一种基于实时荧光RT-PCR的新型冠状病毒核酸快速检测方法与流程

本发明涉及新型冠状病毒肺炎（covid-19）核酸检测技术领域，具体涉及一种在同一pcr反应管中同时检测新型冠状病毒（sars-cov-2）的orf1ab、e基因及n基因的逆转录-实时荧光定量pcr（rt-pcr）检测方法。

背景技术：

sars-cov-2是一种由包膜包被的单股正链rna病毒，其基因序列与蝙蝠冠状病毒一致性高达96%，在分类学上sars-cov-2与高致病的严重急性呼吸综合症人冠状病毒（sars-cov）、中东呼吸综合征冠状病毒（mers-cov）同属β-冠状病毒。

疫情初期，在疫苗和抗病毒药物匮乏的情况下，早期诊断和隔离成为治疗covid-19患者和控制疫情传播的有效措施。至今，sars-cov-2核酸检测仍是covid-19诊断的金标准。根据我国《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第八版）》的要求，对covid-19疑似病例的确诊需满足实时荧光rt-pcr检测sars-cov-2核酸阳性，或通过基因测序，与已知的sars-cov-2高度同源；治愈者出院需满足连续两次呼吸道标本核酸检测阴性。与基因测序法相比，实时荧光rt-pcr检测快速、灵敏度高、成本低，而且根据标准曲线可以对患者体内的病毒进行相对定量，从而有助于监视疾病进程，帮助临床医生制定合理的治疗方案。基于上述优势，实时荧光rt-pcr方法仍被作为当前检测sars-cov-2的金标准。

自新冠疫情发生以来，大量的应急试剂盒被研发，截至2020年7月13日，国家药品监督管理局已批准了16个sars-cov-2核酸检测（荧光pcr法）试剂盒。基于sars-cov-2的基因序列与其他高致病冠状病毒高度相似，我国临床诊断优先推荐使用能同时检测sars-cov-2开放读码框1ab（orf1ab）和核壳蛋白（n）基因区域的实时荧光rt-pcr试剂盒。然而，目前的新冠病毒核酸检测试剂盒几乎都是单基因单管检测，因此需要消耗大量的试剂，导致检测成本高。另外，临床上一些假阴性结果使得实时荧光rt-pcr的检测准确性备受质疑。多项研究表明，对不同的sars-cov-2核酸检测试剂盒的检测性能进行比较分析发现，不同厂家的病毒核酸检测试剂对弱阳性样品的检测能力有差异，部分试剂的准确性、灵敏度及重复性欠佳。此外，较长的检测时间也限制了实时荧光rt-pcr对疑似人群的大规模筛查。

因此，优化和改善实时荧光rt-pcr检测方法对于更好地大规模筛查疑似患者和控制疫情非常重要。

技术实现要素：

鉴于现有技术的上述缺陷，本发明目的在于提供一种在同一pcr反应管中同时检测sars-cov-2的orf1ab、e基因及n基因的核酸检测方法，该检测方法简单、快速、通量多、成本低，同时该方法能保证检测的灵敏度和准确性，易于大规模推广。

为实现上述目的，本发明提供了一种利用一步实时荧光rt-pcr法对sars-cov-2的orf1ab、e以及n基因在同一pcr反应管中同时检测，所述方法包括以下步骤：

（1）参考中国疾控预防控制中心（zhun,etal.,nengljmed.2020,382,727-733）和corman等（cormanvm,etal.,eurosurveil.2020,25.）公布的sars-cov-2核酸检测引物和探针序列，制备针对sars-cov-2的orf1ab基因、e基因及n基因的特异性引物和探针。引物和探针序列见表1：

。

探针的5’端和3’端分别修饰有荧光报告基团和淬灭基团，5’端的荧光报告基团分别选择fam、hex、rox及cy5中的任意三种，3’端的淬灭基团为bhq1或bhq2。

（2）提取人咽拭子、痰液或肺泡灌洗液等样本中的rna。

（3）配制一步法的实时荧光rt-pcr反应体系，建立sars-cov-2三重基因检测体系，使用步骤（1）所述的引物/探针对，以步骤（2）制备的rna模板进行一步法的实时荧光rt-pcr扩增反应。一步法的实时荧光rt-pcr反应体系包括1xpcr缓冲液、三对引物/探针（200~400nm引物和200nm探针）、逆转录酶、taqdna聚合酶、rna以及depc水。

（4）对步骤（3）配制的rt-pcr反应体系在实时荧光定量pcr仪上进行扩增检测，其反应条件是42℃逆转录反应5分钟，95℃变性10秒，40个循环95℃变性5秒，60℃反应30秒，并且在40个循环中的60℃阶段同时检测探针的三种荧光信号。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：

（1）本发明提供了一种在同一pcr反应管中同时检测sars-cov-2的orf1ab、e基因及n基因的实时荧光rt-pcr核酸检测方法，检测通量多，极大地降低了检测成本。

（2）本发明提供的检测方法操作方便，流程简单，只需要将样品提取的rna进行实时荧光rt-pcr检测即可。

（3）采用优化的一步法的实时荧光rt-pcr方法，使得提取的病毒rna在1小时即可完成核酸检测，满足临床快速检测需求。

（4）本发明提供的检测方法灵敏度高（可检测出5拷贝病毒rna）、准确性好，检测结果稳定性好、重复性好，具有重要的应用潜力。

附图说明

图1为实施例1检测含sars-cov-2样品检测曲线图。

图2为实施例1检测不含sars-cov-2样品检测曲线图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

所用引物和探针均由上海百利格生物技术有限公司合成，rt-pcr试剂均购自takara公司。

实施例1：

（1）取200μl咽拭子样品，使用takaraminibestviralrna/dnaextractionkitver.5.0提取样品中的rna，具体步骤按试剂盒操作说明。

（2）配制25μl的rt-pcr反应体系，该体系包括1xpcr缓冲液、三对引物/探针（见表2）、0.5μl逆转录酶primerscriptrtenzymemix、0.5μldna聚合酶takaraextaqhs(5u/μl)、5μl步骤（1）提取的rna以及depc水

。

（3）采用stratagenemx3000p实时pcr扩增仪（agilent公司）对步骤（2）配制的rt-pcr反应体系按照表3进行扩增检测，并且在40个循环中的60℃（表3步骤3）阶段同时检测fam、hex及rox荧光信号。结果判断：根据荧光pcr仪显示的ct值判断结果。附图1为实施例检测含sars-cov-2样品的检测曲线图，附图2为实施例检测不含sars-cov-2样品的检测曲线图

。

实施例2：

（1）取100μl咽拭子样品，使用takaraminibestviralrna/dnaextractionkitver.5.0提取样品中的rna，具体步骤按试剂盒操作说明。

（2）配制25μl的rt-pcr反应体系，该体系包括1xpcr缓冲液、三对引物/探针（见表4）、0.5μl逆转录酶primerscriptrtenzymemix、0.5μldna聚合酶takaraextaqhs(5u/μl)、6μl步骤（1）提取的rna以及depc水

。

（3）采用stratagenemx3000p实时pcr扩增仪对步骤（2）配制的rt-pcr反应体系按照表3进行扩增检测，并且在40个循环中的60℃（表3步骤3）阶段同时检测fam、hex及rox荧光信号。结果判断：根据荧光pcr仪显示的ct值判断结果。

实施例3：

（1）取200μl咽拭子样品，使用takaraminibestviralrna/dnaextractionkitver.5.0提取样品中的rna，具体步骤按试剂盒操作说明。

（2）配制20μl的rt-pcr反应体系，该体系包括1xpcr缓冲液、三对引物/探针（见表5）、0.5μl逆转录酶primerscriptrtenzymemix、0.5μldna聚合酶takaraextaqhs(5u/μl)、5μl步骤1提取的rna以及depc水

。

（3）采用stratagenemx3000p实时pcr扩增仪对步骤（2）配制的rt-pcr反应体系按照表3进行扩增检测，并且在40个循环中的60℃（表3步骤3）阶段同时检测fam、hex及cy5荧光信号。结果判断：根据荧光pcr仪显示的ct值判断结果。

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<110>上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司

<120>一种基于实时荧光rt-pcr的新型冠状病毒核酸快速检测方法

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