏度和特异性外，操作简便，对人员和仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，能够满足基层与现场的检测需求。lamp的原理是利用嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillusstearothermophilus，bst)大片段dna聚合酶的链置换活性和根据不同靶序列设计的两对特殊的内引物(fip由f1c和f2组成；bip由b1c和b2组成)、外引物(f3和b3)，特异地识别靶序列上的6个独立区域，在等温条件下进行靶序列高效快速扩增。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的缺点，提供一种新型的细粒棘球蚴及多房棘球蚴核酸快速检测引物，使细粒棘球蚴及多房棘球蚴的核酸检测快速、灵敏度高、特异性强且能区分细粒棘球蚴及多房棘球蚴；操作简便、成本低廉，结果易判读。

本发明首先提供了一种环介导等温扩增检测并区分细粒棘球蚴和多房棘球蚴的引物组，包括两对外引物和两对内引物，序列如下：

第一对外引物：

外引物f3-1：5’-gcatgtgtgtgaatgcaagc-3’，

外引物b3-1：5’-gggcaatcgcagtgaagt-3’；

第一对内引物：

内引物fip-1：5’-aactacctccacagcacggcagcagatgcctacccatcc-3’，

内引物bip-1：5’-taagacatcggtgcgagcactctgccttcgttaggtggagat-3’；

第二对外引物：

外引物f3-2：5’-aaccaccaacctttcggtta-3’，

外引物b3-2：5’-ggaatgggaaggtgatggc-3’；

第二对内引物：

内引物fip-2：5’-gcagtgtagcgcgtggcacagccgaacgcgctaac-3’，

内引物bip-2：5’-gcaagccgccgcctcttctgatggtgaggtagtgttgca-3’。

本发明又提供了所述的引物组在鉴别细粒棘球蚴和多房棘球蚴中的应用。其中，检测样品为细粒棘球蚴和多房棘球蚴的虫体或虫卵，只要有细粒棘球蚴和多房棘球蚴的基因组dna，都可以检测。

本发明又提供了一种用于鉴别细粒棘球蚴和多房棘球蚴的检测试剂盒，包含所述的引物组。

本发明还提供了一种鉴别细粒棘球蚴和多房棘球蚴的方法，包括以下步骤：

(1)提取待检测样品的基因组dna；

(2)以步骤(1)提取的基因组dna作为扩增模板，使用所述的引物组进行环介导等温扩增，扩增反应分为两个，第一个反应使用第一对外引物和第一对内引物，第二个反应使用第二对外引物和第二对内引物；

(3)根据步骤(2)两个反应的扩增结果进行判断，若第一个反应和第二个反应扩增结果均为阳性，则待检测样品含细粒棘球蚴；如第一个反应扩增结果为阴性而第二个反应扩增结果为阳性，则待检测样品含多房棘球蚴；若第一个反应和第二个反应扩增结果均为阴性，则待检测样品不含细粒棘球蚴和多房棘球蚴。

环介导等温扩增反应程序为64℃下反应40min。

环介导等温扩增的反应体系为：2μl基因组dna、使用浓度5pmol外引物和使用浓度40pmol内引物、lamp缓冲液、使用浓度8u的bstdna聚合酶、使用浓度8u的焦磷酸酶、使用浓度1.5mm的dntp、使用浓度7.5mm的mgso4、ddh2o，

其中lamp缓冲液包括使用浓度为20mm的tris-hcl、10mm的kcl、10mm的(nh4)2so4、质量分数0.1％的tween-20和1m的甜菜碱。

其中，步骤(2)环介导等温扩增反应产物的检测可以使用多种方法来检测，比如，可以通过在反应液中加入荧光染料并且将反应在荧光定量pcr仪上进行，通过收集荧光信号判断反应结果。优选的，步骤(2)环介导等温扩增反应结束后，将反应产物与检测液混合，若溶液变为蓝色则扩增结果为阳性，若溶液保持无色则扩增结果为阴性，其中，所述检测液为：由4μl钼酸-酒石酸钾氧锑溶液、106μl蒸馏水、2μl的质量分数为10％的抗坏血酸和106μl双蒸水构成的混合溶液，其中，钼酸-酒石酸钾氧锑溶液包含有21mm钼酸、2mm酒石酸钾氧锑和5m硫酸。使用焦磷酸酶检测，可通过颜色变化判定检测结果，实现检测结果的可视化，可以不需要使用荧光定量pcr仪，且操作比较简便，适用范围广。

本发明环介导等温扩增检测并区分细粒棘球蚴和多房棘球蚴的引物组，通过两个反应就可区分出阳性样本含有细粒棘球蚴或多房棘球蚴基因组dna，最低可检测到1.6fg的模板dna，检测灵敏度高、特异性强。

附图说明

图1为第一对外引物、第一对内引物的特异性检测结果。1-7分别为细粒棘球蚴、多房棘球蚴、鼠绦虫、裂头蚴广州分离株、裂头蚴河南分离株、日本血吸虫、广州管圆线虫基因组dna，8为蒸馏水。

图2为第二对外引物、第二对内引物的特异性检测结果。1-7分别为细粒棘球蚴、多房棘球蚴、鼠绦虫、裂头蚴广州分离株、裂头蚴河南分离株、日本血吸虫、广州管圆线虫基因组dna，8为蒸馏水。

图3为第一对外引物、第一对内引物的灵敏性检测结果。1-7分别为1.6pg，160fg，16fg，1.6fg，0.16fg，0.016fg，0.0016fg细粒棘球蚴基因组dna，8为蒸馏水。

图4为第二对外引物、第二对内引物的灵敏性检测结果。1-7分别为140pg，14pg，1.4pg，140fg，14fg，1.4fg和0.14fg多房棘球蚴基因组dna。

图5为焦磷酸酶检测灵敏度的检测结果。1-4分别为160fg，16fg，1.6fg，0.16fg细粒棘球蚴基因组dna，5为蒸馏水。

具体实施方式

实施例1：引物设计

根据细粒棘球蚴重复序列repeatregionsequence(rrs)(genebank：kr347168.1)及多房棘球蚴emtriple83微卫星序列(ncbi:af492849.1)进行了引物设计，提供了棘球蚴等温扩增反应所需的引物组共2组8条，包括外引物f3-1、b3-1、f3-2、b3-2，内引物fip-1、bip-1、fip-2、bip-2。

第一对外引物：

外引物f3-1：5’-gcatgtgtgtgaatgcaagc-3’，

外引物b3-1：5’-gggcaatcgcagtgaagt-3’；

第一对内引物：

内引物fip-1：5’-aactacctccacagcacggcagcagatgcctacccatcc-3’，

内引物bip-1：5’-taagacatcggtgcgagcactctgccttcgttaggtggagat-3’；

第二对外引物：

外引物f3-2：5’-aaccaccaacctttcggtta-3’，

外引物b3-2：5’-ggaatgggaaggtgatggc-3’；

第二对内引物：

内引物fip-2：5’-gcagtgtagcgcgtggcacagccgaacgcgctaac-3’，

内引物bip-2：5’-gcaagccgccgcctcttctgatggtgaggtagtgttgca-3’。

实施例2：第一对外引物、第一对内引物的特异性检测

以多房棘球蚴、细粒棘球蚴、鼠绦虫、裂头蚴广州分离株、裂头蚴河南分离株、日本血吸虫、广州管圆线虫基因组dna为模板，将各模板加入反应管中，并加入引物组f3-1，b3-1，fip-1，bip-1(外引物终浓度为5pmol，内引物终浓度为40pmol)，8ubst2.0dna聚合酶，1.5mmdntp，7.5mmmgso4和ddh2o，此外还要加入1μl浓度为25μm的syto13荧光染料，在伯乐的荧光定量pcr仪上进行反应，具体的反应程序为：65℃反应1.5h并收集荧光数据，95℃反应5min。

结果如图1所示，该引物组能检测到细粒棘球蚴基因组dna，不能检测出多房棘球蚴、鼠绦虫、裂头蚴广州分离株、裂头蚴河南分离株、日本血吸虫、广州管圆线虫基因组dna，表明该引物具有良好的特异性。

实施例3：第二对外引物、第二对内引物的特异性检测

以多房棘球蚴、细粒棘球蚴、鼠绦虫、裂头蚴广州分离株、裂头蚴河南分离株、日本血吸虫、广州管圆线虫基因组dna为模板，将各模板加入反应管中，并加入引物组f3-2，b3-2，fip-2，bip-2(外引物终浓度为5pmol，内引物终浓度为40pmol)，8ubst2.0dna聚合酶，1.5mmdntp，7.5mmmgso4和ddh2o，此外还要加入1μl浓度为25μm的syto13荧光染料，在伯乐的荧光定量pcr仪上进行反应，具体的反应程序为：65℃反应1.5h并收集荧光数据，95℃反应5min。

结果如图2所示，该引物组能同时检测到细粒棘球蚴和多房棘球蚴基因组dna，不能检测出鼠绦虫、裂头蚴广州分离株、裂头蚴河南分离株、日本血吸虫、广州管圆线虫基因组dna，表明该引物具有良好的特异性。

实施例4：第一对外引物、第一对内引物的灵敏性检测

将细粒棘球蚴基因组dna倍比稀释成1.6pg，160fg，16fg，1.6fg，0.16fg，0.016fg，0.0016fg并分别加入反应管中，管中还加入了引物f3-1，b3-1，fip-1，bip-1(外引物终浓度为5pmol，内引物终浓度为40pmol)，8ubst2.0dna聚合酶，1.5mmdntp，7.5mmmgso4和ddh2o，此外还要加入1μl浓度为25μm的syto13荧光染料，在伯乐的荧光定量pcr仪上进行反应，具体的反应程序为：65℃反应1.5h并收集荧光数据，95℃反应5min。

结果如图3所示，该引物和反应体系最低能检测到1.6fg的细粒棘球蚴基因组dna，具有良好的检测灵敏度。

实施例5：第二对外引物、第二对内引物的灵敏性检测

将多房棘球蚴基因组dna倍比稀释成140pg，14pg，1.4pg，140fg，14fg，1.4fg和0.14fg并分别加入反应管中，管中还加入了引物f3-2，b3-2，fip-2，bip-2(外引物终浓度为5pmol，内引物终浓度为40pmol)，8ubst2.0dna聚合酶，1.5mmdntp，7.5mmmgso4和ddh2o，此外还要加入1μl浓度为25μm的syto13荧光染料，在伯乐的荧光定量pcr仪上进行反应，具体的反应程序为：65℃反应1.5h并收集荧光数据，95℃反应5min。

结果如图4所示，该引物和反应体系最低能检测到1.4fg的多房棘球蚴基因组dna，具有良好的检测灵敏度。

实施例6：焦磷酸酶检测灵敏度的检测

将细粒棘球蚴基因组dna倍比稀释成160fg，16fg，1.6fg，0.16fg，并分别加入反应管中，管中还加入了引物f3-1，b3-1，fip-1，bip-1(外引物终浓度为5pmol，内引物终浓度为40pmol)，8ubst2.0dna聚合酶，1.5mmdntp，7.5mmmgso4和ddh2o，此外还要加入8u焦磷酸酶，在在63℃水浴中反应40分钟，然后将反应产物与反应管2中的4μl钼酸-酒石酸钾氧锑溶液(21mm钼酸，2mm酒石酸钾氧锑，5m硫酸)和106μl蒸馏水溶液，和反应管3中的2μl10％抗坏血酸和106μl双蒸水的溶液充分混合，若溶液变蓝则为阳性，若保持无色则为阴性。结果如图5所示，焦磷酸酶检测体系最低能检测到1.6fg细粒棘球蚴基因组dna。

序列表

<110>杭州医学院

西藏自治区疾病预防控制中心

中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心)

<120>环介导等温扩增检测并区分细粒棘球蚴和多房棘球蚴的引物组

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gcatgtgtgtgaatgcaagc20

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gggcaatcgcagtgaagt18

<210>3

<211>39

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aactacctccacagcacggcagcagatgcctacccatcc39

<210>4

<211>42

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

taagacatcggtgcgagcactctgccttcgttaggtggagat42

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

aaccaccaacctttcggtta20

<210>6

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

ggaatgggaaggtgatggc19

<210>7

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

gcagtgtagcgcgtggcacagccgaacgcgctaac35

<210>8

<211>39

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

gcaagccgccgcctcttctgatggtgaggtagtgttgca39

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