一种同时检测鸭甲肝病毒、鸭星状病毒和鸭呼肠孤病毒的引物探针组合、试剂盒的制作方法

本发明属于畜禽疾病诊断技术领域，尤其涉及一种同时检测鸭甲肝病毒、鸭星状病毒和鸭呼肠孤病毒的引物探针组合、试剂盒。

背景技术：

鸭甲肝病毒(duckhepatitisavirus,dhav)是引起雏鸭出现急性、高度致死性传染病的重要病原。临床上主要发生于1月龄以内的雏鸭，以肝脏肿大，质脆易碎，表面见有出血点和出血斑为主要特征。该病一年四季均有发生，不同品种雏鸭均可感染，以北京鸭、樱桃谷北京鸭、半番鸭等最易感，发病率在20％-70％左右，潜伏期断、发病急，一般在发病后2-3天达到死亡高峰，病死率30％～60％不等，其中2周龄以内死亡率高，而3周龄以上鸭死亡率相对较低。

鸭星状病毒(duckastrovirus，dastv)是引起鸭病毒性肝炎的重要病原之一，最早于1965年在英国的鸭肝炎病例中发现。鸭星状病毒感染可引起雏鸭呈现角弓反张、肝脏出血充血、肾脏肿大，鸭群病死率可达50％以上。近年来，尽管养鸭产业不断升级，集约化、规模化程度越来越高，鸭病毒性肝炎依然是严重威胁养鸭业健康发展的重要传染病之一。

鸭呼肠孤病毒(duckreovirus，drv)是引起雏鸭发生“肝白点病”或“花肝病”的病原，发病鸭临床上以肝脏不规则坏死和出血混杂、脾脏肿大斑块状坏死为主要特征的。发病率为30～90％，死亡率为10～30％。目前，呼肠孤病毒感染的宿主范围逐渐扩大，病毒所能感染鸭的品种呈增多的趋势，可感染番鸭、半番鸭、麻鸭、北京鸭等多个品种鸭，该病无明显季节性，同时鸭呼肠孤病毒感染所致的临床疫病呈现出多样性和复杂性。

鸭甲肝病毒、鸭星状病毒及鸭呼肠孤病毒这三种rna病毒在我国鸭群感染较普遍，感染后均可引起雏鸭出现肿大、坏死及出血等严重的肝脏损伤并导致死亡，是严重危害育雏鸭成活率和生长性能的传染病病原，发病时的临床特征和病理变化极为相似，容易混淆，易造成误诊，对养殖企业的市场竞争力和经济效益造成严重损失。鸭养殖生产过程中迫切需要一种能对引起雏鸭肝损伤病原进行快速检测的简便方法，以指导临床的疫病诊断和治疗方案制定，从而减少经济损失。目前已有检测鸭甲肝病毒、鸭星状病毒及鸭呼肠孤病毒的单一rt-pcr方法，但尚未见同时检测并鉴别这三种病毒的报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种同时检测鸭甲肝病毒、鸭星状病毒和鸭呼肠孤病毒的引物探针组合、试剂盒，采用本发明提供的引物探针组合能够同时检测出鸭甲肝病毒、鸭星状病毒和鸭呼肠孤病毒。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种同时检测鸭甲肝病毒、鸭星状病毒和鸭呼肠孤病毒的引物探针组合，包括引物对和探针，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述引物对的下游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示；

所述探针包括鸭甲肝病毒探针、鸭星状病毒探针和鸭呼肠孤病毒探针，所述鸭甲肝病毒探针的核苷酸序列如seqidno.3所示，所述鸭星状病毒探针的核苷酸序列如seqidno.4所示，所述鸭呼肠孤病毒探针的核苷酸序列如seqidno.5所示。

本发明还提供了一种同时检测鸭甲肝病毒、鸭星状病毒和鸭呼肠孤病毒的试剂盒，包括质粒标准品和上述技术方案所述的引物探针组合；所述质粒标准品包括鸭甲肝病毒vp1蛋白基因质粒、鸭星状病毒rna依赖的rna聚合酶基因质粒和鸭呼肠孤病毒σ蛋白基因质粒。

优选的，所述引物对的工作摩尔浓度为0.04～0.8μmol/l。

优选的，所述引物对的工作摩尔浓度为0.2μmol/l。

优选的，所述探针的工作摩尔浓度为0.04～0.4μmol/l。

优选的，所述鸭甲肝病毒探针、鸭星状病毒探针和鸭呼肠孤病毒探针的工作摩尔浓度比为2～4:1.5～3:1～2。

优选的，所述质粒标准品的浓度为2×10⁵copies/μl。

优选的，所述引物探针组合的使用方法包括：利用上述技术方案所述的引物探针组合对样品进行pcr扩增，经1％凝胶琼脂糖电泳后得到检测结果，当扩增出158bp的片段时，所述样品中含有鸭星状病毒；当扩增出322bp的片段时，所述样品中含有鸭呼肠孤病毒；当扩增出248bp的片段时，所述样品中含有鸭甲肝病毒。

优选的，所述pcr扩增的扩增体系每30μl包括以下组分含量：10×dna连接酶反应缓冲液3μl，dna连接酶1μl，10×taqdna聚合酶反应缓冲液3μl，taqdna聚合酶1μl，浓度为10mmol/l的dntps1μl，浓度为10μmol/l的探针3μl，浓度为10μmol/l的上下游引物各1μl，样品2μl，加去离子水补足至30μl。

优选的，所述pcr扩增的反应程序包括：95℃5min；进入循环95℃50s；55℃～63℃5～10min；循环6次后进入下一个变温循环95℃30s，52℃～56℃30s，72℃30s进行35个循环，循环结束后于72℃10min结束反应。

本发明提供了一种同时检测鸭甲肝病毒、鸭星状病毒和鸭呼肠孤病毒的引物探针组合，包括引物对和探针，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述引物对的下游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示；所述探针包括鸭甲肝病毒探针、鸭星状病毒探针和鸭呼肠孤病毒探针，所述鸭甲肝病毒探针的核苷酸序列如seqidno.3所示，所述鸭星状病毒探针的核苷酸序列如seqidno.4所示，所述鸭呼肠孤病毒探针的核苷酸序列如seqidno.5所示。

本发明的有益效果：

与检测鸭甲肝病毒的rt-pcr方法、检测鸭星状病毒的rt-pcr方法、检测鸭呼肠孤病毒的rt-pcr方法相比，本发明能在一个反应管和一次pcr反应中同时鉴别、检测三种病毒，减轻工作量并节省时间，达到快速检测病原的目的。目前还没有同时检测这三种可引起雏鸭肝损伤的病原的快速检测方法，与现有的检测鸭甲肝病毒、鸭星状病毒及鸭呼肠孤病毒相关的单一病原rt-pcr或荧光定量rt-pcr检测方法相比，本发明最大的优势在于在pcr扩增阶段，仅通过一对pcr扩增引物来检测三种病原，pcr扩增时引物数量的减少极大的保障了pcr扩增的准确性、特异性。这样最大限度的排除了引物间的相互干扰，避免了因多对引物混合后，引物间的自联而导致pcr扩增效率降低及非特异性扩增的现象。

附图说明

图1为鸭甲肝病毒rt-pcr检测结果，m为dna相对分子质量标准；1为鸭甲肝病毒样品；2为阴性对照；

图2为鸭星状病毒rt-pcr检测，m为dna相对分子质量标准；1为鸭星状病毒样品；2为阴性对照；

图3为鸭呼肠孤病毒rt-pcr检测，m为dna相对分子质量标准；1为鸭呼肠孤病毒样品；2为阴性对照；

图4为鸭甲肝病毒、鸭星状病毒及鸭呼肠孤病毒rt-pcr检测结果，m为dna相对分子质量标准；1为鸭甲肝病毒、鸭星状病毒、鸭呼肠孤病毒混合样品；2为鸭呼肠孤病毒样品；3为鸭甲肝病毒样品；4为鸭星状病毒样品；5为阴性对照。

具体实施方式

本发明提供了一种同时检测鸭甲肝病毒、鸭星状病毒和鸭呼肠孤病毒的引物探针组合，包括引物对和探针，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述引物对的下游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示；所述探针包括鸭甲肝病毒探针、鸭星状病毒探针和鸭呼肠孤病毒探针，所述鸭甲肝病毒探针的核苷酸序列如seqidno.3所示，所述鸭星状病毒探针的核苷酸序列如seqidno.4所示，所述鸭呼肠孤病毒探针的核苷酸序列如seqidno.5所示。

本发明优选基于鸭甲肝病毒vp1蛋白基因、鸭星状病毒rna依赖的rna聚合酶(rdrp)基因和鸭呼肠孤病毒σ蛋白基因保守序列及绿色荧光蛋白基因序列，设计合成分别针对鸭甲肝病毒、鸭星状病毒及鸭呼肠孤病毒的3条特异性探针和引物对。本发明设计的探针扩增引物3末端为绿色荧光蛋白基因序列，扩增获得的3个探针序列除了两端各20多个核苷酸为相应的病毒基因序列外，中间的序列均为绿色荧光蛋白基因序列。

在本发明中，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示，具体如下：

5’-cagcgtgcagctcgccgaccact-3’；

所述引物对的下游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示，具体如下：

5’-gttcaccttgatgccgttctt-3’。

在本发明中，所述探针包括鸭甲肝病毒探针、鸭星状病毒探针和鸭呼肠孤病毒探针，所述鸭甲肝病毒探针的核苷酸序列如seqidno.3所示，加粗的序列为编码绿色荧光蛋白的序列，具体如下：

所述鸭星状病毒探针的核苷酸序列如seqidno.4所示，加粗的序列为编码绿色荧光蛋白的序列，具体如下：

所述鸭呼肠孤病毒探针的核苷酸序列如seqidno.5所示，加粗的序列为编码绿色荧光蛋白的序列，具体如下：

本发明还提供了一种同时检测鸭甲肝病毒、鸭星状病毒和鸭呼肠孤病毒的试剂盒，包括质粒标准品和上述技术方案所述的引物探针组合；包括鸭甲肝病毒vp1蛋白基因质粒、鸭星状病毒rna依赖的rna聚合酶基因质粒和鸭呼肠孤病毒σ蛋白基因质粒。

在本发明中，所述质粒标准品的浓度优选为2×10⁵copies/μl。

在本发明中，所述引物对的工作摩尔浓度优选为0.04～0.8μmol/l，更优选为0.2μmol/l。

在本发明中，所述探针的工作摩尔浓度优选为0.04～0.4μmol/l。在本发明中，所述鸭甲肝病毒探针、鸭星状病毒探针和鸭呼肠孤病毒探针的工作摩尔浓度比优选为2～4:1.5～3:1～2。

在本发明中，所述引物探针组合的使用方法优选包括：利用上述技术方案所述的引物探针组合对样品进行pcr扩增，经1％凝胶琼脂糖电泳后得到检测结果，当扩增出158bp的片段时，所述样品中含有鸭星状病毒；当扩增出322bp的片段时，所述样品中含有鸭呼肠孤病毒；当扩增出248bp的片段时，所述样品中含有鸭甲肝病毒。

在本发明中，所述样品优选为临床上采集获得疑似含毒组织、棉拭子样品或含毒尿囊液等，应用商品化的病毒核酸(rna)提取试剂盒提取获得的核酸样品。该样品经反转录成cdna后，作为后续pcr检测的模板。

所述反转录体系为每20μl优选包括以下组分含量：5×反转录反应液4μl,反转录酶amv(5u/μl)1μl，rna酶抑制剂(40u/μl)1μl，浓度为的dntps(10mmol/l)1μl,随机6碱基反转录引物(10μmol/l)1μl，样品rna3μl，depc处理水补足至20μl。在本发明中，所述反转录的反应程序包括：25℃10min；45℃～50℃30min；85℃5min，4℃10min结束反应。反转录产物用于后续pcr扩增检测。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(1)杂交探针扩增引物的设计与制备

参照鸭甲肝病毒vp1蛋白基因、鸭星状病毒rna依赖的rna聚合酶(rdrp)及鸭呼肠孤病毒σ蛋白基因保守序列及绿色荧光蛋白基因序列，设计了3对用于合成分别针对鸭甲肝病毒、鸭星状病毒及鸭呼肠孤病毒核酸的3条特异性杂交探针和扩增引物，引物信息见表1，加粗的序列为编码绿色荧光蛋白的序列。以上引物送福州铂尚生物技术有限公司合成后，用无菌超纯水稀释成10μm的浓度，-20℃保存备用。

表1引物信息

(2)杂交探针制备与纯化

以绿色荧光蛋白质粒(pires2-egfp,takara生物技术有限公司)作为模板，分别用以上3对引物进行扩增。pcr反应体系为50μl：2xphantamaxsuper-fidelitybuffer25μl，dna聚合酶1μl(5u/μl)，dntp1μl(10mm)，上、下游引物(10μm)各1μl，模板2μl(100ng)，用去离子水补充体积至50μl。反应程序如下：94℃预变性15min，按95℃30s、55℃30s、72℃50s进行35个循环，最后72℃延伸10min结束反应，取5μl产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，扩增产物经纯化回收后即可作为病毒核酸特异性杂交探针。为验证这些探针的正确性，可将纯化回收探针克隆进平端克隆载体peasy-blunt，送生工上海生物工程有限公司进行测序，3种探针的序列分别如seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5所示。

实施例2

多病毒pcr检测方法的建立

1.杂交探针检测引物的设计与制备参照杂交探针中绿色荧光蛋白基因序列，设计1对用于检测该杂交探针扩增的反向扩增引物，上游引物为seqidno.1：5’-cagcgtgcagctcgccgaccact-3’；下游引物为seqidno.2：5’-gttcaccttgatgccgttctt-3’。应用这对引物进行检测时，鸭甲肝病毒应扩增出248bp的特异性片段、鸭星状病毒158bp的特异性片段和鸭呼肠孤病毒322bp的特异性片段。

2.检测样品核酸的制备取保存的鸭甲肝病毒、鸭星状病毒及鸭呼肠孤病毒，瞬时离心后，取200μl上清，用rna提取试剂盒(qiagen公司)分别提取三种病毒的基因组rna，参照试剂盒操作说明书进行。提取获得的rna样品按reversetranscriptionkit(invitrigen公司)操作说明书，用六碱基随机引物反转录获得cdna，作为下一步进行pcr扩增的模板。

鸭甲肝病毒pcr扩增取上述制备的鸭甲肝病毒基因组cdna样品、纯化的杂交探针(seqidno.3)及检测引物(seqidno.1和seqidno.2)进行pcr扩增。pcr反应体系为30μl：包括10×taqdna连接酶反应缓冲液3μl，taqdna连接酶0.5μl(5u/μl)，10×taqdna聚合酶反应缓冲液3μl(含mg²⁺)，taqdna聚合酶0.5μl(5u/μl)，dntps1μl(10mm)，检测引物各1μl(浓度10μmol/l)，杂交探针4pg，样品cdna200ng或2μlddh2o为空白对照，去离子水补足至30μl。反应程序如下：95℃15min；95℃30s，58℃7min循环6次；95℃30s，5330s，72℃30s进行35个循环，最后72℃10min结束反应。取产物5μl扩增产物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳观察扩增结果。空白对照无扩增产物，鸭甲肝病毒样品可扩增出248bp的片段(见图1)。

3.鸭星状病毒pcr扩增取制备鸭星状病毒cdna样品、杂交探针(seqidno.4)及检测引物(seqidno.1和seqidno.2)进行pcr扩增。pcr反应体系为30μl：包括3μltaqdna连接酶反应缓冲液，0.5μltaqdna连接酶，3μltaqdna聚合酶反应缓冲液，0.5μltaqdna聚合酶，1μldntps(10mm)，检测引物各1μl(浓度10μmol/l)，3pg杂交探针，样品cdna200ng或2μlddh2o为空白对照，去离子水补足至30μl。反应程序如下：95℃15min；95℃30s，58℃7min循环6次；95℃30s，5330s，72℃30s进行35个循环，最后72℃10min结束反应。取产物5μl扩增产物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳观察扩增结果。空白对照无扩增产物，鸭星状病毒样品可扩增出158bp的片段(见图2)。

4.鸭呼肠孤病毒pcr扩增取制备鸭呼肠孤病毒基因组cdna、杂交探针(seqidno.5)及检测引物(seqidno.1和seqidno.2)进行pcr扩增。反应体系为30μl，包括：3μl10×taqdna连接酶反应缓冲液，0.5μltaqdna连接酶(5u/μl)，3μl10×taqdna聚合酶反应缓冲液(含mg²⁺)，0.5μltaqdna聚合酶(5u/μl)，1μldntps(10mm)，检测引物各1μl(10mm)，杂交探针2pg，样品cdna2μl或2μlddh2o为空白对照，去离子水补足至30μl。反应程序为：95℃15min；95℃30s，58℃7min循环6次；95℃30s，5330s，72℃30s进行35个循环，最后72℃10min结束反应。取产物5μl扩增产物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳观察扩增结果。空白对照无扩增产物，鸭呼肠孤病毒样品可扩增出322bp的片段(见图3)。

5.鸭甲肝病毒、鸭星状病毒及鸭呼肠孤病毒的pcr扩增取上述制备的鸭甲肝病毒、鸭星状病毒及鸭呼肠孤病毒基因组cdna、杂交探针(seqidno.3-5)及检测引物(seqidno.1和seqidno.2)进行pcr扩增。pcr反应体系为30μl：包括3μltaqdna连接酶反应缓冲液，0.5μltaqdna连接酶，3μltaqdna聚合酶反应缓冲液，0.5μltaqdna聚合酶，1μldntps(10mm)，检测引物各1μl(10mm)，三种杂交探针seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5分别取4pg、3pg和2pg，三种病毒基因组cdna核酸样品各2μl或鸭甲肝病毒、鸭星状病毒及鸭呼肠孤病毒基因组cdna单独一种cdna样品2μl或6μlddh2o为空白对照，去离子水补足至30μl。反应程序如下：95℃15min；95℃30s，58℃7min循环6次；95℃30s，5330s，72℃30s进行35个循环，最后72℃10min结束反应。扩增产物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳观察扩增结果。空白对照无扩增产物，鸭甲肝病毒、鸭星状病毒及鸭呼肠孤病毒基因组cdna三种核酸混合样品可扩增出三个片段，大小分别为248bp、158bp和322bp，一种核酸只能扩增出相应大小的片段(见图4)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120>一种同时检测鸭甲肝病毒、鸭星状病毒和鸭呼肠孤病毒的引物探针组合、试剂盒

<160>11

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cagcgtgcagctcgccgaccact23

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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gttcaccttgatgccgttctt21

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<211>123

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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agtaggtatcttatcctttctgctggtagtggtcggcgagctgcacgctgccgtcctcga60

tgttgtggcggatcttgaagttcaccttgatgccgttcttctgcttggactaactcaggt120

gta123

<210>4

<211>121

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<210>5

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<213>人工序列(artificialsequence)

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