一种同时检测BK病毒和人巨细胞病毒的试剂盒及其检测方法与流程

2021-02-02 17:02:21|

415|

起点商标网

本发明属于病毒检测试剂盒技术领域，涉及实时荧光rt-pcr检测试剂盒，特别是涉及一种同时检测bk病毒和人巨细胞病毒的试剂盒及其检测方法。

背景技术：

人多瘤病毒bk型(humanpolymavirustypebk)(bk病毒)是具有大约5300bp的无囊膜的环状双链dna病毒，与jc病毒(jcvirus,jcv)、sv40病毒同属于多瘤病毒家族，是多瘤病毒属的一个亚群，以人为自然宿主，bk病毒人群感染率高达90％，但有临床症状者常限于免疫功能缺陷的个体。bk病毒跟下列疾病相关：出血性膀胱炎、间质性肾小球肾炎、输尿管狭窄、血管病变、肺炎、脑炎、视网膜炎甚至多器官功能衰竭。多瘤病毒相关性肾病(pvan)在肾移植受者人群中发病率约5％，在这些发病人群中约有50％一70％发生移植物功能丢失，主要是由移植肾中bk病毒的激活感染所致。

人类巨细胞病毒(hcmv)是一种广泛感染人类的β-疱疹病毒。虽然一般成人感染hcmv后无症状或症状较轻，但是孕妇感染后常造成流产、死胎、胎儿畸形和发育迟缓等严重后果，而在免疫功能受到抑制的个体(如器官移植受者)中，hcmv常引起致死性感染。因此早期、快速、准确地诊断hcmv活动性感染具有重要意义。

机会性感染是指一些致病力较弱的病原体，在人体免疫功能正常时不能致病，但当人体免疫功能降低时，它们乘虚而入，侵入人体内，导致各种疾病。上述两种病毒都属于dna病毒，常会引发机会性感染，而且会出现在同一宿主中共存的现象。为了较好地指导对上述两种病毒的研究，需要开发一种能够检测bk病毒和人巨细胞病毒产品。pcr的出现，极大的增加了检测手段的敏感性，然而，传统的检测方法或检测产品单次只能检测一种病毒类型。多重pcr(multiplexpcr，m-pcr)是指在同一个反应体系中，加入多对特异性引物，如果存在与各引物对特异性互补的模板，即可同时在一个反应管中扩增出一条以上的目的dna片段，实现了一次性检测多种病原体的目的。然而，由于多重pcr是在同一pcr反应体系里加入多对引物以扩增多个dna片段的pcr反应，因此同一反应体系中的多对引物易发生相互作用，如形成发卡结构，二聚体结构等，引物对和引物量越多，引物之间的相互作用越明显，从而影响pcr扩增效率，进而影响了多重pcr的广泛应用。本发明致力于开发出可靠的诊断试剂，以便在同一反应中以高灵敏度来检测bk病毒和人巨细胞病毒。

技术实现要素：

为了解决现有技术中无法同时检测bk病毒和人巨细胞病毒的问题，本发明提供了基于荧光定量pcr技术的bk病毒和人巨细胞病毒核酸的检测引物和探针，以实现快速、有效且准确检测bk病毒和/或人巨细胞病毒。

本发明另一个目的是提供一种检测bk病毒和人巨细胞病毒的二重荧光定量试剂盒，是一种一步法二重实时荧光定量rt-pcr检测试剂盒。

本发明再一个目的是提供上述试剂盒在制备检测bk病毒和人巨细胞病毒的试剂中的应用。

本发明第四个目的是提供上述试剂盒的使用方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，提供bk病毒和人巨细胞病毒核酸的检测引物和荧光探针，包括2种病毒基因的特异性扩增引物序列以及与该引物相应的特异性荧光探针序列，荧光探针序列的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，具体序列如下：

bk病毒：

bk上游引物：核苷酸序列如seqidno:1所示，

bk下游引物:核苷酸序列如seqidno:2所示，

bk特异性荧光探针:核苷酸序列如seqidno:3所示，

人巨细胞病毒：

cmv上游引物：核苷酸序列如seqidno:4所示，

cmv下游引物:核苷酸序列如seqidno:5所示，

cmv特异性荧光探针:核苷酸序列如seqidno:6所示。

表1bk病毒和人巨细胞病毒核酸的检测引物和荧光探针的序列

作为优选方案，以上所述bk病毒特异性荧光探针和人巨细胞病毒特异性荧光探针上带有的荧光报告基团选自6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，6-fam)、六氯-6-甲基荧光素(hexachloro-6-methylfluorescein，hex)、vic荧光染料、四氯-6-羧基荧光素(tetrachloro-6-carboxyfluorescein，tet)、羧基-x-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明(6-carboxytetramethylrhodamine，tamra)、磺酰罗丹明(sμlforhodamine101，texasred)、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯(6-carboxy-4’,5’-dichloro-2’,7’-dimethoxyfluorescein，joe)、花菁3(cyanine3，cy3)、花菁3.5(cyanine3.5，cy3.5)、花菁5(cyanine5，cy5)和花菁5.5(cyanine5.5，cy5.5)中的至少一种；所述bk病毒特异性探针和人巨细胞病毒特异性探针上带有的荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1(blackholequencher1，bhq1)、黑洞淬灭剂2(blackholequencher2，bhq2)或黑洞淬灭剂3(blackholequencher3，bhq3)中的至少一种。

作为优选方案，以上所述bk病毒特异性荧光探针和人巨细胞病毒特异性荧光探针上带有的荧光报告基团，所述荧光报告基团选自6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，6-fam)或六氯-6-甲基荧光素(hexachloro-6-methylfluorescein，hex)；所述荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂1(blackholequencher1，bhq1)。

最优选的,bk病毒特异性荧光探针的荧光报告基团为六氯-6-甲基荧光素(hexachloro-6-methylfluorescein，hex)，荧光淬灭基团为bhq1；人巨细胞病毒特异性荧光探针的荧光报告基团为6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，6-fam)，荧光淬灭基团为bhq1。

第二方面，本发明提供一种在同一反应中检测bk病毒和人巨细胞病毒核酸的试剂盒，包括以上任一所述的两种病毒的检测引物和荧光探针，所述bk病毒特异性荧光探针、人巨细胞病毒特异性荧光探针上分别带有不同的荧光报告基团。

作为优选，上述在同一反应中检测bk病毒和人巨细胞病毒核酸的试剂盒，在使用时按以下比例配制引物、荧光探针混合液：bk病毒扩增引物对与bk病毒特异性荧光探针的摩尔比为3:1，人巨细胞病毒扩增引物对与人巨细胞病毒特异性荧光探针的摩尔比为2:1，bk病毒特异性荧光探针、人巨细胞病毒特异性荧光探针的摩尔比为2:1。

作为优选，上述同时检测bk病毒和人巨细胞病毒核酸的试剂盒，还包括阳性对照品和阴性对照品，其中阴性对照品不含有bk病毒和人巨细胞病毒的生理盐水溶液，需要说明的是，阴性对照也可以为不含有bk病毒基因和人巨细胞病毒基因的生理盐水溶液；阳性对照品包括含有由如seqidno.1及seqidno.2所示序列扩增获得的bk病毒靶序列的质粒(命名为bk病毒阳性对照品)、含有由如seqidno.4及seqidno.5所示序列扩增获得的人巨细胞病毒靶序列的质粒(命名为人巨细胞病毒阳性对照品)。

具体地，阳性对照品的制备过程如下：分别提取bk病毒和人巨细胞病毒的dna作为模板，分别用相应的引物将相应的靶序列进行扩增；将扩增产物连入载体中，分别获得含有bk病毒靶序列的质粒、含有人巨细胞病毒靶序列的质粒，所述载体为puc57-kan载体。

在一个具体示例中，阳性对照品的制备过程如下：分别以bk病毒的dna片段、人巨细胞病毒的dna片段为模板，分别用相应的引物将相应的dna片段进行扩增；将扩增产物连入载体中，分别获得含有bk病毒扩增片段的质粒、含有人巨细胞病毒扩增片段的质粒即为bk病毒阳性对照品和人巨细胞病毒阳性对照品。

在其中一个实施例中，阴性对照为不含有bk病毒和人巨细胞病毒的生理盐水溶液。需要说明的是，阴性对照也可以为不含有bk病毒基因和人巨细胞病毒基因的生理盐水溶液。

作为优选，上述同时检测bk病毒和人巨细胞病毒的试剂盒，还包括病毒基因组dna提取试剂、dntps、pcr反应液、酶，所述pcr反应液包括220mm～280mm的tris-base、质量百分含量为0.2％～0.3％的tritonx-100和20mmol/l～30mmol/l的mgcl2；所述酶为taq酶。

更为优选，上述同时检测bk病毒和人巨细胞病毒的试剂盒，pcr反应液包括250mm的tris-base、质量百分含量为0.25％的tritonx-100和25mmol/l的mgcl2。

第三方面，提供上述在同一反应中检测bk病毒和人巨细胞病毒的试剂盒在制备检测bk病毒和人巨细胞病毒的试剂中的应用。

第四方面，提供一种在同一反应中检测bk病毒和人巨细胞病毒的检测方法，此检测方法是非诊断非治疗目的，该方法使用上述任一在同一反应中检测bk病毒和人巨细胞病毒的试剂盒进行检测，包括以下步骤：

以待测样品dna为模板，加入上述在同一反应中检测bk病毒和人巨细胞病毒的试剂盒中的各组分进行多重荧光定量pcr扩增反应，根据反应结果进行检测分析，如果各检测通道都没有出现s型扩增曲线，判为两种病毒均为阴性；如果检测通道出现s型扩增曲线，ct值≤38，则对应的病毒判定为阳性。

作为优选，上述在同一反应中检测bk病毒和人巨细胞病毒的检测方法中多重荧光定量pcr扩增反应的反应体系(25μl总体系，以下均同)包括：5mm的dntps、5μl的pcr反应液、0.3μmol的bk病毒扩增引物对、0.3μmol的人巨细胞病毒扩增引物对、0.1μmol的bk病毒特异性探针、0.1μmol的人巨细胞病毒特异性探针、1μl的酶及0.5μl～5μl的待测样本dna。

作为优选，上述在同一反应中检测bk病毒和人巨细胞病毒的检测方法中多重荧光定量pcr扩增反应的反应条件为：93℃～95℃预变性2min～10min；93℃～95℃变性10s～30s，55℃～60℃退火、延伸、信号采集30s～60s，循环40次～45次。

上述多重荧光定量pcr扩增反应在多重荧光定量pcr仪中进行。进一步地，多重荧光定量pcr仪为abi系列多重荧光定量pcr仪、bio-rad系列(icycler/mjopticon2)多重荧光定量pcr仪、stratagenemx系列多重荧光定量pcr仪、rochelightcycler多重荧光定量pcr仪、ccpheidsmartcycler多重荧光定量pcr仪、corbettrortor-gene多重荧光定量pcr仪、杭州博日系列多重荧光定量pcr仪。需要说明的是，多重荧光定量pcr仪不限于上述指出的pcr仪，其他多重荧光定量pcr仪也能够用于本发明中。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

1、本发明针对bk病毒和人巨细胞病毒设计的检测引物对相互配合，能够避免各引物之间的相互干扰，通过多重荧光定量pcr实现在一管标本同时检测bk病毒和人巨细胞病毒，节省检测时间，只需操作一次，减少了污染产生的机会。

2、利用本发明试剂盒的检测方法灵敏度高，两种病毒的检测灵敏度均达到10copies/ml。同时，本发明的检测方法的特异性很好，不和其他病毒发生交叉反应，例如腺病毒、ca16型柯萨奇病毒。

3、本发明试剂盒的扩增重复性非常好，计算获得精密度均≤2.8％。

附图说明

图1为实施例2中不同浓度的阳性待测品的扩增曲线图；

图2为实施例2中不同浓度阳性待测品的bk病毒的fam通道的扩增曲线图；

图3为实施例2中不同浓度阳性待测品的巨细胞病毒的vic通道的扩增曲线图；

图4为实施例3中实验组的阳性待测样品的扩增曲线图；

图5为实施例3中对照组的阳性待测样品的扩增曲线图；

图6为实施例4中精密度待测品重复性检测的扩增曲线图；

图7为实施例4中精密度待测品的bk病毒重复性检测的fam通道的扩增曲线图；

图8为实施例4中精密度待测品的巨细胞病毒重复性检测的vic通道的扩增曲线图；

图9为实施例5中阳性待测品的扩增曲线图；

图10为实施例5中阴性待测品的扩增曲线图；

图11为实施例5中待测样品的扩增曲线图；

具体实施方式

下文将结合具体实施例和附图对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

【实施例1】提供一种在同一反应中检测bk病毒和人巨细胞病毒的试剂盒。

试剂盒包括pcr反应液、同时检测bk病毒和人巨细胞病毒的核酸组合物、热启动taq酶、阳性对照和阴性对照。其中，pcr反应液包括250mm的tris-base、质量百分含量为0.25％的tritonx-100、25mmol/l的mgcl2。

其中核酸组合物包括：

序列如seqidno.1及seqidno.2所示的bk病毒扩增引物对；

序列如seqidno.4及seqidno.5所示的人巨细胞病毒扩增引物对；

序列如seqidno.3所示的bk病毒特异性荧光探针，bk病毒特异性荧光探针的两端分别连接有fam和bhq1；序列如seqidno.6所示的人巨细胞病毒特异性荧光探针，人巨细胞病毒特异性荧光探针的两端分别连接有vic和bhq1。

阳性对照品包括含有bk病毒靶序列的质粒和含有人巨细胞病毒靶序列的质粒。

bk病毒靶序列质粒的构建方法：采用pcr法对bk病毒的核酸样本进行扩增，pcr引物序列如seqidno：1-2所示。将扩增的片段纯化后，将扩增产物连入puc57-kan载体中，经测序鉴定，测序结果正确的重组载体转化入dh5α，扩增，然后提取质粒获得bk病毒阳性对照品。

人巨细胞病毒靶序列质粒的构建方法：采用pcr法对人巨细胞病毒的核酸样本进行扩增，pcr引物序列如seqidno：4-5所示。将扩增的片段纯化后，将扩增产物连入puc57-kan载体中，经测序鉴定，测序结果正确的重组载体转化入dh5α，扩增，然后提取质粒获得人巨细胞病毒阳性对照品。

阴性对照为不含有bk病毒和人巨细胞病毒的生理盐水溶液。

【实施例2】测定实施例1的试剂盒在同一反应中检测bk病毒和人巨细胞病毒的灵敏度

(1)将实施例1的试剂盒中bk病毒阳性对照品、人巨细胞病毒阳性对照品混合并配成混合液，得到阳性待测品(每种病毒阳性对照品的浓度均为10⁶copies/ml)。

(2)对阳性待测品进行10倍梯度稀释(即10copies/ml～10⁵copies/ml)，采用实施例1的试剂盒对各梯度下的阳性待测品进行双重荧光定量pcr检测，双重荧光定量pcr反应的体系如表2所示。双重荧光定量pcr反应的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火、延伸、信号采集40s，循环40次。

(3)结果分析：通过荧光扩增曲线图和ct值的大小来判断检测结果的阴阳性，确定样品中是否含有bk病毒、人巨细胞病毒。具体地，当扩增曲线图ct值≤38，并扩增曲线呈现明显指数增长(即s型)时，结果表现为阳性；当扩增曲线图ct值>38或无ct值，结果表现为阴性。检测结果如图1～3所示。其中，图1为实施例2中不同浓度的阳性待测品的扩增曲线图。图2为实施例2中不同浓度阳性待测品的bk病毒的fam通道的扩增曲线图，图2中箭头(2-1)、箭头(2-2)、箭头(2-3)、箭头(2-4)、箭头(2-5)所指的曲线分别对应浓度为10⁵copies/ml、10⁴copies/ml、10³copies/ml、10²copies/ml、10copies/ml下的扩增曲线。图3为实施例2中不同浓度阳性待测品的人巨细胞病毒的vic通道的扩增曲线图，图3中箭头(3-1)、箭头(3-2)、箭头(3-3)、箭头(3-4)、箭头(3-5)所指的曲线分别对应浓度为10⁵copies/ml、10⁴copies/ml、10³copies/ml、10²copies/ml、10copies/ml下的扩增曲线。

表2双重荧光定量pcr反应的体系

其中，反应体系中热启动taq酶。ddh2o即为双蒸水。反应体系中的所有试剂放在同一反应管中进行双重荧光定量pcr检测。从图1可以看出，实施例1的试剂盒能够同时一次性检测一份待测样品中的bk病毒和人巨细胞病毒，节省检测时间。

从图2～3可以看出，bk病毒、人巨细胞病毒在10copies/ml～10⁵copies/ml范围内的扩增曲线均呈良好的线性关系，两种病毒的检测灵敏度均达到10copies/ml，灵敏度较高。

【实施例3】实施例1的试剂盒与已知商品化的试剂盒的特异性比较

(1)将实施例1的试剂盒中bk病毒阳性对照品、人巨细胞病毒阳性对照品(每种病毒阳性对照品的浓度均为10⁶copies/ml)混合并配成混合液，得到阳性待测品；不含上述bk病毒和人巨细胞病毒阳性对照品的生理盐水为阴性待测品。

(2)实验分为实验组、对照组，实验组的试剂盒为实施例1的试剂盒。对照组的试剂盒与实施例1的试剂盒大致相同(对照组的试剂盒成分均为已知商品化的试剂盒的成分，即：dntps、pcr反应液、bk病毒和人巨细胞病毒的扩增引物和探针、酶液、阳性对照品、阴性标准品，其中bk病毒阳性对照品、人巨细胞病毒阳性对照品的dna区域包含对照组的试剂盒扩增引物针对的片段)。

(3)采用实验组的试剂盒、对照组的试剂盒对阳性待测品和阴性待测品均进行双重荧光定量pcr检测，反应体系、反应条件和结果分析与实施例2相同。检测结果如图4～5所示。其中，图4为实施例3中实验组的阳性待测样品的扩增曲线图，bk病毒的扩增曲线和人巨细胞病毒的扩增曲线。

从图4可以看出，实验组得到2条s型扩增曲线，同时阴性待测品无扩增曲线，说明实验组的试剂盒能够同时检测出阳性待测样品中的bk病毒和人巨细胞病毒，同时不会出现非特异性扩增曲线。

从图5可以看出，对照组得到一条s型扩增曲线，未能够扩增人巨细胞病毒阳性对照品，说明对照组的两对条引物和两条探针之间存在相互干扰，导致未能同时检测上述bk病毒和人巨细胞病毒。

【实施例4】实施例1的试剂盒精密度的测定

将实施例1的试剂盒中bk病毒阳性对照品、人巨细胞病毒阳性对照品混合并配成混合液，得到阳性待测品。将阳性待测品进行10倍梯度稀释(浓度梯度为10⁵copies/ml、10⁴copies/ml、10³copies/ml、10²copies/ml、10copies/ml)，得到精密度待测品，用实施例1所用的试剂盒进行双重荧光定量pcr扩增，扩增精密度待测品10个复孔，检测结果如图6～8所示。图6为实施例4中精密度待测品重复性检测的扩增曲线图。图7为实施例4中精密度待测品的bk病毒重复性检测的fam通道的扩增曲线图。图8为实施例4中精密度待测品的人巨细胞病毒重复性检测的vic通道的扩增曲线图。

从图6～8可以看出，上述实施方式的试剂盒各通道的精密度都非常好，导出ct值数据，计算获得精密度均≤2.8％，该试剂盒的扩增重复性非常好。

【实施例5】实施例1的试剂盒对临床样本的检测

(1)将实施例1的试剂盒中bk病毒阳性对照品和人巨细胞病毒阳性对照品混合并配成混合液，得到阳性对照，阳性对照的浓度为10⁵copies/ml。阴性对照为不含bk病毒基因和人巨细胞病毒基因的生理盐水。

(2)待提取样品共12例，分别为5例bk病毒样本，4例人巨细胞病毒样本，2例腺病毒样本和1例麻疹病毒样本，所有样本均来自于疾控中心。采用病毒dna提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)分别提取各待提取样品中的dna，得到相应的待测样品。

(3)采用实施例1的试剂盒对阳性对照、阴性对照及步骤(2)的各待测样品进行进行双重荧光定量pcr检测，反应体系、反应条件和结果分析与实施例2相同。测定结果如图9所示。图9为实施例5中阳性对照的扩增曲线图。图10为实施例5中阴性对照的扩增曲线图。图11为实施例5中待测样品的扩增曲线图。

从图9～11可以看出，实施例1的试剂盒能够检测出阳性对照中的两种病毒，阴性对照不检出，说明实施例1的试剂盒具有较高的特异性。

从图11可以看出，通过实施例1的试剂盒对待测样品进行检测，能够检出有5例bk病毒样本、4例人巨细胞病毒样本，腺病毒样本、ca16型柯萨奇病毒样本未检出，检测样本准确率达100％。综上所述，上述实施方式的同时检测bk病毒和人巨细胞病毒的试剂盒能够对一管标本同时检测bk病毒和人巨细胞病毒两个项目，检测时间短，检测的灵敏度高、准确度高、特异性好、重复性好，对临床应用具有较高的指导意义。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>珞可为科技（武汉）有限公司

<120>一种同时检测bk病毒和人巨细胞病毒的试剂盒及其检测方法

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggccacagggaggagctgcttt22