一种用于检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13系统及其试剂盒和方法与流程

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种用于检测新型冠状病毒的crispr-cas13系统及其试剂盒和方法。

背景技术：

现已证实，新型冠状病毒属于β属冠状病毒，具有独特的刺突(spike)，其基因组序列(rna)与蝙蝠sars样病毒(bat-sl-covzc45)具85％以上的同源性。世界卫生组织已将该病毒(2019-ncov)引发的疾病命名为：covid-19(coronavirusdisease2019)。由于其传染性强及潜伏期长等特点，已成为严重威胁人们健康的传染性疾病。

世界卫生组织已将该病毒(2019-ncov)引发的疾病命名为：covid-19(coronavirusdisease2019)。目前临床，上以对covid-19的核酸检测阳性为确诊金标准(qrt-pcr法)，qrt-pcr法是通过设计新冠病毒基因组上特异的引物，检测病毒上特异片段的转录本的含量来确定的，这其中会因引物序列的非特异性、病毒样本核酸抽提的质量、检测试剂盒的质量、操作人员的实验操作等，同时对qrt-pcr运行结果解读的不同，而对最终的诊断结果产生不良影响，甚至导致错误诊断。

但据临床反应及研究报道，该检测方法阳性率为50％左右，因灵敏度和准确性有限，存在较高的假阴性率，且必须借助专业设备(实时荧光定量pcr仪)才能完成，所以当下急需开发一种便捷、快速、高效的新冠病毒检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的是为了提供一种针对新型冠状病毒的检测高效、灵敏度高、准确度高的crispr-cas13系统及其检测方法。

本发明的技术方案为：一种用于检测新型冠状病毒的crispr-cas13系统，包括crrna、cas13蛋白、探针，所述crrna是针对2019-ncov新型冠状病毒靶基因而设计的向导序列，序列如seqidno.1所示；所述cas13蛋白通过在crrna识别靶基因后，激活cas13蛋白的酶活性，并对所述探针进行切割，释放检测信号，探针的序列如seqidno.2所示，cas13蛋白的序列如seqidno.3所示。

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进一步地，所述靶基因为s基因及orflab基因。

进一步地，所述探针的5’端标记有荧光基团fam，3’端标记有猝灭基团tamra或bhq-1。

进一步地，所述cas13蛋白为lwcas13a蛋白。

本发明还提供了一种用于检测新型冠状病毒的crispr-cas13的试剂盒，包含所述的用于检测新型冠状病毒的crispr-cas13系统，以及rna提取试剂盒、rpa技术试剂盒、体外恒温rpa反转录试剂盒。rpa技术试剂盒购于苏州蚂蚁淘生物科技有限公司。rna提取试剂盒购买于闪晶分子生物有限公司，体外恒温rpa反转录试剂盒购买于北京明阳科华生物科技有限公司。

进一步地，所述试剂盒还包括胶体金免疫试纸条。

进一步地，使用了所述的系统或使用了所述的用于检测新型冠状病毒的crispr-cas13的试剂盒。

本发明还提供了一种用于检测新型冠状病毒的crispr-cas13的方法，包括以下步骤：

(1)采用rna提取试剂盒提取待测样本中2019-ncov的rna作为检测模板；

(2)采用rpa技术试剂盒对所述模板进行等温扩增放大，得到rpa扩增产物；

(3)采用体外恒温rpa反转录试剂盒将所述rpa扩增产物进行体外转录，得到转录产物；

(4)配制含有如下组分的crispr-cas13a检测体系：所述转录产物、权利要求1中的crrna、cas13蛋白、探针，以及ntp、rna聚合酶、rna酶抑制剂；

(5)基于cas13蛋白和crrna复合物对2019-ncov新型冠状病毒靶基因序列的特异性识别和切割的特性，检测所述crispr-cas13a检测体系的荧光基团，根据荧光基团的阳性信号进行检测，判断待检样品是否含有2019-ncov新型冠状病毒。

本发明的检测原理为：在crispr/cas13系统中，当向导rna搜索并结合到靶基因标序列时，会启动cas13蛋白的切割活性，而激活的casl3蛋白具有一一种旁氏效应，会继续无目的性地切割附近任意rna，利用这一效应，在cas13特异检测新冠病毒靶基因标序列时，加入序列两端标记有荧光基团和淬灭基团探针，cas13即可切割该rnareporter，释放出荧光基团和淬灭基团，再将这些荧光基团通过商业化的胶体金免疫试纸条富集起来，最后检测信号就会直观的输出在试纸条上。

本发明的有益效果为：本发明利用基因编辑系统的crispr/cas13系统的向导rna，可以精准识别2019-ncov中的包括s基因及orflab基因的特异性rna序列并启动cas13酶活性，识别并切割病毒特征rna，同时非特异性切割带有荧光基团的探针，荧光基团通过商业化的胶体金免疫试纸条富集起来，最后检测信号就会直观的输出在试纸条上，用来快速推断咽拭子样本中是否有2019-ncov,的存在。本发明检测方法的灵敏度高，最低检测限可达到每微升10个拷贝数的病毒，此外，该检测方法所用的检测时间也将大大减少，提取核酸样本后，在1小时内即可完成检测。因而相比qrt-pcr技术，该方法简便易行，有望提高灵敏度、降低假阴性率，为新型冠状病毒快速准确检测提供一种新方法。

附图说明

图1是本发明荧光定量pcr灵敏度实验结果图；其中，以ct值为纵坐标，拷贝数为横坐标，1为1x10⁰copies/μl；2为1x10¹copies/μl；3为1x10²copies/μl；4为1x10³copies/μl；5为1x10⁴copies/μl；6为1x10⁵copies/μl；7为1x10⁶copies/μl；8为1x10⁷copies/μl；9为1x10⁸copies/μl；

图2为本发明荧光定量pcr标准曲线图；其中，标准曲线方程为：y＝15.683x^0.0428；r²＝0.9963。

具体实施方式

除非另有说明，本发明的实施例将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。

实施例1

本实施例提供一种用于检测新型冠状病毒的crispr-cas13系统，包括crrna、cas13蛋白、探针，所述crrna是针对2019-ncov新型冠状病毒靶基因(s基因及orflab基因)而设计的向导序列，序列如seqidno.1所示；所述cas13蛋白通过在crrna识别靶基因后，激活cas13蛋白的酶活性，并对所述探针进行切割，释放检测信号，所述cas13蛋白为lwcas13a蛋白。所述探针的5’端标记有荧光基团fam，3’端标记有猝灭基团tamra或bhq-1。探针的序列如seqidno.2所示，cas13蛋白的序列如seqidno.3所示。

seqidno.1：

gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacuacacuacgugcccgccgaggagaauua

seqidno.2：rnareporter5'-fitc-mauuuuucmauuuuuc-3'-bio

seqidno.3：

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本实施例还提供了一种用于检测新型冠状病毒的crispr-cas13的试剂盒，包含所述的用于检测新型冠状病毒的crispr-cas13系统，以及rna提取试剂盒、rpa技术试剂盒、体外恒温rpa反转录试剂盒。rpa技术试剂盒购于苏州蚂蚁淘生物科技有限公司。rna提取试剂盒购买于闪晶分子生物有限公司，体外恒温rpa反转录试剂盒购买于北京明阳科华生物科技有限公司。

本实施例一种用于检测新型冠状病毒的crispr-cas13的方法，包括以下步骤：

(1)采用rna提取试剂盒提取待测样本中2019-ncov的rna作为检测模板；

(2)采用rpa技术试剂盒对所述模板进行等温扩增放大，得到rpa扩增产物；

(3)采用体外恒温rpa反转录试剂盒将所述rpa扩增产物进行体外转录，得到转录产物；

(4)配制含有如下组分的crispr-cas13a检测体系：30μl所述转录产物、2μlcrrna、2μlcas13蛋白、2μl探针，以及2mmntp、2μlrna聚合酶、2μlrna酶抑制剂，无菌水补充至50μl；

(5)基于cas13蛋白和crrna复合物对2019-ncov新型冠状病毒靶基因序列的特异性识别和切割的特性，检测所述crispr-cas13a检测体系的荧光基团，根据荧光基团的阳性信号进行检测，判断待检样品是否含有2019-ncov新型冠状病毒。检测方法为：将经cas13蛋白和crrna复合物对2019-ncov新型冠状病毒靶基因序列的特异性识别和切割后的产物放置在胶体金免疫试纸条的检测端如果观测试纸条出现条带即为阳性。质量控制标准：质控线t出现红色试纸条有效。检测线c出现红色，是阳性，反之是阴性的判别的标准。结果判定标准为：t线出现红色的线，同时c线出现红色的线，说明被检样品为阳性；t线出现红色的线，同时c线没有出现红色的线，说明被检样品为阴性；t线没有出现红色的线，说明试纸条失效。

实施例2：特异性验证

1、样品的准备：以含有目的扩增区域的假病毒作为2019-ncov新型冠状病毒的阳性对照，以sars冠状病毒、流感病毒a型，流感病毒b型、流感病毒c型病毒、冠状病毒229e、偏肺病毒hmp作为特异性特异性参考对照，以无菌生理盐水作为阴性对照，分别提取上述阳性对照和特异性参考对照的rna，阴性对照待用。

2、样本的采集：又临床医师根据实际情况金西行样本采集，可检测的样本包括鼻/咽拭子/全血/血清。采集的样本按照常规要求处理后，密封保存并低温送检。

3、取阴性对照、特异性参考对照、阳性对照各5μl，按照实施例1的检测方法进行检测，将经cas13蛋白和crrna复合物对2019-ncov新型冠状病毒靶基因序列的特异性识别和切割后的产物放置在胶体金免疫试纸条的检测端，胶体金免疫试纸条采用进口fitc(fam)及bio修饰基团对应的抗体标记胶体金试纸条，按试纸条操作说明，加入配套的缓冲液80μl于上述切割反应的1.5ml离心管中，室温下插入试纸条反应，5min内观察结果并拍照。如果观测试纸条出现条带即为阳性，反之为阴性，结果表明，阳性对照测试结果为阳性，阴性对照和特异性参考对照的检测结果均为阴性。说明由本发明的系统和试剂盒具有良好的特异性。

实施例3：灵敏度检测

分别由浓度为1.0×10⁸copies/ml、1.0×10⁷copies/ml、1.0×10⁶copies/ml、1.0×10⁵copies/ml、1.0×10⁴copies/mll、1.0×10³copies/ml、1.0×10²copies/m、1.0×10¹copies/ml、1.0×10⁰copies/ml的2019-ncov新型冠状病毒阳性标准质粒，每个梯度设置3个重复，按照实施例1的方法分别检测这9份样本，进行荧光定量pcr反应，进行该产品的敏感性实验。结果如图1所示，该方法可以有效检测出10拷贝的样本，当样本浓度大于10copies/μl时均能出现明显的扩增。然后以ct值为纵坐标，拷贝数为横坐标，建立标准曲线，标准曲线方程为：y＝15.683x^0.0428；r²＝0.9963，标准曲线如图2所示。

序列表

<110>贵州医科大学

<120>一种用于检测新型冠状病毒的crispr-cas13系统及其试剂盒和方法

<130>无

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>64

<212>rna

<213>人工序列

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<222>(1)..(64)

<223>根据实验要求而设计，用于检测新型冠状病毒的crispr-cas13系统的向导crrna

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<210>2

<211>14

<212>rna

<213>人工序列

<221>misc_feature

<222>(1)..(14)

<223>根据实验要求而设计，用于检测新型冠状病毒的crispr-cas13系统的探针

<400>2

auuuuucauuuuuc14

<210>3

<211>1152

<212>prt

<213>人工序列

<221>lipid

<222>(1)..(1152)

<223>根据实验要求而设计，用于检测新型冠状病毒的crispr-cas13系统的cas13蛋白

<400>3

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