商标分类 
商标转让 
您当前的位置： 促分裂原活化蛋白激酶7抑制剂的制作方法
2021-02-02 17:02:48|
248|
起点商标网相关申请
本申请要求在2018年6月4日提交的以色列专利申请号259810的优先权的权益，其内容通过引用整体并入本文。
发明的领域和背景
本发明在其一些实施方案中涉及药物化学，更具体地，但不排他地，涉及mkk7抑制剂家族及其用途。
激酶活性位点中非保守半胱氨酸残基的共价靶向已被证明是实现跨越激酶组的效力和更重要的选择性两者的稳健策略。这些努力产生了几种被批准的药物，包括共价激酶抑制剂：依鲁替尼(ibrutinib)、阿法替尼(afatinib)、奥希替尼(osimertinib)和来那替尼(neratinib)。
mkk7，也称为map2k7，是jnk的两种上游活化剂之一。与其它促分裂原活化蛋白激酶(mapk)级联类似，jnk级联由三个等级组成。在细胞外应激信号例如uv、渗透压休克、暴露于细胞因子或毒素后，多种受体例如tlr4、il-1受体和tnfα受体将活化一种或几种mapk激酶(map3k)。jnk通路的典型的map3k是例如dlk、mlk、tak和ask1。这些map3k将依次磷酸化并活化mapk激酶(map2k)mkk7和mkk4中的一种或两种。为了完全活化jnk，mkk7和mkk4将在jnk的活化环上磷酸化thr-183和tyr-185。这种完整的级联，有时包括jnk的底物，例如cjun、atf2和p53，通过结合支架蛋白而共定位：jip(jnk相互作用蛋白)。
由于jnk通路对于许多细胞过程，特别是炎症过程是如此重要，因此它被认为是各种适应症的治疗靶标。例如类风湿性关节炎、炎性肠病和阿尔茨海默病。以前的研究选择直接抑制jnk，或者通过抑制剂如混杂sp600125，或者最近使用选择性抑制剂。然而，还没有批准的靶向jnk的药物，可能是由于其在所有组织中广泛的表达模式。相反，map3k被认为是候选靶标，因为抑制上游将潜在地抑制整个jnk通路的活化。尽管如此，由于潜在的冗余，抑制map3k可能无效。
最近的研究[chang,c.-f.等，europeanjournalofmedicinalchemistry,2016,124,pp.186-199；在下文中称为“chang的研究”]，集中于已经作为抗癌靶标出现的aurora激酶及其抑制剂，其中一些已经进入临床研究。该研究利用基于硅片上片段的方法和基于知识的药物设计来鉴定作为特异性auroraa和/或b抑制剂的化合物，其基于与aurora激酶结合口袋中的特异性残基，特别是靶向残基arg220、thr217或glu177的相互作用。
其它
背景技术：
包括美国专利号9,227,978、8,088,783、7,514,444、7,195,894、7,803,749和6,136,596，以及美国专利申请公开号2010/0004234、2006/0079494、2005/0009876和2004/0243224、wo/2014/130693、wo/2016/004272、wo/2016/133935、wo/2016/010108、jp2011/246389、lanning,b.r.等，nat.chem.biol.,2014,10(9),pp.760-767和zhao,z.等,j.med.chem.,2017,60,pp.2879-2889。
技术实现要素：
本发明的方面涉及mkk7的共价抑制剂。c-junnh2-末端激酶(jnk)信号传导通路是细胞对应激、炎症信号和毒素的反应的核心。尽管已知jnk本身和通路中的各种map3k的选择性抑制剂，但迄今为止对于mkk7-活化jnk的两种直接map2k中的一种，尚不知道选择性抑制剂。基于共价虚拟筛选，本发明人鉴定了本文首次报道的选择性mkk7共价抑制剂。基于一种设计范例，将本文提供的抑制剂优化为jnk磷酸化的低微摩尔细胞抑制，所述设计范例集中于mkk7活性位点中的非保守半胱氨酸残基，其在其它激酶如aurora激酶中缺失。根据本发明的实施方案，示例性抑制剂的晶体结构已经被确定，并证实共价虚拟筛选正确预测了结合模式。分子优化确定了本文提供的抑制剂在蛋白质组水平上和针对一组76种激酶的选择性，并使用敲除细胞系验证了靶上效应。另外，本文提供的抑制剂显示阻断响应脂多糖的原代小鼠b细胞的活化。本文提供的共价抑制剂化合物允许研究jnk信号传导，并且可以作为开发治疗药物的先导物。
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了通式i'的化合物：
和其任何对映体、溶剂化物、水合物或药学上可接受的盐，其中：
e是反应性亲电体部分
r3为h或选自以下的取代基：
x1和x2各自独立地为c和n；
z为c或h；以及
环a是其中具有0-2个杂原子的5-或6-元芳族或脂族的取代或未取代的环，其选自：
条件是所述化合物不选自：
(z)-4-氧代-4-((3-(6-(苯基磺酰氨基)-1h-吲唑-3-基)苯基)氨基)丁-2-烯酸，
(z)-4-氧代-4-((3-(6-(对甲苯基)-1h-吲唑-3-基)苯基)氨基)丁-2-烯酸，
n-甲基-n-[2-氧代-2-[[3-(4,5,6,7-四氢-1h-吲唑-3-基)苯基]氨基]乙基]-2-丙烯酰胺，
n-[3-氧代-3-[[3-(4,5,6,7-四氢-1h-吲唑-3-基)苯基]氨基]丙基]-2-丙烯酰胺，
3-[5-(4,5,6,7-四氢-5-甲基-1h-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-基)-3-吡啶基]-2-丙烯酸乙酯，
rx选自：
ry选自phnhco、4-ph-phso2、phco、4-tbu-phso2、phch2、4-och3-phso2、phso2、4-no2-phso2、4-ch3-phso2和4fphso2；以及
rz选自：
根据本发明一些实施方案的另一方面，提供了由通式i表示的化合物：
和其任何对映体、溶剂化物、水合物或药学上可接受的盐，其中：
环a和环b各自独立地为其中具有0-2个杂原子的5-或6-元芳族或脂族环；
e是反应性亲电体部分；以及
r1-r8中的每一个独立地不存在、为h或取代基，
条件是所述化合物不选自：
(z)-4-氧代-4-((3-(6-(苯基磺酰氨基)-1h-吲唑-3-基)苯基)氨基)丁-2-烯酸，
(z)-4-氧代-4-((3-(6-(对甲苯基)-1h-吲唑-3-基)苯基)氨基)丁-2-烯酸，
n-甲基-n-[2-氧代-2-[[3-(4,5,6,7-四氢-1h-吲唑-3-基)苯基]氨基]乙基]-2-丙烯酰胺，
n-[3-氧代-3-[[3-(4,5,6,7-四氢-1h-吲唑-3-基)苯基]氨基]丙基]-2-丙烯酰胺，
3-[5-(4,5,6,7-四氢-5-甲基-1h-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-基)-3-吡啶基]-2-丙烯酸乙酯，
rx选自：
ry选自phnhco、4-ph-phso2、phco、4-tbu-phso2、phch2、4-och3-phso2、phso2、4-no2-phso2、4-ch3-phso2和4fphso2；以及
rz选自：
根据本发明的一些实施方案，反应性亲电体部分能够与对应于mkk7酶的位置218上的半胱氨酸的残基的侧链形成共价键。
根据本发明的一些实施方案，本文提供的化合物能够通过与其cys218共价结合而抑制人mkk7酶。
根据本发明的一些实施方案，本文提供的化合物的特征在于，与aurora激酶相比，在低至少两个数量级的浓度下，表现出对人mkk7酶的抑制。
根据本发明的一些实施方案，反应性亲电体部分，式i中的e，可以由通式ii表示：
其中：
q选自-c(＝o)-、-oc(＝o)-、-ch2c(＝o)-、-nrdc(＝o)-、-p(ord)(＝o)-、-ch2nrdc(＝o)-、-s(＝o)-、-ch2s(＝o)2-、-s(＝o)2-和-nrds(＝o)2-；
rd是h、c1-6烷基或羟烷基；
ra、rb和rc各自独立地不存在、为h、或选自c1-6烷基、氨基烷基、烷基氨基烷基、氰基和羟烷基，或者当
根据本发明的一些实施方案，反应性亲电体部分选自：
根据本发明的一些实施方案，ra是吸电子基团。
根据本发明的一些实施方案，q是-nhc(＝o)-。
根据本发明的一些实施方案，ra、rb和rc各自为h。
根据本发明的一些实施方案，反应性亲电体部分选自：
根据本发明的一些实施方案，环a是6元脂环族、杂脂环族、芳基或杂芳基。
根据本发明的一些实施方案，环b是6元脂环族、杂脂环族、芳基或杂芳基。
根据本发明的一些实施方案，环a和环b各自是6元芳基。
根据本发明的一些实施方案，环a和/或环b上的一个或多个取代基分别选自卤素、氰基、腈、硝基、c1-6烷基、c1-6烯基、炔基、偕c1-6烷烃、苄基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、羰基、羧基、羧酸酯、酰胺、烷基磺酰基、杂二环、联苯基、取代联苯基、联芳基和取代联芳基。
根据本发明的一些实施方案，本文提供的化合物的特征在于辛醇-水分配系数(logpow)值范围为-1至6。
根据本发明的一些实施方案，本文提供的化合物选自：
根据本发明的一些实施方案，本文提供的化合物选自：
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了一种药物组合物，其包括作为活性成分的通式i所示的化合物：
和其任何对映体、溶剂化物、水合物或药学上可接受的盐，其中：
环a和环b各自独立地为其中具有0-2个杂原子的5-或6-元芳族或脂族环；
e是反应性亲电体部分；以及
r1-r8中的每一个独立地不存在、为h或取代基，
和药学上可接受的载体，其包装在包装材料中并在印刷中标识用于治疗与c-jun-nh2-末端激酶(jnk)通路调控相关的医学病况、疾病或病症。
根据本发明的一些实施方案，所述医学病况、疾病或病症与mkk7酶相关。在一些实施方案中，所述mkk7酶具有对应于人mkk7中的cys218的半胱氨酸残基。
根据本发明的一些实施方案，所述医学病况、疾病或病症与aurora激酶不相关。
根据本发明一些实施方案的一个方面，提供治疗与c-jun-nh2-末端激酶(jnk)通路调控相关的医学病况、疾病或病症的方法，其包括给予需要其的受试者治疗有效量的具有通式i的化合物：
和其任何对映体、溶剂化物、水合物或药学上可接受的盐，其中：
环a和环b各自独立地为其中具有0-2个杂原子的5-或6-元芳族或脂族环；
e是反应性亲电体部分；以及
r1-r8中的每一个独立地不存在、为h或取代基。
根据本发明的一些实施方案，涉及治疗方法，所述医学病况、疾病或病症与mkk7酶相关，并且更具体地与在对应于人mkk7的cys218的位置上显示半胱氨酸残基的mkk7酶相关。
根据本发明一些实施方案的另一方面，提供了具有通式i的化合物的用途：
和其任何对映体、溶剂化物、水合物或药学上可接受的盐，其中：
环a和环b各自独立地为其中具有0-2个杂原子的5-或6-元芳族或脂族环；
e是反应性亲电体部分；以及
r1-r8中的每一个独立地不存在、为h或取代基，
用于制备治疗与c-jun-nh2-末端激酶(jnk)通路调控有关的医学病况、疾病或病症的药物。
根据本发明的一些实施方案，涉及本文提供的化合物的任何用途，所述医学病况、疾病或病症与mkk7酶相关，并且更具体地与在对应于人mkk7的cys218的位置上显示半胱氨酸残基的mkk7酶相关。
根据本发明的一些实施方案，涉及式i所示的化合物的药物组合物、治疗方法或用途，式i中的反应性亲电体部分e能够与对应于mkk7酶的位置218上的半胱氨酸的残基的侧链形成共价键。
根据本发明的一些实施方案，涉及式i所示的化合物的药物组合物、治疗方法或用途，其能够通过与其cys218共价结合而抑制人mkk7酶。
根据本发明的一些实施方案，涉及式i所示的化合物的药物组合物、治疗方法或用途，其特征在于与aurora激酶相比，在低至少两个数量级的浓度下，表现出对人mkk7酶的抑制。
根据本发明的一些实施方案，涉及式i所示的化合物的药物组合物、治疗方法或用途，式i中的反应性亲电体部分e由通式ii表示：
其中：
q选自-c(＝o)-、-oc(＝o)-、-ch2c(＝o)-、-nrdc(＝o)-、-p(ord)(＝o)-、-ch2nrdc(＝o)-、-s(＝o)-、-ch2s(＝o)2-、-s(＝o)2-和-nrds(＝o)2-；
rd是h、c1-6烷基或羟烷基；
ra、rb和rc各自独立地不存在、为h、或选自c1-6烷基、氨基烷基、烷基氨基烷基、氰基和羟烷基，或者当
根据本发明的一些实施方案，涉及式i所示的化合物的药物组合物、治疗方法或用途，所述医学病况、疾病或病症选自帕金森病、阿尔茨海默病、皮克病、克罗恩病、贝切特病、中风、冠状动脉疾病、心力衰竭、腹主动脉瘤、努南综合征、慢性丙型肝炎病毒感染、急性肝损伤、非酒精性脂肪肝病、哮喘、慢性阻塞性肺病、肌萎缩性侧索硬化、炎性肠病、多聚谷氨酰胺病、听觉毛细胞变性、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、乳糜泻、结肠直肠癌、视网膜母细胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肥胖、胰岛素抵抗、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、嗜银颗粒病、家族性额颞痴呆和2型糖尿病。
根据本发明的一些实施方案，涉及式i所示的化合物的药物组合物、治疗方法或用途，所述医学病况、疾病或病症与mkk7酶相关，条件是所述医学病况、疾病或病症不是糖尿病、癌症或炎症。
根据本发明的一些实施方案，涉及式i所示的化合物的药物组合物、治疗方法或用途，所述医学病况、疾病或病症与mkk7酶相关，条件是所述医学病况、疾病或病症不是神经胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌和甲状腺癌。
除非另有定义，本文所用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的方法和材料可用于本发明实施方案的实践或测试，但示例性方法和/或材料描述如下。在冲突的情况下，以专利说明书，包括定义为准。另外，材料、方法和实例仅是说明性的，而不是旨在是限制性的。
具体实施方式
参考说明书和所附方案，可以更好地理解本发明的原理和操作。
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应当理解本发明不必将其应用限制于以下描述中阐述的或通过实施例举例说明的细节。本发明能够有其它实施方案或者以各种方式实践或执行。
如上所述，仅有少数已知的抑制mkk7的激酶抑制剂，但迄今为止还没有报道mkk7的有效和选择性抑制剂。由于mkk7是几种医学病况的机制中的关键酶，因此提供选择性mkk7抑制剂是有益的。在设计选择性mkk7抑制剂的尝试中，本发明人已经寻找在纳摩尔范围内有效的共价抑制剂。在寻找这种选择性和共价mkk7抑制剂家族时，本发明人使用了基于结构的药物设计工具，其产生已经证明共价作用于mkk7并且在激酶组和蛋白质组水平上均表现出高选择性的化合物家族。进一步证明该抑制剂家族的成员能够阻断原代b细胞的活化，因此既代表了化学工具又代表了未来治疗药物的潜在先导物。
本发明人之前的挑战是设计一种化合物，其将平衡有效的可逆识别与温和但反应性亲电体如丙烯酰胺的最佳放置。为了解决这个挑战，本发明人利用了一种共价虚拟筛选软件dockovalent，其允许在给定蛋白质和靶标亲核体的结构模型的情况下筛选任意大的虚拟亲电体库以优先设计有效的选择性结合剂。
共价mkk7抑制剂：
根据本发明实施方案的一个方面，提供了可以由下面提供的通式i表示的化合物及其任何对映体、溶剂化物、水合物或药学上可接受的盐，其中共同的结构特征包括稠合到环a上并且连接到环b上的1h-吡唑部分：
其中环a和环b中的每一个可以是其中具有0-2个杂原子的5-或6-元芳族或脂环族环(杂芳族或杂脂环族，如果杂原子存在于环中)。通常，r1-r8中的每一个可以各自独立地不存在、为h或取代基，如下文定义和举例说明的。
例如，根据本发明的一些实施方案，所述化合物可表现出但不限于以下结构骨架中的任一种：
该化合物的另一个共同的结构特征是在环b的特定位置存在反应性亲电体部分，在式i中表示为e。“亲电体”或“亲电体部分”是能够与亲核体(例如，具有孤对电子、负电荷、部分负电荷和/或过量电子的部分，例如-sh基团)反应的任何部分。亲电体通常是缺电子的或包含缺电子的原子。在某些实施方案中，亲电体含有正电荷或部分正电荷，具有含有正电荷或部分正电荷的共振结构，或是其中电子的离域或极化导致一个或多个含有正电荷或部分正电荷的原子的部分。在一些实施方案中，亲电体包含共轭双键，例如α，β-不饱和羰基或α，β-不饱和硫代羰基化合物。在本发明的实施方案的上下文中，亲电体(式i中的e)是一种官能团，其通常根据其与另一官能团形成共价键的能力来选择，更具体而言，e根据其与mkk7半胱氨酸残基的巯基(即对应于人mkk7蛋白的位置218处的半胱氨酸的半胱氨酸残基的侧链巯基)形成共价键的能力来选择。在此应注意，在此呈现的化合物的设计目标是人mkk7，并且更具体地，在其中位置218处的非保守半胱氨酸，因此本发明的设计范例是目前公开的化合物对人mkk7的高水平选择性和特异性；这种功绩大部分可以ru如从下表6中看出而实现，其中清楚地看出，本发明提供的化合物家族的示例性成员作为称为人激酶组的激酶空间的弱或无效抑制剂。
在一些实施方案中，反应性亲电体部分，式i中的e，具有通式ii：
其中：
q选自-c(＝o)-、-oc(＝o)-、-ch2c(＝o)-、-nrdc(＝o)-、-p(ord)(＝o)-、-ch2nrdc(＝o)-、-s(＝o)-、-ch2s(＝o)2-、-s(＝o)2-和-nrds(＝o)2-；
rd是h、c1-6烷基或羟烷基；
ra、rb和rc各自独立地不存在、为h、或选自c1-6烷基、氨基烷基、烷基氨基烷基、氰基和羟烷基，或者当
例如，反应性亲电体部分可以由以下结构中的任何一个来表征：
在本发明的一些实施方案中，ra表示吸电子基团。根据本发明的实施方案，吸电子基团(ewg)将电子从反应中心吸引出去。当该中心是富电子的碳负离子或醇盐阴离子时，吸电子取代基的存在具有稳定作用。ewg包括，但不限于(并以极性效应强度递减的顺序)，以下部分：如烷基磺酰基(-so2r)、三氟甲磺酰基(so2cf3)、三卤(-cf3、-ccl3)、氰基(-c≡n)、磺酸根(-so3h)、硝基(-no2)、铵(-nh3+)、季胺(-nr3+)、醛(-cho)、酮(-cor)、羧基(cooh)、酰卤(-cocl、-cobr)、酯(-coor)、酰胺(-conh2)和卤素(-f、-cl、-br)。
在本发明的一些实施方案中，反应性亲电体部分e为丙烯酰胺，其中q为-nhc(＝o)-，即e为：
根据本发明的一些实施方案，当q为-nhc(＝o)-时，ra、rb和rc各自为h，且e为
可替代地，根据一些实施方案，反应性亲电体部分e选自：
在本发明的一些实施方案中，环a是6元脂环族、杂脂环族、芳基或杂芳基。在一些实施方案中，环a是取代或未取代的6元芳基。
在本发明的一些实施方案中，环b是6元脂环族、杂脂环族、芳基或杂芳基。在一些实施方案中，环b是取代或未取代的6元芳基。
在本发明的一些实施方案中，环a和环b两者各自为取代或未取代的6元芳基。
在一些实施方案中，环a是取代或未取代的6元脂环族，而环b是取代或未取代的6元芳基。在一些实施方案中，环b是取代或未取代的6元脂环族，而环a是取代或未取代的6元芳基。在一些实施方案中，环a为取代或未取代的6元芳基，且环b为取代或未取代的5元脂环族或杂脂环族。在一些实施方案中，环b为取代或未取代的6元芳基，且环a为取代或未取代的5元脂环族或杂脂环族。在本发明的一些实施方案中，环a和环b两者各自是取代或未取代的6元脂环族或杂脂环族。
当被取代时，环a和环b中的每一个可以表现出一个或多个下列示例性取代基，包括但不限于卤素、氰基、腈、硝基、c1-6烷基、c1-6烯基、炔基、偕c1-6烷烃、苄基、芳基、杂芳基、烷氧基、芳氧基、羰基、羧基、羧酸酯(酯)、酰胺、烷基磺酰基、杂二环、联苯基、取代联苯基、联芳基和取代联芳基，条件是取代基的存在是化学上可行的。
在本发明的一些实施方案中，根据在所得化合物中观察到的生物利用度，使用辛醇-水分配系数(logpow)值标准来选择取代基。因此，根据本发明的一些实施方案，化合物的特征在于显示范围为-1至6、或-0.5至5、或-0至5、或0至4的logpow值。特定取代基的选择以及它们在环a或环b上的位置可以通过使用logpow预测算法进行，也称为clogp(关于clogp预测的其它信息，参见例如ghose，arupk等，j.phys.chem.a,1998,102(21),pp.1089-5639)。
如下面的实施例部分所证明的，根据本发明的一些实施方案，本发明人通过合成一系列示例性化合物而简化了本发明的实施，但不限制本发明的范围，其包括下表2和表3中所列的化合物。根据本发明的优选实施方案，本文提供的化合物不是chang的研究(chang，c-f等，europeanjournalofmedicinalchemistry,2016,124,pp.186-199)中公开的化合物之一。根据本发明的优选实施方案，本文提供的化合物不是例如美国专利申请号2005/0009876、jp2011246389、wo2014/130693、wo2016/004272、wo2016/010108、lanning,b.r.等，natchembiol.,2014,10(9),pp.760-767和zhao,z.等，j.med.chem.,2017,60,pp.2879-2889中公开的化合物，和例如(z)-4-氧代-4-((3-(6-(苯基磺酰氨基)-1h-吲唑-3-基)苯基)氨基)丁-2-烯酸、n-[3-氧代-3-[[3-(4,5,6,7-四氢-1h-吲唑-3-基)苯基]氨基]丙基]-2-丙烯酰胺、n-甲基-n-[2-氧代-2-[[3-(4,5,6,7-四氢-1h-吲唑-3-基)苯基]氨基]乙基]-2-丙烯酰胺、和3-[5-(4,5,6,7-四氢-5-甲基-1h-吡唑并[4,3-c]吡啶-3-基)-3-吡啶基]-2-丙烯酸乙酯的化合物之一。根据本发明的一些实施方案，本文提供的化合物不是在构思本发明之前在公众场合公开的化合物之一，其因此将其排除在本发明的范围之外。上述出版物的内容通过引用整体并入本文。
chang的研究中列举的化合物作为新化合物排除在式i的范围之外，但不一定排除在本发明的其它方面的范围之外，例如用途和药物组合物，例如：
rx选自：
ry选自phnhco,4-ph-phso2,phco,4-tbu-phso2,phch2,4-och3-phso2,phso2,4-no2-phso2,4-ch3-phso2,和4-f-phso2；以及
rz选自
在将本发明付诸实施时，下列化合物被鉴定为用于开发最佳共价mkk7抑制剂的潜在先导化合物：
因此，根据本发明的一些实施方案，该化合物在对应于式i中r3的位置具有吸电子基团。进一步可替代地，根据本发明一些实施方案的化合物在对应于式i中r6的位置具有取代基。
制备所述化合物的方法：
根据本发明的一个方面的一些实施方案，提供了制备本文所提出的化合物的方法，其基本上如下文的实施例部分中所述进行。
用途和治疗方法：
本发明还提供本文所述化合物在治疗与c-jun-nh2-末端激酶(jnk)通路调控相关的疾病、病症、综合征或医学病况的方法中的用途，或更具体地，用于治疗与mkk7相关的医学病况的方法中的用途。在一些实施方案中，用作活性成分的化合物由式i表示并且如上文进一步描述，而式i的范围在涉及或不涉及chang的研究中呈现的化合物的前提下，即在治疗与人mkk7相关的疾病、医学病况或病症的方法方面考虑，所述化合物的范围可包括在别处描述的化合物，作为用于与人mkk7无关的适应症的活性成分。例如，在chang的研究中已经描述为aurora激酶抑制剂的示例性化合物go32在本发明的上下文中被考虑为治疗方法和/或药物组合物中的活性成分，其指示用于与mkk7相关的疾病、医学病况和病症。如在下面实施例部分中可以看出的，go32是比任何aurora激酶有效得多的mkk7抑制剂，可能是由于与mkk7的活性位点中或附近的氨基酸残基(例如cys218)的侧链形成共价键的设计范例，其不存在于任何aurora激酶中。
例如，本发明提供了在需要其的受试者中治疗上述病况的方法，其包括向受试者给予治疗有效量的一种或多种本文呈现的化合物，或包括一种或多种本文呈现的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物，从而预防或治疗上述病况。本文呈现的化合物的给药途径的实例包括口服或肠胃外，例如静脉内、皮内、经皮(局部)、经粘膜或通过吸入给药，和/或直肠给药，而每种可能性代表本发明的单独实施方案。
在另一方面，本发明涉及本文呈现的化合物在制造药物中的用途，所述药物有益于治疗与c-jun-nh2-末端激酶(jnk)通路调控相关的医学病况、疾病或病症。在一些实施方案中，所述化合物用于制造药物，由式i表示并且如上文进一步描述的，而式i的范围在涉及或不涉及chang的研究中呈现的化合物的前提下被考虑。
与c-jun-nh2-末端激酶(jnk)通路调控相关的疾病、病症、综合征或医学病况包括但不限于且不受任何特定理论约束，帕金森病、阿尔茨海默病、皮克病、克罗恩病、贝切特病、中风、冠状动脉疾病、心力衰竭、腹主动脉瘤、努南综合征、慢性丙型肝炎病毒感染、急性肝损伤、非酒精性脂肪肝病、哮喘、慢性阻塞性肺病、肌萎缩性侧索硬化、炎性肠病、多聚谷氨酰胺病、听觉毛细胞变性、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、乳糜泻、结肠直肠癌、视网膜母细胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肥胖、胰岛素抵抗、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、嗜银颗粒病、家族性额颞痴呆和2型糖尿病。
根据一些实施方案，所述疾病、病症、综合征或医学病况是基于人mkk7酶的抑制可治疗的，所述人mkk7酶在位置218处表现出半胱氨酸。在一些实施方案中，所述疾病、病症、综合征或医学病况不是糖尿病、炎症或癌症。
如本文所用，术语“给予”是指与本发明的化合物接触。可以对细胞或组织培养物，或对活的生物体，例如人进行给予。在一个实施方案中，本发明包括将本发明的化合物给予人类受试者。
“治疗性”治疗是给予表现出病理体征的受试者的治疗，目的是减少或消除那些体征。“治疗有效量”是足以给向其给予化合物的受试者提供有益效果的化合物的量。
“预防”和“防止”是指在处于危险中的个体中完全避免临床上明显的疾病进展的发作或减缓疾病的临床前明显阶段的发作。预防包括预防性治疗处于得病风险中的那些。
根据本发明的治疗疾病的方法可以包括给予包含本文呈现的化合物作为单一活性剂的药物组合物或药物，或与其它治疗方法组合。在一些实施方案中，可以将一种或多种另外的试剂加入到组合物中。本发明的治疗方法可以与其它治疗方法平行、在其它治疗方法之前或在其它治疗方法之后。
一种药物组合物：
根据本发明的实施方案，所述化合物是mkk7的选择性共价抑制剂，并且因此也可用作药物组合物中的活性成分，所述药物组合物用于治疗与c-jun-nh2-末端激酶(jnk)通路调控相关的医学病况、疾病或病症，或更具体地，用于治疗与mkk7相关的医学病况。
根据本发明实施方案的另一方面，提供了一种药物组合物，其包括作为活性成分的一种或多种本文呈现的化合物。在一些实施方案中，用作药物组合物中的活性成分的化合物由式i表示并且如上文进一步描述的，而式i的范围在涉及或不涉及chang的研究中呈现的化合物的前提下被考虑。
在一些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含作为活性成分的本文呈现的化合物和药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”是指将活性组分递送至预期目标并且不会对人或其他受体生物体造成伤害的媒介物。如本文所用，“药物”应理解为包括人类和动物药物两者。有用的载体包括，例如，水、丙酮、乙醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯或矿物油。也考虑使用洗涤剂如正辛基-β-d-吡喃葡萄糖苷(ogp)。用于配制药物组合物的方法和组分是公知的，并且可以在例如remington'spharmaceuticalsciences，第十八版，a.r.gennaro，ed.,mackpublishingco.eastonpa.,1990中找到，其内容通过引用整体并入本文。
通常，药物组合物被配制成适于给予模式的任何形式，例如溶液、胶态分散体、乳液(水包油或油包水)、悬浮液、乳膏、洗剂、凝胶、泡沫、喷雾剂、气雾剂、软膏、片剂、栓剂等。在一些实施方案中，本发明的药物组合物被配制用于气溶胶给予以供需要其的受试者吸入。
根据本发明的一些实施方案，在药物组合物中本文呈现的化合物的治疗有效量是当给予受试者时能够预防或改善感染例如细菌感染或其一种或多种症状的量。给予受试者的本发明的试剂或组合物的有效量将取决于疾病的类型和严重程度以及个体的特征，例如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受性。它还将取决于疾病的程度、严重性和类型。技术人员将能够根据这些和其它因素确定适当的剂量。本发明的组合物还可以与一种或多种其它治疗化合物组合给予。需要给予的活性成分的精确量取决于医师的判断，并且对于每个个体是独特的。
通常，治疗剂将作为药物制剂给予，所述药物制剂包括治疗剂和任何药学上可接受的佐剂、载体、赋形剂和/或稳定剂，并且可以是固体或液体形式，例如片剂、胶囊、粉末、溶液、悬浮液或乳液。组合物优选含有约0.01至约99重量％，更优选约2至约60重量％的治疗剂以及佐剂、载体和/或赋形剂。在一些实施方案中，有效量的范围为约0.001mg/kg至约500mg/kg受试者体重。在一些实施方案中，所述试剂的有效量范围为约0.05mg/kg至约30mg/kg，约0.1mg/kg至约30mg/kg，约1mg/kg至约25mg/kg，30约1mg/kg至约20mg/kg，或约1或2mg/kg至约15mg/kg。
在一些实施方案中，本发明的组合物通过鼻内或口内给予，使用合适的溶液，例如鼻溶液或喷雾剂、气雾剂或吸入剂给予。鼻用溶液通常是设计成以滴剂或喷雾剂形式给药至鼻道的水溶液。通常，制备鼻用溶液，使得它们在许多方面与鼻分泌物相似。因此，水性鼻用溶液通常是等渗的，并稍微缓冲以维持ph为5.5-6.5。此外，如果需要，制剂中可以包括与眼用制剂中使用的那些相似的抗微生物防腐剂和合适的药物稳定剂。用于吸入、气雾剂和喷雾剂的各种商业鼻和口制剂是已知的，并且包括例如抗生素和抗组胺剂，并且用于哮喘预防。
对于鼻内或口内给药，本发明的组合物以适于排出喷雾剂形式的药物剂量的溶液提供，其中治疗量的药物组合物包含在用于鼻或口内给药的装置的贮存器内。该设备可包括泵喷雾装置，其中用于排出剂量的装置包括计量泵。或者，该装置包括加压喷雾装置，其中排出剂量的装置包括计量阀，而药物组合物还包含常规的推进剂。合适的推进剂包括一种氯氟烃或氯氟烃的混合物，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷，氢氟烃，例如1，1，1，2-四氟乙烷(hfc-134a)和1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(hfc-227)或二氧化碳。合适的加压喷雾装置是本领域公知的，并尤其包括在wo92/11190、u.s.4,819,834、u.s.4,407,481和wo97/09034中公开的那些(当其适于产生鼻喷雾而不是用于吸入的气雾剂或舌下喷雾时)。上述出版物的内容通过引用整体并入本文。合适的鼻泵喷雾装置包括可从法国marlyleroi的valoiss.a.获得的vp50、vp70和vp100模型，以及可从德国radolfzell的pfeiffergmbh获得的50、70和100μl鼻泵喷雾，但也可采用其它模型和尺寸。在上述实施方案中，根据本发明的药物剂量或剂量单元可以存在于计量泵或阀的计量室内。
预期在从本申请成熟的专利的生命期间，将开发许多相关的共价mkk7抑制剂，并且术语共价mkk7抑制剂的范围旨在先验地包括所有这样的新技术。
如本文所用，术语“约”是指±10％。
术语“包含”、“包括”、“具有”以及它们的同源词是指“包括但不限于”。
术语“由……组成”是指“包括并限于”。
术语“基本上由……组成”是指组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分，但只有当另外的成分、步骤和/或部分没有实质上改变要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖的特征时。
如本文所用，在某些物质的上下文中，短语“基本上不含(substantiallydevoidof)”和/或“基本上不含(essentiallydevoidof)”是指组合物完全不含该物质或包括以组合物的总重量或体积计小于约5％、1％、0.5％或0.1％的物质。或者，在过程、方法、性质或特征的上下文中，短语“基本上不含(substantiallydevoidof)”和/或“基本上不含(essentiallydevoidof)”是指完全不含某一过程/方法步骤、或某一性质或某一特征、或其中与给定标准过程/方法相比，所述某一过程/方法步骤以小于约5％、1％、0.5％或0.1％实现的过程/方法，或与给定标准相比，性质或特征的特征为小于所述性质或特征的特征的约5％、1％、0.5％或0.1％。
本文中术语“示例性”用来表示“用作实例、例子或说明”。任何被描述为“示例性”的实施方案不必被解释为比其它实施方案优选或有利和/或排除来自其它实施方案的特征的结合。
词语“任选地”或“可替代地”在本文中用于意指“在一些实施方案中提供而在其它实施方案中不提供”。本发明的任何特定实施方案可以包括多个“任选”特征，除非这些特征冲突。
如本文所用，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另外清楚地指明。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。
在本申请中，本发明的各种实施方案可以以范围的形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应当被解释为对本发明范围的硬性限制。因此，范围的描述应被认为具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，对范围如1-6的描述应被认为具体公开了子范围如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等，以及该范围内的单个数值如1、2、3、4、5和6。这与范围的宽度无关。
无论何时在此指出数值范围，其意指包括在指出的范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语第一指示数字和第二指示数字“之间的范围”和“从”第一指示数字“到”第二指示数字“的范围”在本文中可互换使用，并且旨在包括第一和第二指示数字以及其间的所有分数和整数。
如本文所用，术语“过程”和“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、材料、机械、计算和数字领域的从业者已知的或容易从已知的方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。
如本文所用，术语“治疗”包括废除、基本上抑制、减缓或逆转病况的进展，基本上改善病况的临床或美学症状或基本上预防病况的临床或美学症状的出现。
如本文所用，术语“烷基”描述包括直链和支链基团的脂族烃。烷基可以具有1至20个碳原子，且优选8-20个碳原子。无论本文中何时描述数值范围(例如“1-20”)，它意味着该基团(在这种情况下为烷基)可以含有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，最多并包括20个碳原子。烷基可以是取代或未取代的，和/或支链或非支链(直链)的。当被取代时，本文中称为r的取代基可以是例如烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、卤素、羟基、烷氧基和羟烷基，这些术语如本文所定义。在本发明的一些实施方案中，本文所用的术语“烷基”还包括饱和或不饱和烃，因此该术语还包括烯基和炔基。
术语“烯基”描述如本文定义的具有至少两个碳原子和至少一个碳-碳双键的不饱和烷基。烯基可以是支链或非支链(直链)的，被一个或多个如本文所述的取代基取代或未被其取代。
如本文所定义的术语“炔基”是具有至少两个碳原子和至少一个碳-碳三键的不饱和烷基。炔基可以是支链的或无支链的(直链的)，和/或被一个或多个如本文所述的取代基取代或未被其取代。
术语“脂环族”和“环烷基”是指全碳单环或稠环(即，共享相邻的碳原子对的环)、含有3个或更多个碳原子的支化或未支化基团，其中一个或多个环不具有完全共轭的π电子系统，并且可以进一步被取代或未被取代。环烷基可以被一个或多个如本文所述的取代基取代或未被其取代。
术语“杂脂环族”是指单环或稠环(即共享相邻原子对的环)基团，其在一个或多个环中具有一个或多个非碳原子，例如氮、氧和硫，并且其中一个或多个环不具有完全共轭的π电子系统。杂脂环族可以被一个或多个如本文所述的取代基取代或未被其取代。
术语“芳基”描述具有完全共轭π电子系统的全碳芳族单环或稠环多环(即共享相邻碳原子对的环)基团。芳基可以是取代或未取代的。取代的芳基可以具有一个或多个如本文对烷基所述的取代基。
术语“杂芳基”描述单环或稠环(即共享相邻原子对的环)基团，其在环中具有一个或多个原子，例如氮、氧和硫，并且另外具有完全共轭的π电子系统。杂芳基的代表性实例包括但不限于呋喃、咪唑、吲哚、异喹啉、噁唑、嘌呤、吡唑、吡啶、嘧啶、吡咯、喹啉、噻唑、噻吩、三嗪、三唑等。杂芳基可以如本文对烷基所述被取代或未被取代。
术语“卤素”是指-f、-cl、-br或-i。
本文所用的术语“羟基”是指-oh基团。
术语“烷氧基”和“羟烷基”是指-or基团，其中r是如上所述的烷基。
应当理解，为了清楚起见在单独的实施例的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施例中组合提供。相反地，为了简洁起见在单个实施例的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合或如在本发明的任何其它描述的实施例中合适地提供。在各种实施例的上下文中描述的某些特征不被认为是那些实施例的必要特征，除非在没有那些元件的情况下实施例是不可操作的。
上文描述的和所附权利要求部分要求保护的本发明的各种实施方案和方面在以下实施例中找到实验和/或计算的支持。
实施例
现在参考以下实施例，其与以上描述一起以非限制性方式说明本发明的一些实施方案。
实施例1
对接
对接方法：
dockovalent[london,n.等，“covalentdockingoflargelibrariesforthediscoveryofchemicalprobes”,natchembiol,2014,10(12),pp.1066-72]用于筛选117,667丙烯酰胺的虚拟库，针对位于酶活性位点附近mkk7的残基cys218。该库含有具有合适的游离胺(伯胺或仲胺，脂族胺或芳族胺)的商购结构单元，所述游离胺实际上转化为相应的丙烯酰胺。
初始命中：
基于对前500个预测的目测，选择10种化合物用于合成和测试(参见表1)。“对接排名”在其相应的运行中给出，而四个丙烯酰胺的虚拟库基于丙烯酰胺的胺前体(伯或仲脂族胺、伯或仲芳族胺)单独地对接。体外激酶活性测定是通过nanosyn进行的，如下所述。
表1
在前10个命中中，三个化合物在体外激酶活性测定中显示出对mkk7的抑制，ic50为0.011μm、0.502μm和0.873μm，并且选择go4用于进一步优化。
实施例2
合成
基于预测的对接模型，设计并合成了一系列示例性的go4类似物(参见表2)，而由nanosyn进行的体外激酶活性测定(参见下文)，ec50是pjnk抑制的in-cellwestern测定(icw)评估。
表2
一般：
用于合成的所有试剂和溶剂购自sigma-aldrich、merck和acros。化学结构单元购自enamine和molport化学品供应商。商业试剂用于合成而不进一步纯化。快速色谱法使用mercksilicagelkieselgel60(0.04-0.06mm)或通过雾化
设计合成：
根据本发明的一些实施方案，应用两种主要策略来制备示例性化合物，第一种是合成通路a，产生4,5,6,7-四氢-1h-吲唑模板，而第二种是合成通路b，产生1h-吲唑模板。
合成通路a：3-苯基-4,5,6,7-四氢-1h-吲唑模板的合成：
如以下方案1所述制备带有3-苯基-4,5,6,7-四氢-1h-吲唑模板的化合物。使用吗啉将市售的环己酮或其衍生物转化为烯胺中间体，烯胺进一步与单独制备的酰氯衍生物(alloc保护的3-氨基苯甲酰氯)反应。烯胺水解得到1,3-二酮。通过加入肼，1,3-二酮环化为吡唑。将带有alloc-n-芳基的alloc基团形式的4,5,6,7-四氢-1h-吲唑模板脱保护，提供用于丙烯酰化的游离胺前体。
在方案1中，反应条件为：(a)氯甲酸烯丙酯，4mnaoh(水溶液)，二噁烷，0℃至rt；(b)草酰氯、dcm、dmf，0℃至rt；(c)吗啉、对甲苯磺酸、甲苯、回流；(d)chcl3，et3n，0℃至rt；hcl，h2o，rt；(e)nh2nh2·h2o，b(och3)3，chcl3，rt；(f)苯基硅烷，pd(pph3)4，ch2cl2，rt。
方案1
酰卤制备：
在酰卤产生之前，如下用alloc保护基保护3-氨基苯甲酸的游离胺：将3-氨基苯甲酸(2gr，0.014摩尔，1eq.)溶于4mnaoh(10ml)和二噁烷(4ml)中，冰浴冷却。将氯甲酸烯丙酯(2ml，0.019mol，1.3eq.)溶解于4mnaoh(5ml)中并分几份加入到反应混合物中。如果需要，用4mnaoh溶液将混合物的ph调节至10。将反应留在rt搅拌过夜，用h2o稀释，用饱和柠檬酸酸化至中性ph，并用etoac萃取。有机层用na2so4干燥，蒸发etoac，得到alloc保护的化合物。将3-alloc-氨基苯甲酸(0.3gr，1.35mmol，1eq.)溶解在无水dcm(10ml)中，冰浴冷却。在惰性气氛下通过注射器加入草酰氯(150μl，1.76mmol，1.3eq.)，随后加入2-3滴无水dmf。将反应物温热至室温，搅拌1小时后，加入另外部分草酰氯(10μl，0.1mmol，0.08eq.)，将反应物再搅拌2-3小时。蒸发dcm，得到烯丙基-(3-(氯羰基)苯基)氨基甲酸酯，为白色固体。
烯胺制备的一般程序：
将环己酮或类似衍生物(0.019mol，1eq.)溶于甲苯(10ml)，向混合物中加入吗啉(0.018mol，0.95eq.)和对甲苯磺酸(催化剂；0.01eq.)。反应烧瓶配有迪安-斯达克装置，将混合物回流直到不再观察到有水分离(2-3小时)。在真空中浓缩反应，油状粗产物无需另外纯化即可使用。
烯胺的酰化和1,3-二酮的形成的一般程序：
将适当的烯胺(3.76mmol，1eq.)溶于无水氯仿(5ml)，在惰性气氛和冰浴上，将其分几部分加入到烯丙基-(3-(氯羰基)苯基)氨基甲酸酯(3.2mmol，0.85eq.)的无水氯仿(3.2ml)溶液中。然后，将et3n(3.76mmol，1eq.)逐滴加入到反应混合物中。将反应在rt下搅拌3.5小时，并通过uplc监测直至酰氯消耗。在所有酰氯反应后，将水(15ml)和浓hcl溶液(1.5ml)加入到反应混合物中，搅拌2小时直到形成适当的1,3-二酮。用etoac萃取混合物，用柠檬酸饱和溶液洗涤。有机层用na2so4干燥并在真空中浓缩，得到粗残余物。通过硅胶色谱法(梯度，己烷比etoac)纯化残余物，得到产物。
4,5,6,7-四氢-1h-吲唑制备的一般程序：
将适当的1,3-二酮(1.32mmol，1eq.)溶解在无水氯仿(15ml)中。向反应混合物中加入：一水合肼(1.58mmol，1.2eq.)和硼酸三甲酯(过量，5ml)。将反应在rt下搅拌20-30分钟，并通过uplc监测产物形成。加入水(1-2ml)猝灭反应。蒸发氯仿，将粗产物重新溶于etoac，用水萃取两次。有机层用na2so4干燥并在真空中浓缩，得到粗残余物。通过硅胶色谱法(梯度，dcm比etoac)纯化残余物，得到产物。
alloc脱保护的一般程序：
将alloc保护的化合物(alloc-n-芳基；0.18mmol，1eq.)溶解在无水dcm(8ml)中，将苯基硅烷(0.45mmol，2.5eq.)加入到该混合物中。通过将氩气鼓泡通过溶剂使溶液脱气。5分钟后，在强氩气流下加入pd(pph3)4催化剂(0.018mmol，0.1eq)。添加后，停止氩气流，用铝箔覆盖烧瓶。将反应混合物在惰性气氛下于rt搅拌3小时。反应完成后，在真空中浓缩溶剂，得到粗残余物，将其通过硅胶色谱法纯化(梯度：dcm比etoac)
合成通路b：基于3-苯基-1h-吲唑的化合物的合成：
如以下方案2所述制备带有3-苯基-1h-吲唑模板的化合物。市售3-酰基-1h-吲唑或其衍生物与3-(n-boc-氨基)苯基硼酸(通过3-氨基苯基硼酸的叔丁氧羰基化制备)之间的suzuki-miyaura交叉偶联反应产生所需的结构模板，即3-苯基-1h-吲唑。boc的酸解提供了用于丙烯酰化的目标胺。在方案2中，反应条件为：(a)boc2o，net3，thf/h2o，0℃至rt；(b)pd(pph3)4，苯基硅烷，ch2cl2(c)在ch2cl2中的50％tfa，三异丙基硅烷，0℃至rt。
方案2
3-氨基苯基硼酸的叔丁氧羰基化的一般程序：
3-氨基苯基硼酸一水合物或其衍生物如其它地方[wo2008/134036]所述进行叔丁氧羰基化。
suzuki偶联的一般程序：
将适当的被卤化物(溴化物或碘化物；0.084mmol，1eq.)取代的吲唑溶于二噁烷(5ml)中。向反应混合物中加入溶于水(1ml)的3-(n-boc-氨基)苯基硼酸(0.12mmol，1.5eq.)和k2co3(0.16mmol，2eq.)。通过将氩气鼓泡通过溶剂使溶液脱气。20分钟后，在强氩气流下加入pd(pph3)4催化剂(0.006mmol，0.07eq.)。加入后，停止氩气流，将反应混合物在100℃下在惰性气氛下搅拌5小时，然后留在rt搅拌1-2天，直到hplc显示起始吲唑被消耗。然后将反应混合物冷却，用etoac(50ml)稀释，用饱和柠檬酸萃取。通过硅胶色谱法(梯度：dcm比etoac)纯化得到的粗残余物。
boc酸解的一般程序：
将boc保护的化合物(1.1mmol，1eq.)在冰浴上的混合物中搅拌冷却至0℃，并溶于dcm：tfa(2:1，总计18ml)在加入一滴三异丙基硅烷后加入。将反应混合物在rt下搅拌30-60分钟；在真空中除去溶剂，得到产物。
合成取代的n-芳基丙烯酰胺衍生物：
n-芳基丙烯酰胺的合成呈现在下面的方案3中，并包括在net3存在下，在无水ch2cl2中一步缩合丙烯酰氯和相应的n-芳基。方案3中的反应条件为：丙烯酰氯，dmf：acn，碱；r＝1h-吲唑、4,5,6,7-四氢-1h-吲唑或市售杂环。
方案3
丙烯酰化的一般程序：
将含胺前体(可商购获得或可替代地在实验室制备；1eq.)溶于无水dmf和acn的混合物中，将该混合物在冰浴上冷却至0℃，并向该混合物中加入accl(0.8-1.2eq.)。使用碱(dipea或et3n)将反应混合物的ph调节至9，并将反应物在冰上搅拌，然后在rt下搅拌直至形成产物。反应完成后，蒸发溶剂，将残余物悬浮于etoac中，用3mhcl洗涤两次，用饱和nahco3溶液洗涤一次，用盐水洗涤一次。有机萃取物经na2so4干燥，真空蒸发，得到粗产物，粗产物经制备hplc经c18柱纯化，使用缓冲液：ddw中的0.1％tfa和acn中的0.1％tfa。用99％ddw至99％acn梯度洗脱产物。下面描述该程序中的例外。
示例性的含丙烯酰胺的化合物的合成程序和表征数据：
go1：
按照一般的丙烯酰化程序，在冰浴上将n-芳基前体(可从商业来源获得；0.02g，0.15mmol，1eq.)、accl(13.5μl，0.16mmol，1.1eq.)、dipea(直至碱性ph)在dmf：acn(1ml：1ml)的混合物中搅拌30分钟，并在室温下过夜。获得白色粉末形式的产物。
1hnmr(400mhz,meod)δppm5.84(dd,j＝10.2hz,1.7hz,1h),6.44(dd,j＝17hz,1.7hz,1h),6.65(dd,j＝17hz,10.2hz,1h),7.4-7.34(m,2h),7.66(d,j＝6.6hz,1h),8.24(s,1h)。
hrms:m/z,c10h10n3o,所需值188.0824[m+h]+,测量值188.0822[m+h]+。
go2：
按照一般的丙烯酰化程序，在冰浴上将n-芳基前体(可从商业来源获得；0.02g，0.08mmol，1eq.)、accl(7.5μl，0.09mmol，1.1eq.)、dipea(直至碱性ph)在dmf：acn(0.5ml：1ml)的混合物中搅拌30分钟，并在室温下2小时。获得白色粉末形式的产物。
1hnmr(400mhz,丙酮-d6)δppm1.50-1.40(m,2h),1.86-1.75(m,2h),2.21-2.10(m,2h),2.95-2.87(m,1h),3.91-3.83(m,1h),5.57(dd,j＝9,3hz,1h),6.27-6.24(m,2h),7.49-7.04(m,3h),8.11(m,2h).13cnmr(100mhz,丙酮-d6):δppm30.18,32.05,35.60,47.68,47.78,124.45,126.07,128.52,129.01,130.90,131.94,131.98,159.49,162.33,163.96.hrms:m/z,c17h21n4o,所需值297.1715[m+h]+,测量值297.1707[m+h]+,319.1535[m+na]+,615.3165[2m+na]+。
go3：
在修改的方案[allen，c.e.等，organicletters,2015,17(3),458-460]中，在冰浴上将n-芳基前体(可从商业来源获得；0.02g，0.12mmol，1eq.)、accl(11.0μl，0.13mmol，1.1eq.)、amberlysta26(oh形式)(270mg)在dmf(2ml)中搅拌5分钟，并在室温下30分钟。滤出树脂，将粗产物注入制备hplc，得到产物，为白色固体粉末。
1hnmr(300mhz,meod)δppm5.84(dd,j＝8.6hz,3.3hz,1h),6.47(m,2h),7.71(d,j＝8.8hz1h),8.13(dd,j＝8.9hz,2.5hz,1h),8.23(s,1h),8.61(d,j＝2.5hz,1h).hrms:m/z,c11h10n3o2,所需值216.0773[m+h]+,测量值216.0772[m+h]+,238.0592[m+na]+,453.1298[2m+na]+。
go4：
按照一般的丙烯酰化程序，在冰浴上将n-芳基前体(可从商业来源获得；0.02g，0.094mmol)、accl(7.3μl，0.09mmol，0.98eq.)、dipea(直至碱性ph)在dmf：acn(0.5ml：0.5ml)的混合物中搅拌放置5分钟，并于室温40分钟。将粗产物注入制备hplc，得到产物，为白色固体粉末。
1hnmr(500mhz,meod)δppm1.88-1.96(m,4h),2.79-2.81(m,4h),5.83(dd,j＝9.17,2.88hz,1h),6.40-6.51(m.2h),7.45-7.50(m,2h),7.60(d,j＝7.02hz,1h),8.20(s,1h).13c-deptqnmr(500mhz,meod):δppm22.42,23.00,24.01,115.61,119.90,121.68,123.76,128.26,130.71,131.27,132.31,140.60,144.92,146.81,166.28.hrms:m/z,c16h18n3o,所需值268.1450[m+h]+,测量值268.1456[m+h]+,290.1276[m+na]+。
go5：
按照一般的丙烯酰化程序，在冰浴上将n-芳基前体(可从商业来源获得)(0.02g，0.11mmol，1eq.)、accl(10.0μl，0.12mmol，1.1eq.)、dipea(直至碱性ph)在dmf：acn(0.8ml：0.8ml)的混合物中搅拌30分钟，并在室温下2小时。获得白色粉末形式的产物。
1hnmr(500mhz,丙酮-d6)δppm3.55(t,j＝8hz,2h),3.94(t,j＝8hz,2h),5.68(dd,j＝10hz,2hz,1h),6.33(dd,j＝17hz,2hz,1h),6.46(dd,j＝17hz,10hz,1h),7.59(d,j＝8hz,2h),7.69(d,j＝8hz,2h).13cnmr(125mhz,丙酮-d6):δppm36.92,44.78,117.29,119.61,119.70,125.63,132.02,133.46,137.12,159.18.hrms:m/z,c12h13n3o2na,所需值254.0905[m+na]+,测量值254.0907[m+na]+,485.1907[2m+na]+。
go6：
按照一般的丙烯酰化程序，在冰浴上将n-芳基前体(可从商业来源获得)(0.02g，0.09mmol，1eq.)、accl(8.9μl，0.10mmol，1.1eq.)、dipea(直至碱性ph)在dmf：acn(0.5ml：0.5ml)的混合物中搅拌30分钟，并在室温下2小时。获得粘性油状产物。
1hnmr(300mhz,meod)δppm1.82-1.65(m,2h),2.19-2.14(m,2h),3.00-2.90(m,1h),3.42-3.25(m,1h),4.30-4.26(m,1h),4.76-4.72(m,1h)5.77(dd,j＝11hz,2hz,1h),6.23(dd,j＝17hz,2hz,1h),6.84(dd,j＝17hz,11hz,1h),7.55-7.50(m,2h),8.39(d,j＝6hz,1h),8.74(dd,j＝8hz,1.2hz,1h).esi-ms:m/z,c15h18n3o,所需值256.14[m+h]+,测量值256.12[m+h]+,278.24[m+na]+,511.47[2m+h]+,533.45[2m+na]+,788.67[3m+na]+。esi-ms也表明杂质的存在。
go7：
按照一般的丙烯酰化程序，在冰浴上将n-芳基前体(可从商业来源获得)(0.02g，0.13mmol，1eq.)、accl(12.0μl，0.15mmol，1.1eq.)、dipea(直至碱性ph)在dmf：acn(0.8ml：0.7ml)的混合物中搅拌30分钟，并在室温下2小时。获得白色粉末形式的产物。
1hnmr(400mhz,丙酮-d6)δppm4.43(s,2h),5.75(dd,j＝10hz,2hz,1h),6.39(dd,j＝17hz,j＝2hz,1h),6.49(dd,j＝17hz,10hz,1h),7.53(d,j＝8hz,1h),7.94(d,j＝8hz,1h),8.21(s,1h).13cnmr(100mhz,丙酮-d6):δppm44.57,113.65,122.67,123.75,126.43,131.76,133.60,139.09,163.28,169.85.hrms:m/z,c11h11n2o2,所需值203.0820[m+h]+,测量值203.0814[m+h]+,225.0634[m+na]+,427.1369[2m+na]+。
go8：
按照一般的丙烯酰化程序，在冰浴上将n-芳基前体(可从商业来源获得)(0.02g，0.09mmol，1eq.)、accl(8.0μl，0.10mmol，1.1eq.)、dipea(直至碱性ph)在dmf：acn(0.7ml：0.7ml)的混合物中搅拌30分钟，并在室温下2小时。获得白色粉末形式的产物。
1hnmr(500mhz,丙酮-d6)δppm1.47-1.39(m,1h),1.60-1.51(m,1h),1.94-1.80(m,2h),2.90(s,3h),3.30-2.99(m,4h),4.42-4.32(m,2h),5.59(dd,j＝10hz,2hz,1h),5.80(s,1h),6.21(dd,j＝17hz,2hz,1h),6.32(dd,j＝17hz,10hz,1h),8.19(s,1h).13cnmr(125mhz,丙酮-d6):δppm24.18,27.35,28.19,36.59,41.62,45.39,48.49,77.55,124.61,131.70,149.64,156.30,160.92,165.08.hrms:m/z,c14h22n5o,所需值276.1824[m+h]+,测量值276.1816[m+h]+,298.1631[m+na]+。
go9：
按照一般的丙烯酰化程序，在冰浴上将n-芳基前体(可从商业来源获得)(0.02g，0.09mmol，1eq.)、accl(8.6μl，0.10mmol，1.1eq.)、dipea(直至碱性ph)在dmf：acn(0.2ml：1.5ml)的混合物中搅拌30分钟，并在室温下2小时。由于产物可溶于水，将粗产物注入制备hplc而不进行萃取。获得无色油状产物。
hrms:m/z,c13h20n5o,所需值262.1668[m+h]+,测量值262.1667[m+h]+。
go10：
按照一般的丙烯酰化程序，冰浴上将n-芳基前体(可从商业来源获得)(0.025g，0.11mmol，1eq.)、accl(10.3μl，0.13mmol，1.1eq.)、dipea(直至碱性ph)在dmf：acn(1.5ml：0.5ml)的混合物中搅拌30分钟，并在室温过夜。由于产物可溶于水，将粗产物注入制备hplc而不进行萃取。获得无色油状产物。nmr：随时间的降解可能包含杂质。
esi-ms:m/z,c11h18n5o,所需值236.14[m+h]+,测量值236.24[m+h]+,258.23[m+na]+,493.47[2m+na]+。
go14：
按照一般的丙烯酰化程序，冰浴上将n-芳基前体(可从商业来源获得；0.02g，0.10mmol，1eq.)、accl(9.1μl，0.11mmol，1.1eq.)、et3n(直至碱性ph)在acn(2ml)中搅拌10分钟，并室温下2小时。由于产物可溶于水，将粗产物注入制备hplc而不进行萃取。获得无色油状产物。
hrms:m/z,c12h18n4o2na,所需值273.1328[m+na]+,测量值273.1323[m+na]+,523.2736[2m+na]+。
go32：
按照合成通路b和一般的丙烯酰化程序，由可商购的3-溴-1h-吲唑和(3-氨基苯基)硼酸制备go32。丙烯酰化条件：在冰浴上将n-芳基前体(0.34gr，1.13mmol，1eq.)、accl(90μl，1.13mmol，1eq.)、et3n(直至碱性ph)在dmf：acn(1ml：5ml)的混合物中搅拌30分钟，并在rt下30分钟。将粗产物注入制备hplc，得到产物，为白色固体粉末。
1hnmr(400mhz,丙酮-d6)δppm5.77(d,j＝9.84hz,1h),6.43-6.59(m,2h),7.24(t,j＝7.43hz,1h),7.42(t,j＝7.50hz,1h),7.49(t,j＝7.84hz,1h),7.65(d,j＝8.37hz,1h),7.81-7.85(m,3h),8.18(d,j＝8.19hz,1h),8.60(s,1h)9.70(s,1h).13c-deptqnmr(400mhz,丙酮-d6)δppm110.75,118.54,119.08,120.85,121.02,121.44,122.65,126.58,126.78,129.44,132.09,134.83,139.80,142.28,144.07,163.94.hrms:m/z,c16h14n3o,所需值264.1137[m+h]+,测量值264.1146[m+h]+,286.0967[m+na]+。
go29：
按照合成通路b和一般的丙烯酰化程序，由可商购的3-溴-7-硝基-1h-吲唑和(3-氨基苯基)硼酸制备go29。丙烯酰化条件：在冰浴上将n-芳基前体(0.03g，0.085mmol)、accl(7.6μl，0.093mmol，1.1eq.)、dipea(直至碱性ph)在dmf：acn(0.5ml：0.5ml)的混合物中搅拌2小时。将粗产物注入制备hplc，得到产物，为黄色固体粉末。
1hnmr(400mhz,丙酮-d6)δppm5.78(dd,j＝10hz,j＝2hz,1h),6.68-6.35(m,2h),7.57-7.52(m,2h),7.81(d,j＝8hz,1h),7.84(d,j＝8hz,1h),8.47(d,j＝8hz,1h),8.58(s,1h),8.66(d,j＝8hz,1h).13cnmr(100mhz,丙酮-d6):δppm118.46,119.42,120.91,122.42,122.65,123.55,124.95,125.99,126.49,129.46,129.58,131.85,133.12,134.09,139.86,163.37.hrms:m/z,c16h12n4o3na,所需值331.0807[m+na]+,测量值331.0800[m+na]+,639.1739[2m+na]+。
go37：
按照合成通路b和一般的丙烯酰化程序，由可商购的3-溴-6-硝基-1h-吲唑和(3-氨基苯基)硼酸制备go37。丙烯酰化条件：在冰浴上将n-芳基前体(0.04g，0.11mmol)、accl(8.5μl，0.10mmol，0.95eq.)、et3n(直至碱性ph)在dmf：acn(1ml：1ml)中的混合物搅拌30分钟，并在室温下60分钟。将粗产物注入制备hplc，得到产物，为黄色固体粉末。
1hnmr(500mhz,丙酮-d6)δppm5.77(dd,j＝10hz,2hz,1h),6.42(dd,j＝17hz,2hz,1h),6.54(dd,j＝17hz,10hz,1h),7.52(t,j＝8hz,1h),7.82-7.80(m,2h),8.11(dd,j＝9hz,1.6hz,1h),8.38(d,j＝9hz,1h)8.59(s,1h),8.63(d,j＝1.6hz,1h).13cnmr(125mhz,丙酮-d6):δppm107.35,115.49,118.22,119.26,121.92,122.31,123.62,126.44,129.40,131.93,133.85,139.95,141.01,146.61,148.10,163.49.hrms:m/z,c16h11n4o3,所需值307.0831[m-h]-,测量值307.0831[m-h]-。
go49：
按照一般的丙烯酰化程序，在冰浴上将n-芳基前体(可从商业来源获得)(0.02g，0.10mmol，1eq.)、accl(7.8μl，0.098mmol，0.98eq.)、dipea(直至碱性ph)在dmf：acn(0.4ml：0.4ml)的混合物中搅拌10分钟，并于室温30分钟。将粗产物注入制备hplc，得到产物，为白色固体粉末。
hrms:m/z,c15h16n3o,所需值254.1293[m+h]+,测量值254.1288[m+h]+,276.1113[m+na]+,507.2504[2m+h]+,529.2320[2m+na]+。
go72：
按照合成通路b和一般的丙烯酰化程序，由可商购的3-溴-1h-吲唑和(3-氨基-4-甲基苯基)硼酸制备go72。丙烯酰化条件：在冰浴上将n-芳基前体(0.031g，0.092mmol)、accl(63μl，0.078mmol，0.86eq.)、dipea(直至碱性ph)在dmf：acn(1ml：1ml)的混合物中搅拌5分钟，并在rt下30分钟。将粗产物注入制备hplc，得到产物，为白色固体粉末。
1hnmr(300mhz,meod)ppmδ2.35(s,3h),5.83(dd,j＝10.10,1.43hz,1h),6.39-6.63(m,2h),7.20(t,j＝8.3hz,1h),7.39-7.45(m,2h),7.56(d,j＝8.30hz,1h),7.75(d,j＝7.91hz,1h),8.05-8.10(m,2h).13cnmr(300mhz,meod)ppmδ18.01,111.47,121.77,122.01,122.41,125.63,126.21,127.89,128.08,132.18,132.23,133.15,133.65,137.18,143.33,145.49,166.84.hrms:m/z,c17h16n3o,所需值278.1293[m+h]+,测量值278.1282[m+h]+,300.1105[m+na]+,555.2492[2m+h]+,577.2313[2m+na]+。
go73：
按照合成通路b和一般的丙烯酰化程序，由可商购的3-溴-1h-吲唑和(3-氨基-5-氰基苯基)硼酸制备go73。丙烯酰化条件：在冰浴上将n-芳基前体(0.026g，0.075mmol)、accl(7μl，0.086mmol，0.88eq.)、dipea(直至碱性ph)在dmf：acn(1ml：1ml)的混合物中搅拌5分钟，并在室温下1小时。将粗产物注入制备hplc，得到产物，为白色固体粉末。
1hnmr(500mhz,丙酮-d6)δppm5.83(dd,j＝10hz,2hz,1h),6.45(dd,j＝17hz,2hz,1h),6.53(dd,j＝17hz,10hz,1h),7.32(t,j＝8hz,1h),7.48(t,j＝8hz,1h),7.70(d,j-8hz,1h),8.13(s,1h),8.23(d,j＝8hz,1h),8.26(s,1h),8.75(s,1h).13cnmr(125mhz,丙酮-d6):δppm110.71,113.19,118.36,120.43,120.60,120.84,121.53,121.72,124.81,126.52,127.40,131.37,136.28,140.58,141.74,142.04,163.75.hrms:m/z,c17h11n4o,所需值287.0933[m-h]-,测量值287.0934[m-h]-。
go74：
按照合成通路b，go74由可商购的3-溴-1h-吲唑和(3-氨基苯基)硼酸制备。boc酸解后，用hatu偶联试剂将n-芳基前体与4-(二甲基氨基)-2-丁烯酸盐酸盐偶联。偶联程序：将4-(二甲基氨基)-2-丁烯酸(0.012g，0.07mmol，0.92eq.)溶于dmf：acn(0.5ml：2ml)的混合物中，加入dipea(直至碱性ph)。搅拌混合物5分钟后，将hatu(0.030g，0.08mmol，0.98eq.)加入到反应混合物中。加入n-芳基前体(0.025gr，0.077mmol，1eq.)后，根据需要将ph调节至碱性(ph8-9)。将反应混合物在rt下搅拌48小时。反应完成后，在真空中除去溶剂，将残余物悬浮于etoac中，用饱和nahco3溶液洗涤。有机萃取物用na2so4干燥，真空蒸发，得到粗产物，将其注入制备hplc，得到淡黄色粉末产物。
1hnmr(300mhz,meod)δppm2.93(s,6h),4.05(dd,j＝7.19,0.85hz,2h),6.59(d,j＝15.20hz,1h),6.88(td,j＝14.64,7.22,7.22hz,1h),7.23(t,j＝9.01,1h),7.41-7.59(m,3h),7.65-7.75(m,2h),8.06(d,j＝9.00hz,1h),8.36(s,1h).13cnmr(300mhz,meod)δppm43.20,58.78,111.49,120.25,120.64,121.67,121.82,122.43,124.56,127.85,130.45,132.11,134.25,135.62,139.97,143.28,145.40,164.32.hrms:m/z,c19h21n4o,所需值321.1715[m+h]+,测量值321.1709[m+h]+。
go80：
按照合成通路b和一般的丙烯酰化程序，由可商购的3-碘-6-甲基-1h-吲唑和(3-氨基苯基)硼酸制备go80。丙烯酰化条件：在冰浴上将n-芳基前体(0.62g，1.86mmol)、accl(148μl，1.86mmol，1eq.)、et3n(直至碱性ph)在dmf：acn(4ml：6ml)的混合物中搅拌30分钟，并在rt下30分钟。将粗产物注入制备hplc，得到产物，为白色固体粉末。
1hnmr(400mhz,丙酮-d6)δppm2.46(s,3h),5.73(dd,j＝10hz,2hz,1h),6.42(dd,j＝17hz,2hz,1h),6.54(dd,j＝17hz,10hz,1h),7.08(d,j＝8.4hz,1h),7.41(s,1h),7.47(t,j＝8hz,1h),7.79-7.82(m,2h),8.02(d,j＝8hz,1h),8.53(s,1h),9.57(s,1h).13c-deptqnmr(400mhz,丙酮-d6)δppm21.09,109.98,118.24,118.78,119.19,120.61,122.37,123.50,126.57,129.30,132.22,135.17,136.48,139.87,142.98,143.84,163.74.hrms:m/z,c17h16n3o,所需值278.1293[m+h]+,测量值278.1294[m+h]+,300.1114[m+na]+。
go81：
按照合成通路b和一般的丙烯酰化程序，由可商购的3-溴-7-甲基-1h-吲唑和(3-氨基苯基)硼酸制备go81。丙烯酰化条件：在冰浴上将n-芳基前体(0.072g，0.21mmol)、accl(16μl，0.20mmol，0.95eq.)、dipea(直至碱性ph)在dmf：acn(0.5ml：5ml)的混合物中搅拌5分钟，并在rt下1小时。将粗产物注入制备hplc，得到产物，为白色固体粉末。
1hnmr(300mhz,meod+cdcl3)δppm2.53(s,3h),5.71(dd,j＝8.37,3.25hz,1h),6.26-6.44(m,2h),7.03-7.18(m,2h),7.42(t,j＝7.92,1h),7.64(d,j＝7.74hz,1h),7.81-7.85(m,2h),7.98(s,1h).13cnmr(300mhz,meod+cdcl3)δppm16.50,118.48,118.78,119.79,120.25,120.53,121.74,123.31,126.77,127.37,129.34,131.14,133.97,136.18,138.77,141.80,144.94,165.81.hrms:m/z,c17h16n3o,所需值278.1293[m+h]+,测量值278.1293[m+h]+,300.1113[m+na]+,555.2512[2m+h]+,577.2329[2m+na]+。
go83：
按照合成通路b和一般的丙烯酰化程序，由可商购的3-碘-6-甲氧基-1h-吲唑和(3-氨基苯基)硼酸制备go83。丙烯酰化条件：在冰浴上将n-芳基前体(0.073g，0.20mmol)、accl(15μl，0.19mmol，0.92eq.)、dipea(直至碱性ph)在dmf：acn(0.5ml：2ml)的混合物中搅拌5分钟，并在rt下30分钟。将粗产物注入制备hplc，得到产物，为白色固体粉末。
1hnmr(300mhz,meod)δppm3.89(s,3h),5.81(dd,j＝9.41,2.21hz,1h),6.32-6.59(m,2h),6.89(dd,j＝9.30,3.10,1h),6.97(s,1h),7.48(t,j＝9.20,1h),7.67-7.69(m,2h),7.93(dd,j＝8.92,1.87hz,1h),8.32(s,1h).13cnmr(300mhz,meod)δppm55.96,91.92,115.26,116.39,120.28,120.89,122.86,124.26,128.03,130.47,132.52,135.06,140.33,144.68,145.44,161.55,166.34.hrms:m/z,c17h16n3o2,所需值294.1242[m+h]+,测量值294.1242[m+h]+,316.1059[m+na]+,587.2411[2m+h]+,609.2228[2m+na]+。
go88：
按照合成通路b和一般的丙烯酰化程序，由可商购的3-溴-7-氟-1h-吲唑和(3-氨基苯基)硼酸制备go88。丙烯酰化条件：在冰浴上将n-芳基前体(0.05g，0.14mmol)、accl(11.9μl，0.15mmol，1eq.)、et3n(直至碱性ph)在dmf：acn(0.5ml：2ml)的混合物中搅拌30分钟，并在rt下60分钟。hplc纯化得到白色固体粉末状产物。
1hnmr(400mhz,丙酮-d6)δppm5.76(dd,j＝10hz,2hz,1h),6.41(dd,j＝17hz,2hz,1h),6.54(dd,j＝17hz,10hz,1h),7.27-7.19(m,2h),7.49(t,j＝8hz,1h),7.80(dd,j＝8hz,1.4hz,2h),7.99(dd,j＝8hz,1hz,1h)8.57(s,1h).13cnmr(100mhz,丙酮-d6):δppm110.22(d,jcf＝16hz),116.89(d,jcf＝4hz),118.10,118.86,121.70(d,jcf＝5.5hz),122.26,124.63(d,jcf＝4hz),126.35,129.24,131.51(d,jcf＝16hz),131.93,134.07,139.74,144.74,148.3(d,jcf＝250hz),163.34.hrms:m/z,c16h12fn3ona,所需值304.0862[m+na]+,测量值304.0855[m+na]+,563.2024[2m+h]+,585.1821[2m+na]+。
go89：
按照合成通路b和一般的丙烯酰化程序，由可商购的7-氯-3-碘-1h-吲唑和(3-氨基苯基)硼酸制备go89。丙烯酰化条件：在冰浴上将n-芳基前体(0.053g，0.15mmol)、accl(11.9μl，0.15mmol，1eq.)、et3n(直至碱性ph)在dmf：acn(0.5ml：2ml)的混合物中搅拌30分钟，并在rt下60分钟。hplc纯化得到白色固体粉末状产物。
1hnmr(400mhz,丙酮-d6)δppm5.76(dd,j＝10hz,2hz,1h),6.41(dd,j＝17hz,2hz,1h),6.54(dd,j＝17hz,10hz,1h),7.29(t,j＝8hz,1h),7.52-7.47(m,2h),7.80-7.78(m,2h),8.15(d,j＝8hz,1h)8.56(s,1h).13cnmr(100mhz,丙酮-d6):δppm115.64,117.00,118.09,118.90,119.85,122.13,122.26,122.55,125.64,126.33,129.26,129.68,131.94,134.09,139.77,163.32.hrms:m/z,c16h12cln3ona,所需值320.0567[m+na]+,测量值320.0562[m+na]+,617.1231[2m+na]+。
go98：
按照合成通路b和一般的丙烯酰化程序，由可商购的6-溴-3-碘-1h-吲唑和(3-氨基苯基)硼酸制备go98。丙烯酰化条件：在冰浴上将n-芳基前体(0.06g，0.15mmol)、accl(12μl，0.15mmol，1eq.)、et3n(直至碱性ph)在dmf：acn(0.4ml：1ml)的混合物中搅拌30分钟，并在rt下30分钟。将粗产物注入制备hplc，得到产物，为白色固体粉末。
1hnmr(400mhz,丙酮-d6)δppm5.77(dd,j＝10hz,2hz,1h),6.41(dd,j＝17hz,2hz,1h),6.53(dd,j＝17hz,10hz,1h),7.40(dd,j＝8.7hz,1.5hz,1h),7.49(t,j＝8hz,1h),7.80-7.77(m,2h),7.88(d,j＝1.5hz,1h)8.11(d,j＝8.7hz,1h),8.54(s,1h).13cnmr(100mhz,丙酮-d6):δppm113.33,118.00,118.81,119.67,119.99,122.20,122.45,124.37,126.36,129.25,131.90,134.11,139.71,142.78,144.22,163.29.hrms:m/z,c16h11brn3o,所需值340.0085[m-h]-,测量值340.0088[m-h]-。
go101：
按照合成通路b和一般的丙烯酰化程序，由可商购的6-溴-3-碘-1h-吲唑和(3-氨基苯基)硼酸制备go101。在boc酸解之前，通过另外的suzuki交叉偶联反应将溴基团转化为苯基。使用与一般程序(见上)中所述相同的条件，与苯基硼酸的suzuki反应提供了6位的所需苯基。丙烯酰化条件：在冰浴上将n-芳基前体(0.05g，0.12mmol)、accl(11μl，0.14mmol，1.1eq.)、et3n(直至碱性ph)在dmf：acn(0.6ml：2ml)的混合物中搅拌30分钟，并在rt下60分钟。将粗产物注入制备hplc，得到灰白色固体粉末产物。
1hnmr(500mhz,丙酮-d6)δppm5.76(dd,j＝10hz,2hz,1h),6.42(dd,j＝17hz,2hz,1h),6.55(dd,j＝17hz,10hz,1h),7.41(t,j＝7.5hz,1h),7.54-7.48(m,3h),7.58(d,j＝8.5hz,1h),7.78(d,j＝7.5hz,2h),7.81(d,j＝8hz,1h),7.85(d,j＝8,1h)7.88(s,1h),8.26(d,j＝8.5hz,1h),8.61(s,1h).13cnmr(125mhz,丙酮-d6):δppm108.32,117.95,118.55,120.00,121.08,121.24,122.12,126.26,127.34,127.45,128.90,129.16,131.99,134.76,139.39,139.71,141.15,142.80,143.77,163.40.hrms:m/z,c22h17n3ona,所需值362.1269[m+na]+,测量值362.1261[m+na]+,701.2646[2m+na]+。
go106：
按照合成通路b和一般的丙烯酰化程序，由可商购的6-氯-3-碘-1h-吲唑和(3-氨基苯基)硼酸制备go106。丙烯酰化条件：在冰浴上将n-芳基前体(0.065g，0.82mmol)、accl(17μl，0.22mmol，1.2eq.)、et3n(直至碱性ph)在dmf：acn(1ml：2ml)的混合物中搅拌30分钟，并在rt下30分钟。将粗产物注入制备hplc，得到产物，为白色固体粉末。
1hnmr(500mhz,丙酮-d6)δppm5.76(dd,j＝10hz,2hz,1h),6.41(dd,j＝17hz,2hz,1h),6.52(dd,j＝17hz,10hz,1h),7.27(dd,j＝9hz,1.5hz,1h),7.49(t,j＝8hz,1h),7.71(d,j＝1.5hz,1h),7.80-7.77(m,2h),8.16(d,j＝9hz1h),8.54(s,1h).13cnmr(125mhz,丙酮-d6):δppm110.13,117.99,118.79,119.44,121.82,122.19,122.24,126.36,129.24,130.28,131.90,134.14,139.71,142.77,144.24,163.29.hrms:m/z,c16h13cln3o,所需值298.0747[m+h]+,测量值298.0744[m+h]+,320.0565[m+na]+,617.1245[2m+na]+。
go108：
按照合成通路b和一般的丙烯酰化程序，由商业上可获得的3-碘-6-甲基-1h-吲唑和(3-氨基-5-氰基苯基)硼酸制备go108。丙烯酰化条件：在冰浴上将n-芳基前体(0.05g，0.15mmol)、accl(11.8μl，0.15mmol，1eq.)、et3n(直至碱性ph)在dmf：acn(1ml：2ml)的混合物中搅拌30分钟，在rt下1.5。将粗产物注入制备hplc，得到产物，为白色固体粉末。
1hnmr(500mhz,丙酮-d6)δppm2.51(s,3h),5.83(dd,j＝10hz,2hz,1h),6.47(dd,j＝17hz,2hz,1h),6.52(dd,j＝17hz,10hz,1h),7.16(d,j＝8.4hz,1h),7.47(s,1h),8.09(d,j＝8.4hz,1h),8.12(s,1h),8.25(s,1h),8.72(s,1h).13cnmr(125mhz,丙酮-d6):δppm20.86,109.97,113.15,118.38,118.65,120.04,120.74,121.39,123.92,124.70,127.38,131.37,136.42,136.73,140.55,141.49,142.72,163.73.hrms:m/z,c18h14n4ona,所需值325.1065[m+na]+,测量值325.1066[m+na]+,627.2239[2m+na]+。
go61：
按照合成通路a，go61由可商购的4n-boc-4-哌啶酮和3-氨基苯甲酸制备。丙烯酰化条件：在冰浴上将n-芳基前体(0.05g，0.16mmol)、accl(11.4μl，0.14mmol，0.9eq.)、dipea(直至碱性ph)在dmf：acn(0.5ml：2ml)的混合物中搅拌10分钟，并在rt下30分钟，通过加入1ml水猝灭反应。将粗产物注入制备hplc，得到产物，为白色固体粉末。
hrms:m/z,c20h24n4o3na,所需值391.1746[m+na]+,测量值391.1735[m+na]+,737.3796[2m+h],759.3611[2m+na]+。
go64：
通过boc基团酸中毒从可获得的go61制备go64。酸解条件：go61(0.06g，0.16mmol，1eq.)，dcm(2ml)，tfa(2ml)，一滴三异丙基硅烷。将反应混合物在rt下搅拌30分钟。在真空中除去溶剂，得到产物。
1hnmr(300mhz,meo)d)δppm1.30(s,1h),3.11(t,j＝6.20hz,2h),3.60(t,j＝6.20hz,2h),4.48(s,2h),5.81(dd,j＝9.00,3.00hz,1h),6.35-6.52(m,2h),7.35-7.50(m,4h),8.08(s,1h).13cnmr(300mhz,meod)δppm20.81,42.30,42.81,106.70,119.41,121.12,123.29,127.77,128.23,130.82,132.40,140.61,141.91,144.26,166.39.hrms:m/z,c15h17n4o,所需值269.1402[m+h]+,测量值269.1400[m+h]+,537.2713[2m+h]+。
go54：
按照合成通路a，go54由可商购的4，4-二甲基环己烷-1-酮和3-氨基苯甲酸制备。丙烯酰化条件：在冰浴上将n-芳基前体(0.04g，0.16mmol)、accl(11μl，0.13mmol，0.8eq.)、dipea(直至碱性ph)在dmf：acn(2ml：1ml)的混合物中搅拌10分钟，并在rt下20分钟，通过加入1ml水猝灭反应。将粗产物注入制备hplc，得到产物，为白色固体粉末。
1hnmr(300mhz,meodδppm1.07(s,6h),1.72(t,j＝6.60hz,2h),2.56(s,2h),2.79(t,j＝6.60hz,2h),5.82(dd,j＝8.85,2.70hz,1h),6.42-6.47(m,2h),7.39-7.50(m,2h),7.63(d,j＝7.80,1h),8.10(s,1h).13cnmr(300mhz,meod)ppm19.59,28.03,31.22,35.79,36.16,115.21,119.83,121.51,123.82,128.19,130.62,131.65,132.32,140.60,144.62,145.67,166.27.1hnmr(400mhz,丙酮-d6)δppm1.04(s,6h),1.64(t,j＝6.5hz,2h),2.55(s,2h),2.70(t,j＝6.5hz,2h),5.72(dd,j＝10hz,2hz,1h),6.37(dd,j＝17hz,2hz,1h),6.49(dd,j＝17hz,10hz,1h),7.37(t,j＝8hz,1h),7.46(d,j＝8hz,1h),7.75(d,j＝8,1h),8.11(s,1h).13cnmr(100mhz,丙酮-d6):δppm18.80,27.39,30.25,35.28,36.04,112.13,117.27,117.95,121.57,126.15,128.81,131.96,134.39,139.44,141.50,144.39,163.16.hrms:m/z,c18h22n3o,所需值296.1763[m+h]+,测量值296.1762[m+h]+,318.1581[m+na]+,591.3445[2m+h]+,613.3264[2m+na]+。
go55：
按照合成通路a，go55由可商购的四氢-4h-吡喃-4-酮和3-氨基苯甲酸制备。丙烯酰化条件：在冰浴上将n-芳基前体(0.025g，0.11mmol)、accl(7.4μl，0.09mmol，0.8eq.)、dipea(直至碱性ph)在dmf：acn(0.6ml：2ml)的混合物中搅拌10分钟，并在rt下30分钟，通过加入1ml水猝灭反应。将粗产物注入制备hplc，得到产物，为白色固体粉末。
1hnmr(400mhz,丙酮-d6)δppm2.80(t,j＝5.5hz,2h),3.93(t,j＝5.5hz,2h),4.90(s,2h),5.74(dd,j＝10hz,2hz,1h),6.38(dd,j＝17hz,2hz,1h),6.50(dd,j＝17hz,10hz,1h),7.39-7.37(m,2h),7.70-7.67(m,1h),8.05(s,1h),7.88(d,j＝1.5hz,1h)8.11(d,j＝8.7hz,1h),8.54(s,1h).13cnmr(100mhz,丙酮-d6):δppm23.14,63.88,64.15,110.91,111.39,116.81,118.06,120.88,126.27,129.12,131.90,139.70,140.19,140.42,163.21.hrms:m/z,c15h16n3o2,所需值270.1242[m+h]+,测量值270.1244[m+h]+,292.1063[m+na]+,539.2415[2m+h]+,561.2233[2m+na]+。
基于sar的共价抑制剂设计：
基于sar分析和药物效用测定，在下文中呈现，制备了根据本发明的实施方案的适合用作mkk7的共价抑制剂的另外一系列化合物并列于下表3中，其中hek293和3t3wt细胞中的ec50是pjnk抑制的icw评估。
表3
实施例3
方法
incellwestern(icw)：
在程序前24小时将hek293、beas2b和3t3细胞铺在384孔透明底部黑色平板(corning)上，所述平板预先涂有在pbs中稀释至5μg/ml浓度的纤连蛋白(sigma)，45分钟后引入细胞。使用multidroptmcombi试剂分配器(thermofisherscientific)将细胞铺板。化合物、试剂和抗体分配以及洗涤用cybio液体处理器(analytik)进行。在固定前，将细胞与小分子或至多1％dmso预孵育2小时。在固定前，将hek293、3t3或beas2b细胞分别用0.6m/0.2m/0.2md-山梨醇/pbs(sigma)处理20/40/40分钟。除去培养基，立即用每孔150μl3.7％甲醛/pbs固定溶液固定孔20分钟。然后吸取甲醛，用150μl0.5％tritonx-100/pbs溶液渗透细胞10分钟。吸取后，用冰冷的甲醇洗涤细胞，并在-20℃下储存10分钟。吸取甲醇，用150μl封闭缓冲液(licor)封闭细胞90分钟。将一抗phospho-sapk/jnkt183/y185(cst；9251s)在封闭缓冲液中以1:1000稀释，并每孔施加50μl，除了仅施加封闭缓冲液的对照孔，在4℃下伴随温和摇动o.n.(16h)。吸取一抗，用150μl0.1％tween20/pbs(sigma)洗涤溶液洗涤孔三次，7分钟。然后将
mkk7或mkk4(由nanosyn进行)的体外活性测定：
根据本发明的一些实施方案，示例性试验化合物在dmso中稀释至终浓度为10μm-0.0565nm范围，而在所有测定中dmso的终浓度保持在1％。以类似的方式测试了文献化合物，staurosporine。将1nmmkk7或mkk4与无活性jnk1在包含100mmhepes、5mmmgcl2、1mmdtt、0.1％bsa、0.01％tritonx-100和2μmatp的缓冲液中预孵育2小时。孵育后，在30μmatpatp存在下测试现在活化的jnk1的活性17小时(mkk7)或4小时(mkk4)。
mkk7蛋白纯化：
mkk7同工型4获自orf组(orfeome)，从该orf组将具有c-末端6-his标签的mkk7同工型1(103-426残基)克隆至pet28-tevh载体中并在大肠杆菌resetta2(de3)plys细胞中生长。在用0.2mmiptg诱导后，细胞在15℃生长20小时。
使用5ml用pbs、250mmkcl、5mmdtt平衡的talon珠(clonetech)纯化蛋白质。用含有500mm咪唑的相同缓冲液洗脱蛋白质。将洗脱的蛋白质立即注射到用50mmhepesph6.7、125mmnacl、5mmdtt平衡的hiloadsuperdex20016/60制备级柱中。浓缩含有mkk7的峰，并将其注入用相同缓冲液平衡的superdex75hr10/30分析柱中。
完整蛋白质谱分析：
将纯化的mkk7样品以10μm浓度与20μm示例性化合物go4、go32或go80一起在4℃下孵育1小时或16小时。在指定的孵育时间后，将样品以使用电喷雾电离的正离子模式注射到lc/ms(watersacuityuplcclassh)中。c4柱(
结构确定和晶体学：
如先前报道的[kinoshita，t等，biochem.biophys.res.comm.,2017,493(1),pp.313-317]制备稳定的突变体，mkk7的c218s和c276s。通过转化大肠杆菌菌株rossetta2(de3)plyss(merckmillipore，darmstadt，德国)，用插入pet22b(merckmillipore)的mkk7基因产生六组氨酸标记的mkk7突变体。通过talon钴填充树脂(takarabio，otsu，japan)和spsepharoseff阳离子交换柱(gehealthcare，littlechalfont，uk)纯化蛋白质。在与野生型相同的条件下结晶纯化的mkk7突变体，所述野生型由22-25％(w/v)peg3350、0.2m柠檬酸三钠和0.1mhepes缓冲液组成，ph为7.5。x射线衍射数据集在photonfactorybl17a射束线处的pilatus3s6m检测器(dectris)上或在aichi同步加速器辐射中心bl2s1射束线处的quantumq315s检测器(adsc)上收集，并由xds积分。初始阶段通过使用5y90结构作为起始模型的分子置换来确定。结构精修和模型修改使用ccp4程序套件中的refmac5和coot进行迭代。数据收集和精修统计示于下表4中。c218s/go80和c276s/go80复合物的最终坐标保藏在蛋白质数据库(proteindatabank)中，id分别为：5z1e和5z1d。
表4
括号中的值是最高分辨率壳(shell)。armerge＝σhσj|ihj-<ih>|/σhσj|ihj|，其中h表示唯一反射，j表示等效对称指数。i是观察到的强度，<i>是i的平均值。
激酶组选择性筛选：
在定制的76种激酶的组中使用lifetechnologiesselectscreenkinaseprofilingservice评估激酶选择性，所述组选择为提供所有激酶家族的广泛代表性覆盖。激酶活性测定采用z'-lyte或adapta测定技术，atp浓度为km或接近km，atp用于每种激酶，试验化合物浓度为1μm。
用于化学探针选择性分析的基于活性的荧光标记：
用于化学探针选择性分析的基于活性的荧光标记如下进行。使用补充有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂混合物(sigma)的ripa缓冲液(sigma)裂解hek293细胞，并根据制造商的方案生产裂解物。
过表达mkk7(103-426残基)的大肠杆菌菌株rosseta2bl21(de3)在10mllb中于37℃生长至o.d.600＝0.6-0.8，然后用0.1mmiptg诱导蛋白质表达4小时。加入含有20mmtris-hcl、ph＝7、50mmnacl、5mmdtt和10％甘油的裂解缓冲液，并补充蛋白酶抑制剂(sigma)、benzonase核酸酶(sigma)，然后在冰上超声(30％振幅，5分钟，10秒开，40秒关)，然后在4℃下离心15000rcf，15分钟。
在竞争实验中，将50μl裂解物与0.5μl，5mmgo32/go80在37℃预孵育1小时，然后与0.5μl，5mm含有炔基的化学探针在37℃孵育1小时，然后与5-tamra-叠氮化物(5μl，0.5mm)、抗坏血酸(3μl，150mm)和thpta配体(3μl，50mm)在cuso4(1μl，50mm)存在下反应，最终体积为63μl。样品补充4ⅹ样品缓冲液并加热至95℃5分钟。在还原条件下，将50μl的点击的裂解物在4-20％sds-page凝胶(genscript)上运行，然后用typhoonfla9500激光扫描仪(ge)成像。
实施例4
结果
结构-活性关系
在预测对接结果的基础上，设计并合成了一个小型go4类似物系列。转移到吲唑类似物改善了抑制(go32ic50＝9nm)。结合一个更容易的合成途径通过suzuki-miyaura偶合现成的吲唑结构单元，我们进一步追求这个系列。
对接模型表明吲唑在6位或7位的取代可以提高结合。吲唑7位的取代几乎不能忍受，氟在ic50中没有变化，硝基和氯取代显示活性略有下降，甲基取代则以两个数量级的大小破坏结合。然而，在6位上可忍受许多取代物，包括硝基、甲基、甲氧基、溴、氯和苯基(见表2)。
一组示例性的类似物(go4、go32和go80)通过完整的蛋白质质谱法进行了测试，以表明它们通过蛋白质的不可逆共价标记起作用。在4℃(分子浓度20μm，蛋白质浓度10μm)孵育1h或16h后，在孵育1小时后，化合物显示出分别为65.16％、78.14％和59.58％的共价标记，而在孵育16小时后，分别为95.15％、96.29％和92.87％的共价标记。
有效抑制细胞内jnk磷酸化：
为了利用mkk7共价抑制剂的全剂量响应曲线快速评估细胞活性(ec50)，根据本发明的一些实施方案，在传统的westernblot上将in-cellwestern测定调整为384孔板形式，并监测对渗透性休克进行反应的phospho-jnk(pjnk)水平。我们首先表征了pjnk对山梨醇反应的动力学。在hek293细胞中20分钟和在3t3和beas2b细胞中40分钟，pjnk有足够的动态范围。用化合物或dmso预处理细胞2小时，然后用山梨醇刺激来评估化合物的活性。测量pjnk及其底物pc-jun和patf2的反应，以及pp38(其是mkk4而非mkk7的底物)和hek293细胞中的perk，结果见下表5。
表5
尽管与体外活性相似，根据本发明的一些实施方案，示例性mkk7共价抑制剂化合物在细胞中显示多种且显著更低的活性。这种较低的活性可能是由于与高水平的细胞atp竞争、细胞亲核体如谷胱甘肽(gsh)的潜在消耗和可能的不完全渗透性。由于这些抑制剂是时间依赖性的，与19小时的体外测定所需的相对长的孵育时间相比，对明显较低活性的另一贡献是与细胞的短的孵育时间(2小时)。尽管如此，先导化合物显示细胞ec50低于1μm。
如表5中可以看出，与go4的5.2μm的ec50相比，结构优化的抑制剂go32和go80显示出pjnk的降低，ec50分别为2.06μm和1.26μm。pcjun(分别为2.26μm和1.67μm)和patf2(分别为2.79μm和5.19μm)具有相似的值。10μm时，go80和go37不影响pp38或perk的水平，而go32显示perk降低约25％，而对pp38没有影响。
为了验证共价抑制机制以及预测的结合姿态，合成了两个阴性对照化合物、pcm520和pcm521(参见下面的化学结构示意图)；第一个与还原的丙烯酰胺不再能够形成共价键，而后者在吲唑氮上甲基化，预计与激酶铰链形成关键的氢键。实际上，对照化合物都没有对pjnk显示高达100μm的任何作用。
作为icw的正交测定，我们使用ktr报告细胞系通过活细胞成像活化jnk。首先，通过icw在该细胞系(beas2b)中评估了化合物go4、go32、go37、go80的ic50，发现其值与其它细胞系的值相似，但稍高。此后，在使用和不使用测试和对照化合物时，jnk活化的动力学通过几个单细胞的活细胞成像来跟踪；在hek293细胞中产生的ec50结果是go80为3.3μm，pcm520和pcm521两者都超过10μm。总体上，低浓度的抑制剂显示基线jnk磷酸化的降低以及pjnk响应于山梨糖醇的峰的降低。
靶上活性的遗传验证：
野生型3t3细胞、3t3mkk7双敲除(mkk7-/-)细胞和mkk4/7双敲除(mkk4/7-/-)用于验证本文提出的mkk7共价抑制剂的靶活性。尽管3t3wt细胞在山梨醇刺激后显示pjnk水平的预期增加，但mkk7-/-和mkk4/7-/-细胞两者均显示降低的pjnk水平。此外，根据本发明的实施方案，在用抑制剂预孵育后，3t3wt细胞显示浓度依赖性抑制，具有以下ic50值：go4＝18.2μm，go32＝5.15μm，go37＝5.33μm，go80＝4.05μm。用本文所述抑制剂处理任一种敲除细胞对其pjnk水平没有影响，这保持在降低的基线，这表明mkk7确实介导化合物的jnk磷酸化抑制。
抑制剂对激酶组具有选择性：
为了评估本文提供的抑制剂对激酶组的选择性，针对1μm的go32和go80测定76种激酶的激酶组的组。go32和go80抑制剂两者都表现出显著的选择性，在该浓度下，非常少的激酶被抑制超过75％，例如aurora激酶b、lrrk2和mkk4，以及flt3对于go80和jak3对于go32(参见下表6)。
表6
发现go32和go80是mkk4的弱抑制剂，其不含有mkk7的相应半胱氨酸218，分别表现出4.15μm和7.81μm的ic50。而go37对mkk7完全特异性，高达10μm时没有可检测的mkk4抑制。
还注意到，chang的研究中公开的go32对mkk7比对aurora激酶(微摩尔水平)更有效(纳摩尔水平)和更具特异性至少两个数量级。因此，根据本发明的一些实施方案，本文提供的化合物的特征在于，与对aurora激酶的抑制作用相比，对mkk7的抑制作用高两个数量级。
mkk7-go80共晶结构验证对接预测；
为了阐明化合物的结合模式并评价对接预测，获得了与本文提供的一些抑制剂化合物形成复合物的mkk7晶体结构；例如，mkk7与go80的复合晶体结构(pdbid5z1d)，以及更稳定的cys218ser突变体与go80复合的复合晶体结构(pdbid5z1e)。
如晶体结构中所揭示的，go80的结合模式紧密地概括了具有
cys218ser突变体的晶体结构在形成共价键之前捕获化合物的可逆相遇复合物。未反应的丙烯酰胺cβ原子与ser218oγ在的惊人距离内
有趣的是，对接筛选是针对mkk7(pdbid2dyl)的dfg-in构象进行的，并且共价复合物实际上以相同构象结晶。令人惊讶的是，cys218ser突变体以dfg-out构象结晶，表明可能由于其小尺寸go80可以结合两种构象。
代谢稳定性：
为了证明本文提供的化合物在体内模型中的效用，根据本发明的实施方案，在来自若干物种的肝微粒体中建立了一些示例性化合物的体外代谢稳定性，所述物种包括小鼠、大鼠、狗、猴和人(参见下表7)。在本研究中使用参照化合物ref1250：
表7
如表7所示，本文提供的具有相对低的clogp的化合物表现出显著的稳定性。例如，clogp＝1.91和3.17的go55和go83在大鼠微粒体中分别显示半衰期为29和35分钟。
基于结构的优化产生新的向量：
基于上述复合物的晶体结构和测定，合成了另一系列以低clogp值为特征的类似物(参见上表3)。确定三种化合物的代谢稳定性，即pcm75、pcm76和pcm87，这些疏水性较小的抑制剂的稳定性显著增加，在狗和大鼠微粒体中半衰期超过40分钟，特别是对于pcm76和pcm87，在人微粒体中的显著的稳定性分别超过40分钟和27分钟。
就活性而言，哌啶抑制剂pcm531和pcm532在3t3细胞中的icw中被证明是无活性的，羧酸pcm76也是无活性的，这可能是由于低渗透性。其酰胺对应物pcm87，活性显著改善(ec50＝4.06μm)。这些结果表明，如在pcm548中那样放置炔官能团可能对于本文提供的抑制剂的蛋白质组选择性是有用的。
抑制剂在蛋白质组中是选择性的：
为了建立炔官能团在pcm548中的靶接合，将pcm548在过表达mkk7催化结构域的细菌裂解物中孵育。在室温下孵育2小时后，使用铜催化的与5'-tamra-叠氮化物的环加成(“点击”化学)来荧光标记pcm548的靶，随后在sds-page凝胶上成像。pcm548清楚地标记了低至0.4μm浓度的mkk7(结果未显示)。此外，当与裂解物预孵育时，go32和go80都能够竞争pcm548的结合(结果未显示)。
在人细胞裂解物(mda-mb-231)中评估pcm548的蛋白质组选择性。尽管mkk7的低内源性表达，但观察到剂量依赖性条带，其对应于用至多2μmpcm548可检测的mkk7的分子量。虽然10μmpcm548标记许多蛋白质，但5μmmkk7似乎是主要的靶标，而在2μm似乎是唯一靶标。
化合物阻断原代小鼠b细胞的活化：
已知jnk通过tlr4信号传导通路响应脂多糖(lps)以及响应b细胞受体活化(例如用抗igm抗体刺激)来介导b细胞的活化。从小鼠的脾脏分离原代b细胞，并通过facs分析cd86+表达，评估其b细胞活化，所述分析是在存在或不存在本文呈现的共价mkk7酶抑制剂以及阳性对照jnk抑制剂jnk-in-8的情况下响应lps进行的。
在刺激前10μm和2小时预孵育时，go80能够抑制60％的cd86+应答。pcm75、pcm87和pcm548与jnk-in-8一样有效，并且抑制接近90％的应答。在此注意到，非共价对照在相同浓度下仅抑制26％的响应。对三种最好的抑制剂进行全剂量反应的跟踪，其中pcm87和pcm548显示ic50分别为4.9μm和5.3μm，类似于它们在3t3细胞中响应山梨醇抑制pjnk的ic50。
尽管已经结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但是显然，许多替换、修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。因此，本发明旨在包括所有这些落入所附权利要求的精神和宽范围内的替代、修改和变化。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用整体并入本说明书，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指示通过引用并入本文中。此外，本申请中任何参考文献的引用或标识不应被解释为承认这些参考文献可作为本发明的现有技术。就使用部分标题来说，它们不应被解释为必然是限制性的。
此外，本申请的任何(一个或多个)优先权文件在此通过引用整体并入本文。
起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】
与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。
此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除
热门咨询
