一种核酸识别的AIE探针及其制备方法与应用与流程

2021-02-02 17:02:09|

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本发明涉及荧光探针技术领域，尤其涉及一种核酸识别的aie探针及其制备方法与应用。

背景技术：

核酸包括核糖核酸和脱氧核糖核酸，是细胞内重要的生物大分子，在储存遗传信息和调控生命活动中扮演着重要的角色。对核酸的检测和定位在生物诊断中十分重要。传统的核酸染料，如溴化乙锭可以通过嵌入dna双链结构或具有高级结构的单链rna实现核酸染色。溴化乙锭与核酸结合能力强、荧光信号稳定，是最广泛使用的核酸染料，但因其改变dna结构而产生的潜在致癌性一直备受争议。其他用于细胞成像的荧光染料如dapi(4，6-联脒-2-苯基吲哚)也存在类似的问题，并且dapi染料容易淬灭，在常规染色中需要加入特殊的防淬灭剂。

利用聚集诱导发光(aie)材料设计的探针由于其特殊光学性质---在聚集态下荧光急剧增强，相比于聚集淬灭(acq)荧光探针更有利于生物成像。如四苯基乙烯(tpe)是一种典型的aie分子，由碳-碳双键中心与四个外围苯环组成。当其运动被受阻后，荧光会显著增强。因此，当tpe与靶标物质结合产生荧光时，可依据荧光强度初步判断靶标物的浓度。多项研究均证明tpe及其衍生物对细胞无毒，因此在生物检测中可被广泛应用。目前为止，还未见过报道具有直接核定位效应兼具体外核酸检测能力的核苷-aie荧光探针。

技术实现要素：

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种核酸识别的aie探针及其制备方法与应用，旨在解决现有核酸探针对细胞具有毒性、在聚集态下荧光淬灭的问题。

本发明的技术方案如下：

本发明的第一方面，提供一种核酸识别的aie探针，其中，所述aie探针的结构通式如式(i)、(ii)和(iii)中的一种所示：

式(i)、(ii)和(iii)中，r独立地为a、t、c、g、u中的一种。

可选地，式(i)、(ii)和(iii)中，r独立地为c、u中的一种。

本发明的第二方面，提供一种本发明所述的核酸识别的aie探针的制备方法，其中，包括步骤：

在钯(膦)催化下，5-碘-脱氧核苷与4-乙炔基-四苯乙烯发生偶联反应，得到产物。

可选地，所述的核酸识别的aie探针的制备方法，包括步骤：在钯(膦)催化下，5-碘-2-脱氧胞嘧啶和4-乙炔基-四苯乙烯发生偶联反应，得到2′-脱氧-5-三苯乙烯基苯-邻乙炔基胞嘧啶；

上述化学反应式如下所示：

可选地，所述的核酸识别的aie探针的制备方法，具体包括步骤：将5-碘-2-脱氧胞嘧啶、4-乙炔基-四苯乙烯、四三苯基膦钯和碘化亚铜混合，加入无水dmf溶解，然后加入三乙胺，在搅拌下发生偶联反应，得到2′-脱氧-5-三苯乙烯基苯-邻乙炔基胞嘧啶。

可选地，所述的核酸识别的aie探针的制备方法，包括步骤：在钯(膦)催化下，5-碘-2-脱氧尿嘧啶和4-乙炔基-四苯乙烯发生偶联反应，得到2′-脱氧-5-三苯乙烯基苯-邻乙炔基尿嘧啶；

上述化学反应式如下所示：

可选地，所述的核酸识别的aie探针的制备方法，具体包括步骤：将5-碘-2-脱氧尿嘧啶、4-乙炔基-四苯乙烯、四三苯基膦钯和碘化亚铜混合，加入无水dmf溶解，然后加入的三乙胺，在搅拌下发生偶联反应，得到2′-脱氧-5-三苯乙烯基苯-邻乙炔基尿嘧啶。

本发明的第三方面，提供一种本发明所述的aie探针在核酸检测中的应用。

本发明的第四方面，提供一种本发明所述的aie探针在细胞核定位中的应用。

本发明的第五方面，提供一种本发明所述的核酸识别的aie探针在细胞成像中的应用。

有益效果：本发明的aie探针是一类新型的核糖核酸选择性识别的荧光探针，该aie探针穿透细胞后可以与细胞核结合，因为聚集诱导发光原理而发出蓝色荧光，该荧光具有化学稳定、非淬灭和生物兼容性好的优点。可广泛用于核酸检测、细胞成像、以及其它相关的生物检测。

附图说明

图1中a为2′-脱氧-5-三苯乙烯基苯-邻乙炔基胞嘧啶(dc-tpe)的化学反应式，b为2′-脱氧-5-三苯乙烯基苯-邻乙炔基尿嘧啶(du-tpe)的化学反应式。

图2为dc-tpe探针的¹h-nmr图谱。

图3为du-tpe探针的¹h-nmr图谱。

图4为5μm浓度的dc-tpe和du-tpe体系下，不同浓度ctdna的荧光光谱图及浓度对应荧光值的非线性拟合图。

图5为10μm浓度的dc-tpe和du-tpe染色后，不同浓度0，10，25，50，100ng的人体组蛋白h3原生态基因dna的page凝胶电泳图。

图6为5μm浓度的dc-tpe和du-tpe体系下，不同浓度酵母核糖核酸的荧光光谱图及浓度对应荧光值的非线性拟合图。

图7为5μm浓度的dc-tpe和du-tpe染色后，l929细胞激光共聚焦图(发射波长em:470nm；激发波长ex:375nm)。

图8为不同浓度的dc-tpe和du-tpe对细胞存活性的影响示意图。

具体实施方式

本发明提供一种核酸识别的aie探针及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种核酸识别的aie探针，该aie探针不仅在体外能特异性与dna或rna结合，而且能顺利穿过细胞膜作用于活细胞，定位到细胞核区域。在375nm激发光下，于470nm处有最大发射光谱。该类探针对活细胞无明显毒性，是一种具有实际应用潜力的活细胞探针。其中，所述aie探针的结构通式如式(i)、(ii)和(iii)中的一种所示：

式(i)、(ii)和(iii)中，r独立地为a、t、c、g、u中的一种，即r独立地为任意碱基。

本发明实施例的aie探针是一类新型的核糖核酸选择性识别的荧光探针，该aie探针穿透细胞后可以与细胞核结合，因为聚集诱导发光原理而发出蓝色荧光，该荧光具有化学稳定、非淬灭和生物兼容性好的优点。具有可广泛用于核酸检测、细胞成像、以及其它相关的生物检测的应用潜力。

在一种实施方式中，式(i)、(ii)和(iii)中，r独立地为c、u中的一种。

本发明的第二方面，提供一种本发明所述的核酸识别的aie探针的制备方法，其中，包括步骤：

在钯(膦)催化下，5-碘-脱氧核苷与4-乙炔基-四苯乙烯发生偶联反应，得到产物。

上述化学反应式如下所示：

本发明实施例提供一种如上所述的aie探针在核酸检测中的应用。在体外进行的核酸染色实验表明，aie探针对dna和rna均有染色作用，随体系中核酸浓度升高，荧光强度增强；dna、rna的page凝胶染色结果也证明了该结论。

本发明实施例提供一种如上所述的aie探针在细胞核定位中的应用。将本发明实施例的aie探针应用在细胞染色中，标记后的激光共聚焦图像显示，aie探针主要定位在细胞核中，少量定位在细胞质中。

本发明实施例提供一种如上所述的核酸识别的aie探针在细胞成像中的应用。本发明实施例的aie探针具有较好的核酸识别性，可直接用于活细胞成像，具有稳定的荧光信号。荧光信号随核酸浓度增大而增强，可用于核酸诊断。由于所述aie探针采用天然核糖核酸骨架，也可以进一步用于其它功能修饰，获得具有特定功能性的aie荧光探针。

下面通过具体的实施例对本发明作进一步地说明。

实施例1

2′-脱氧-5-三苯乙烯基苯-邻乙炔基胞嘧啶(dc-tpe)探针的制备

取5-碘-2-脱氧胞嘧啶211mg(0.6mmol,1当量)，4-乙炔基-四苯乙烯320mg(0.9mmol,1.5当量)，四三苯基膦钯69.3mg(0.06mmol,0.1当量)和碘化亚铜22.8mg(0.12mmol,0.2当量)于100ml双口瓶中，加入10ml无水dmf溶解，然后加入0.3ml的三乙胺，室温搅拌反应12小时。反应结束后，将反应体系进行浓缩和旋干处理，通过柱层析得到目标产物。图1中(a)为目标产物的化学反应式，图2为目标产物的¹hnmr图。

实施例2

2′-脱氧-5-三苯乙烯基苯-邻乙炔基尿嘧啶(du-tpe)探针的制备

取5-碘-2-脱氧尿嘧啶218mg(0.6mmol,1当量)，4-乙炔基-四苯乙烯320mg(0.9mmol,1.5当量)，四三苯基膦钯69.3mg(0.06mmol,0.1当量)和碘化亚铜22.8mg(0.12mmol,0.2当量)于100ml双口瓶，加入10ml无水dmf溶解，然后加入0.3ml的三乙胺，室温搅拌反应12小时。反应结束后，将反应体系进行浓缩和旋干处理，通过柱层析得到目标产物。图1中(b)为目标产物的化学反应式，图3为目标产物的¹hnmr图。

实施例3

dc-tpe探针和du-tpe探针在ctdna检测中的应用

称取一定量的ctdna冻干粉，溶于pbs(ph7.0)，设定位于0-48ng/μl区间的12个浓度，浓度间隔梯度为4ng/μl。加入100倍浓度的dc-tpe和du-tpe探针母液(溶于dmso)于上述dna体系中，调节其浓度为5μm。设定激发波长为375nm，扫描375nm-640nm区间的相对荧光值，并拟合最大发射波长下荧光光度值与浓度之间的相关性。图4为5μm的dc-tpe和du-tpe体系下，不同浓度ctdna的荧光光谱图及浓度与光度的拟合曲线。其中，图4中a和b为5μm浓度的dc-tpe体系下，0-48ng/μl的ctdna在375nm激发光下的荧光光谱扫描图及浓度对应荧光值的非线性拟合图。图4中c和d为5μm浓度的du-tpe体系下，0-48ng/μl的ctdna在375nm激发光下的荧光光谱扫描图及浓度对应荧光值的非线性拟合图。

实施例4

dc-tpe和du-tpe探针在dna的page凝胶(聚丙烯酰胺凝胶)检测中的应用

使用方法同eb核酸染料。配制100倍浓度dc-tpe和du-tpe探针母液(溶于dmso，1mm)，将电泳完全后的page凝胶浸泡于加入探针的tbe缓冲液中，在摇床上染色40分钟，再直接放入凝胶成像仪中进行成像分析。图5中a为10μm浓度的dc-tpe染色后，在不同浓度0，10，25，50，100ng的人体组蛋白h3原生态基因dna的page凝胶电泳图。图5中b为10μm浓度的du-tpe染色后，在不同浓度0，10，25，50，100ng的人体组蛋白h3原生态基因dna的page凝胶电泳图。

实施例5

dc-tpe和du-tpe探针在rna检测中的应用

称取一定量的酵母核糖核酸冻干粉，溶于pbs(ph7.0)，设定位于0-400μg/μl区间的12个浓度，浓度间隔梯度为20μg/μl。加入100倍浓度的dc-tpe和du-tpe探针母液于上述rna体系中，调节探针浓度为5μm。设定激发波长为375nm，扫描375nm-640nm区间的相对荧光值，并拟合最大发射波长下荧光光度值与浓度之间的相关性。图6为5μm浓度的dc-tpe和du-tpe体系下，不同浓度rna的荧光光谱图及浓度与光度的拟合曲线。其中，图6中a和b为5μm浓度的dc-tpe体系下，0-200μg/μl的酵母核糖核酸在375nm激发光下的荧光光谱扫描图及浓度对应荧光值的非线性拟合图。图6中c和d为5μm浓度的du-tpe体系下，0-400μg/μl的酵母核糖核酸在375nm激发光下的荧光光谱扫描图及浓度对应荧光值的非线性拟合图。

实施例6

dc-tpe和du-tpe探针在活细胞成像中的应用

将含有dc-tpe和du-tpe探针的dmso溶液加入pbs(ph7.0)配制成浓度为5μm的溶液，将培养好的l929细胞用多聚甲醛进行固定，漂洗三次后，加入含探针的pbs溶液进行染色，为保证染色效果，可放置过夜。通常染色4小时可以达到很好的染色效果。将染色液除去，干片后直接用于荧光显微镜及激光共聚焦观察(发射波长em:470nm；激发波长ex:375nm)，细胞核染色效果明显。图7为5mm的dc-tpe和du-tpe染色后，l929细胞激光共聚焦图(em:470nm；ex:375nm)。图7中a、b、c分别为经dc-tpe染色后的l929细胞明场图，375nm激发光下的荧光成像效果，以及荧光图和明场图的合并效果，可以看到l929细胞的核区域有明显的蓝色激发光，表明dc-tpe有较好的核定位及成像效果。图7中d、e、f分别为经du-tpe染色后的l929细胞明场图，375nm激发光下的荧光成像效果，以及荧光图和明场图的合并效果，可以看到l929细胞的核区域有较为明显的蓝色激发光，表明du-tpe有较好的核定位及成像效果，但相同浓度下，du-tpe的核定位及染色效果不及dc-tpe。mtt实验检测，合成的dc-tpe和du-tpe探针对l929和hek细胞均无明显的细胞毒性。图8为mtt检测不同浓度的dc-tpe和du-tpe对l929细胞存活性的影响，当两种探针的浓度达到20μm的较高浓度时，细胞存活率仍然在90％以上，而通常情况下，活细胞处理只需要5-10μm浓度，细胞存活率大于95％，表明两种探针对细胞均无明显毒性作用。

综上所述，本发明提供一种核酸识别的aie探针及其制备方法与应用。本发明提供一种具有核酸亲和性的aie探针，所述aie探针是一类新型的核糖核酸选择性识别的荧光探针，该aie探针穿透细胞后可以与细胞核结合，因为聚集诱导发光原理而发出蓝色荧光，该荧光具有化学稳定、非淬灭和生物兼容性好的优点。可广泛用于核酸检测、细胞成像、以及其它相关的生物检测。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

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