一种同材料双发射比率荧光探针的制备方法及其应用与流程

本发明属于荧光传感
技术领域：
，具体涉及一种g-cdte/r-cdteqds比率荧光探针的制备方法和应用。
背景技术：
：汞是一种剧毒非必需元素，可以在生物体内积累，很容易被皮肤以及呼吸道和消化道吸收。由于汞可以在水体、土壤、大气和生物圈中迁移和转化，形成完善的循环从而广泛地存在于各类环境介质和食物链中，尤其是鱼、贝类，其踪迹遍布全球各个角落。虽然微量的液体汞吞食一般不会造成严重的中毒反应，但汞蒸气和汞盐都是剧毒的，口服、吸入或接触后可以损害中枢神经系统和肝脏，长时间暴露在高汞环境中可以导致脑损伤和死亡，而最危险的是汞有机化合物二甲基汞，仅接触在皮肤上几微升就可以致死。因此，对环境、食品和药物中的汞含量进行监测，谨防汞超标，有着非常重要的刻不容缓的现实意义。在重金属汞离子的检测方面，传统检测方法如如原子吸收光谱法(aas)，原子发射光谱法(aes)，冷原子荧光光谱法(cv-afs)，电感耦合等离子体-质谱(icpms)和质谱(ms)等，虽然灵敏度和精确度高，但是却存在着检测耗时长、仪器成本高、检测方法复杂而需要专业人员操作等弊端。针对传统检测方法存在的问题，目前对于重金属检测的研究热点主要集中在新型快检方法开发方面。根据已有报道，现在的新型快检方法主要是采用以金属卟啉、贵金属纳米簇及量子点等纳米材料制作的传感器，根据其颜色或荧光强度信号的变化，来对检测目标进行定性和定量检测。然而单一的检测信号容易受到环境中温度、湿度及检测材料的浓度等因素的影响导致检测结果准确度低，另外，由于复杂基质中干扰物质的存在，导致传感器检测目标物时往往需要加入掩蔽剂来提高对目标物的选择性。针对以上问题，本发明采用比率荧光探针作为检测材料，通过采用两个检测信号的比值抵消多种因素的干扰，使其具有内置校准的功能，提高传感器的稳定性和抗干扰性，另外，本发明利用g-cdteqds和r-cdteqds均能对不同种类重金属产生特异性响应，将g-cdtdqds和r-cdteqds的荧光强度比值即i513/i595作为检测指标，可以显著提高该比率荧光探针对hg2+的特异性和灵敏度。现有的比率荧光探针以仅含单个检测荧光团的类型为主，这类比率荧光探针虽然由于含有一个参比荧光团而提高了探针的抗干扰能力，检测结果精确度高，然而由于参比荧光团对各类金属离子均无响应，因此在对金属的灵敏度和特异性检测性能方面仍然具有一定的局限性。技术实现要素：本发明的目的在于公开了一种同材料双发射比率荧光探针g-cdteqds/r-cdteqds的制备方法及其在检测hg2+方面的应用。为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种同材料双发射比率荧光探针g-cdteqds/r-cdteqds的制备方法，具体步骤如下：1)制备绿色荧光团g-cdteqds：将水合氯化镉(cdcl2·2.5h2o)与n-乙酰-l-半胱氨酸(nac)按照摩尔比为5∶3～9溶于适量的超纯水中，将此溶液在1000rpm的转速下常温搅拌15min，然后用浓度为1m的naoh将此溶液的ph值调节至8.5～10。在冰浴中以1000rpm的转速磁力搅拌下，向溶液中通入氮气且保持20min，然后加入适量的na2teo3，持续通入氮气15min，再加入适量nabh4，持续通入10min氮气，最后将溶液转移至油浴锅中，在1000rpm的转速下80～150℃的油浴条件下回流反应20～50min，将所制备的产物过滤、透析，得到浓度为2.2×10-6g·l-1绿色荧光团g-cdteqds溶液，置于4℃冰箱中冷藏保存，备用；2)制备红色荧光团r-cdteqds：将水合氯化镉(cdcl2·2.5h2o)与n-乙酰-l-半胱氨酸(nac)按照摩尔比为5∶3～9溶于适量的超纯水中，将此溶液在1000rpm的转速下常温搅拌15min，然后用浓度为1m的naoh将此溶液的ph值调节至8.5～10。在冰浴中以1000rpm的转速磁力搅拌下，向溶液中通入氮气且保持20min，然后加入适量的na2teo3，持续通入氮气15min，再加入适量nabh4，持续通入10min氮气，最后将溶液转移至油浴锅中，在1000rpm的转速下80～150℃的油浴条件下回流反应15～30h，将所制备的产物过滤、透析，得到浓度为6.7×10-6g·l-1红色荧光团r-cdteqds溶液，置于4℃冰箱中冷藏保存，备用；3)制备g-cdte/r-cdteqds比率荧光探针：分别取1)中制备的g-cdteqds和2)中制备的r-cdteqds，按照体积比为1～4∶1直接混合在一起，制备成g-cdte/r-cdteqds比率荧光探针，将其置于4℃冰箱中冷藏保存。进一步地，步骤1)中所述的cdcl2·2.5h2o∶nac∶na2teo3∶nabh4＝5∶5～8∶1∶3，将溶液的ph调节至8.5～9.5，回流温度优选为80～120℃，回流时间优选为20～40min。进一步地，步骤2)中所述的cdcl2·2.5h2o∶nac∶na2teo3∶nabh4＝5∶5～8∶1∶3，将溶液的ph调节至8.5～9.5，回流温度优选为80～120℃，回流时间优选为18～25h。进一步地，步骤3)所述制备比率荧光探针所取的g-cdteqds与r-cdteqds的体积比为1～3∶1。上述方案中制备的g-cdteqds/r-cdteqds比率荧光探针在检测hg2+方面的应用，具体检测方法为：在g-cdte/r-cdteqds比率荧光探针中加入ph＝8、浓度为10mm的tris-hcl缓冲溶液，然后加入不同浓度的hg2+待测液，在340nm激发波长下，使用荧光分光光度计的fluorescence模式进行检测，记录450～660nm范围内的荧光发射光谱，得到荧光强度比值i513/i595与hg2+浓度的关系。优选地，所述g-cdte/r-cdteqds比率荧光探针与tris-hcl缓冲溶液的体积比为1∶4～6，检测体系中hg2+的最终浓度为40～500nm与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)本发明的比率荧光探针的两个荧光团均由相同的材料、相同的方法合成，仅需控制不同的回流时间。(2)本发明的比率荧光探针将两种量子点按一定比例混合即可制备，无需偶联或者物理包埋，制备方法简单。(3)本发明比率荧光探针对汞离子灵敏度高并显著提高了对汞离子的特异性。附图说明图1为本发明制备的g-cdte/r-cdteqds比率荧光探针制备及其检测hg2+的机理图。图2为本发明制备的g-cdte/r-cdteqds比率荧光探针的透射电镜图。图3为r-cdteqds的紫外吸收图谱和g-cdteqds的荧光发射谱图(激发波长为340nm)。图4为本发明制备的g-cdte/r-cdteqds的傅立叶变换中红外光谱图。图5为g-cdte/r-cdteqds加入不同浓度hg2+(0～500nm)后的紫外-可见吸收光谱图。图6g-cdte/r-cdteqds加入hg2+前后的荧光寿命表征图。图7为本发明制备的g-cdte/r-cdteqds中加入不同浓度的hg2+(0～500nm)后的荧光猝灭光谱图。图8为本发明制备的g-cdte/r-cdteqds中加入不同浓度的hg2+(40～500nm)后荧光强度比值i513/i595与hg2+浓度的关系图(i513为猝灭后g-cdteqds的荧光强度，i595为猝灭后r-cdteqds的荧光强度)。图9为本发明制备的g-cdteqds和r-cdteqds单量子点对不同金属的响应效果图(其中cr3+、hg2+、ag+、pb2+、cu2+、mn2+、ni2+、co2+的浓度为5μm，其他离子浓度为10μm)。图10为本发明制备的g-cdte/r-cdteqds对检测hg2+的选择性结果图(其中hg2+、mn2+、ni2+、co2+的浓度为5μm，其他离子浓度为10μm)。具体实施方式为了更好地理解本发明，下面通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围不仅仅局限于下面的实施例。以下实施例中，运用f-7000荧光分光光度计测定样品荧光强度，测定条件为：在最佳激发波长340nm下记录450nm-660nm范围内的荧光强度，测定样品溶液体系的体积为1ml。所得比率荧光探针的猝灭机制通过紫外光谱(uv-1800pc紫外可见光谱仪(上海美谱达仪器有限公司)和稳态-瞬态荧光光谱仪(edinburgh)进行测试。实施例1本实施例提供了g-cdte/r-cdteqds比率荧光探针的制备方法，具体步骤包括：1)制备绿色荧光团g-cdteqds：称取0.1142g水合氯化镉(cdcl2·2.5h2o)与0.0979gn-乙酰-l-半胱氨酸(nac)溶于40ml超纯水中，将此溶液在1000rpm的转速下常温搅拌15min，然后用浓度为1m的naoh将此溶液的ph值调节至9。在冰浴中以1000rpm的转速磁力搅拌下，向溶液中通入氮气且保持20min，然后加入0.0218gna2teo3，持续通入氮气15min，再加入0.0119gnabh4，持续通入10min氮气，最后将溶液转移至油浴锅中，在1000rpm的转速下90℃的油浴条件下回流反应30min，将所制备的产物过滤、透析，得到浓度为2.2×10-6g·l-1绿色荧光团g-cdteqds溶液，置于4℃冰箱中冷藏保存，备用；2)制备红色荧光团r-cdteqds：称取0.1142g水合氯化镉(cdcl2·2.5h2o)与0.0979gn-乙酰-l-半胱氨酸(nac)溶于40ml超纯水中，将此溶液在1000rpm的转速下常温搅拌15min，然后用浓度为1m的naoh将此溶液的ph值调节至9。在冰浴中以1000rpm的转速磁力搅拌下，向溶液中通入氮气且保持20min，然后加入0.0218gna2teo3，持续通入氮气15min，再加入0.0119gnabh4，持续通入10min氮气，最后将溶液转移至油浴锅中，在1000rpm的转速下90℃的油浴条件下回流反应22h，将所制备的产物过滤、透析，得到浓度为6.7×10-6g·l-1红色荧光团r-cdteqds溶液，置于4℃冰箱中冷藏保存，备用；3)制备g-cdte/r-cdteqds比率荧光探针：分别取1)中制备的g-cdteqds300μl和2)中制备的r-cdteqds150μl直接混合在一起，然后加入超纯水将混合液稀释定容至10ml，制备成g-cdte/r-cdteqds比率荧光探针，将其置于4℃冰箱中冷藏保存。结果分析：(一)g-cdte/r-cdteqds比率荧光探针表征分析：1、g-cdte/r-cdteqds的tem表征通过透射电镜对g-cdte/r-cdteqds比率荧光探针的形貌和大小进行表征，如图2所示，g-cdte/r-cdteqds比率荧光探针呈球形，均匀地分散在水溶液中，据图可以推测其平均尺寸约为3～4nm。2、单量子点的光学表征如图3所示，g-cdteqds的荧光发射光谱与r-cdteqds的紫外吸收光谱没有重叠，所以g-cdteqds和r-cdteqds之间不存在能量转移，g-cdteqds和r-cdteqds可以分别独立地与不同的重金属响应。3、g-cdte/r-cdteqds的中红外表征由图4(其中a、b、c三条谱线分别代表g-cdteqds、r-cdteqds和g-cdte/r-cdteqds)可知，g-cdteqds和r-cdteqds单量子点以及混合后的g-cdte/r-cdteqds比率荧光探针的表面官能团的种类基本相同，在3418cm-1处的拉伸振动表明了o-h和n-h的存在，3043cm-1处出现的峰是由于c-h的存在，在1713和1582cm-1分别显示了c＝o和c＝c的拉伸振动，在1357cm-1处的拉伸振动归属于coo-。这些富氧基团可以提高检测材料的分散性，稳定性和亲水性，另外，氨基和羧基的存在为g-cdte/r-cdteqds比率荧光探针与hg2+的特异性结合提供了可能。4、紫外表征用紫外分光光度计分别检测hg2+浓度为0nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm的六个检测体系，结果如图5所示，加入hg2+前后比率荧光探针的紫外光谱图几乎没有任何变化，由此可知比率荧光探针与hg2+之间无新的化合物生成，g-cdte/r-cdteqds与hg2+之间以静电力结合。5、荧光寿命表征由图6可知，比率荧光探针中加入hg2+前后的荧光寿命分别为29.86ns和23.38ns，即荧光寿命变短，因此，比率荧光探针与hg2+之间是动态猝灭。综上可以推断，该检测体系的检测机制是hg2+与g-cdte/r-cdteqds之间的电子转移，如图1所示。此外，由于g-cdteqds和r-cdteqds两种量子点的制备时间不同而引起的粒径、电子云分布状态以及氧化还原电位差异导致其与各类重金属的响应效果不同，从而增强g-cdte/r-cdteqds对hg2+的特异性。(二)g-cdteqds/r-cdteqds在检测hg2+方面的应用依次取100μl步骤3)中的g-cdte/r-cdteqds比率荧光探针溶液和500μl浓度为10mm的tris-hcl缓冲溶液加入石英皿中，再分别向石英皿中加入40μl、50μl、60μl、70μl、80μl、90μl浓度为10-5m的hg2+水溶液及20μl、30μl、40μl、50μl、60μl、70μl、80μl、90μl、100μl浓度为5×10-5m的hg2+水溶液，然后向石英皿中加入超纯水定容至1ml，最终体系中对应的hg2+水溶液的浓度分别为40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm、500nm。用荧光分光光度计分别检测对应体系的荧光强度，得到如图7所示的荧光光谱图。随着hg2+浓度的增加，比率荧光探针中在513nm处的g-cdteqds荧光强度逐渐降低，而在595nm处的r-cdteqds荧光保持不变。hg2+浓度在30～500nm范围内，i513/i595与logc(c表示检测体系中hg2+的浓度)呈线性关系，如图8所示，其线性关系为y＝-0.38logc+2.083，相关系数是0.997。根据检测限的计算公式lod＝3σ/s(σ为线性斜率，s重复测量后空白的标准偏差)得到该比率荧光探针的检测限为3.7nm。相对于单一荧光信号的基于碳点的hg2+传感器(lid.，wangs.，azadf.，etal.ecotoxicologyandenvironmentalsafety，2020，190：110141)其对hg2+的检测限为50nm以及仅有一个检测荧光团的比率荧光探针(liuw.，wangx.，wangy.，etal.sensorsandactuatorsb：chemical，2018，262：810-817)其对hg2+的检测限为8.7nm，本发明的比率荧光探针对hg2+的灵敏度更高。(三)g-cdte/r-cdteqds比率荧光探针检测hg2+的特异性依次取100μl步骤1)中的g-cdteqds溶液和500μl浓度为10mm的tris-hcl缓冲溶液加入石英皿中，再分别向石英皿中加入100μl浓度为100μm的zn2+、ba2+、al3+、k+、mg2+、fe2+、na+、cr6+、cd2+、ca2+、fe3+水溶液及浓度为50μm的pb2+、cr3+、hg2+、ag+、cu2+、co2+、mn2+、ni2+水溶液，然后向石英皿中加入超纯水定容至1ml，用荧光分光光度计分别检测对应体系的荧光强度，绘制以荧光强度为纵坐标，各种类金属离子为横坐标的柱状图，得到g-cdteqds单量子点检测hg2+的选择性结果图，如图9所示，此图表明将g-cdteqds对多种金属均有较强的响应效果，选择性差。依次取100μl步骤2)中的r-cdteqds溶液和500μl浓度为10mm的tris-hcl缓冲溶液加入石英皿中，再分别向石英皿中加入100μl浓度为100μm的zn2+、ba2+、al3+、k+、mg2+、fe2+、na+、cr6+、cd2+、ca2+、fe3+水溶液及浓度为50μm的pb2+、cr3+、hg2+、ag+、cu2+、co2+、mn2+、ni2+水溶液，然后向石英皿中加入超纯水定容至1ml，用荧光分光光度计分别检测对应体系的荧光强度，绘制以荧光强度为纵坐标，各种类金属离子为横坐标的柱状图，得到r-cdteqds单量子点检测hg2+的选择性结果图，如图9所示，此图表明将r-cdteqds对多种金属均有较强的响应效果，选择性差。依次取100μl步骤3)中的g-cdte/r-cdteqds比率荧光探针溶液和500μl浓度为10mm的tris-hcl缓冲溶液加入石英皿中，再分别向石英皿中加入100μl浓度为100μm的zn2+、ba2+、al3+、k+、mg2+、fe2+、na+、cr6+、pb2+、cr3+、cd2+、ca2+、mn2+、ni2+、fe3+水溶液及浓度为50μm的hg2+、ag+、cu2+、co2+水溶液，然后向石英皿中加入超纯水定容至1ml，用荧光分光光度计分别检测对应体系的荧光强度，绘制以i513/i595为纵坐标，各种类金属离子为横坐标的柱状图，得到比率荧光探针检测hg2+的选择性结果图，如图10所示，此图表明将g-cdteqds和r-cdteqds混合在一起制备成比率荧光探针，相较于单量子点对各金属离子的响应效果，根据两个量子点对各金属不同的响应效果，通过以g-cdteqds与r-cdteqds的荧光强度的比值i513/i595为检测指标，显著地提高了比率荧光探针对hg2+的选择性。(四)g-cdteqds/r-cdteqds在实际水样和生物基质中检测hg2+方面的应用使用标准加入法，在不同复杂基质(牛血清、绿茶和自来水)中加入不同浓度的hg2+，探究了复杂基质中不同浓度的hg2+(20nm、300nm、400nm)对比率荧光探针的响应效果并计算回收率。结果如表1所示，在不同的复杂基质中hg2+的回收率在90.2-104.3％的范围内，相对标准偏差(rsd)均不超过10％(n＝3)，说明本发明在实际应用中具有巨大的潜力。表1牛血清、绿茶和自来水样品中hg2+的回收结果samplesfoundaddedrecoveryrsd(nmol·l-1)(nmol·l-1)(％)(％，n＝3)bovineserum196.220098.13.1273.830091.33.2369.640092.41.1greentea206.6200103.33.6313.1300104.35.7385.040096.23.9tapwater198.320099.14.9301.7300100.63.6360.640090.24.2实施例2本实施例提供了g-cdte/r-cdteqds比率荧光探针的制备方法，具体步骤包括：1)制备绿色荧光团g-cdteqds：称取0.1142g水合氯化镉(cdcl2·2.5h2o)与0.049gn-乙酰-l-半胱氨酸(nac)溶于40ml超纯水中，将此溶液在1000rpm的转速下常温搅拌15min，然后用浓度为1m的naoh将此溶液的ph值调节至8.5。在冰浴中以1000rpm的转速磁力搅拌下，向溶液中通入氮气且保持20min，然后加入0.0218gna2teo3，持续通入氮气15min，再加入0.0119gnabh4，持续通入10min氮气，最后将溶液转移至油浴锅中，在1000rpm的转速下80℃的油浴条件下回流反应50min，将所制备的产物过滤、透析，得到浓度为2.7×10-6g·l-1绿色荧光团g-cdteqds溶液，置于4℃冰箱中冷藏保存，备用；2)制备红色荧光团r-cdteqds：称取0.1142g水合氯化镉(cdcl2·2.5h2o)与0.049gn-乙酰-l-半胱氨酸(nac)溶于40ml超纯水中，将此溶液在1000rpm的转速下常温搅拌15min，然后用浓度为1m的naoh将此溶液的ph值调节至8.5。在冰浴中以1000rpm的转速磁力搅拌下，向溶液中通入氮气且保持20min，然后加入0.0218gna2teo3，持续通入氮气15min，再加入0.0119gnabh4，持续通入10min氮气，最后将溶液转移至油浴锅中，在1000rpm的转速下80℃的油浴条件下回流反应30h，将所制备的产物过滤、透析，得到浓度为7.3×10-6g·l-1红色荧光团r-cdteqds溶液，置于4℃冰箱中冷藏保存，备用；3)制备g-cdte/r-cdteqds比率荧光探针：分别取1)中制备的g-cdteqds150μl和2)中制备的r-cdteqds150μl直接混合在一起，然后加入超纯水将混合液稀释定容至10ml，制备成g-cdte/r-cdteqds比率荧光探针，将其置于4℃冰箱中冷藏保存。此外，按照实施例1中的方法对所制备的g-cdte/r-cdteqds进行tem、荧光光谱、中红外、紫外和荧光寿命表征，表征结果显示本实施例所制备g-cdte/r-cdteqds的粒径约为3～4nm，该比率荧光探针包含了o-h、n-h、c-h、c＝o、c＝c和coo-等官能团，其中的富氧基团可以提高检测材料的分散性、稳定性和亲水性，另外，氨基和羧基的存在增强了g-cdte/r-cdteqds比率荧光探针与hg2+的特异性结合。此外，由于hg2+与g-cdte/r-cdteqds之间发生电子转移而引发荧光猝灭。综上，本实施例制备的g-cdte/r-cdteqds可用于对hg2+的特异性和高灵敏度检测。实施例3本实施例提供了g-cdte/r-cdteqds比率荧光探针的制备方法，具体步骤包括：1)制备绿色荧光团g-cdteqds：称取0.1142g水合氯化镉(cdcl2·2.5h2o)与0.1469gn-乙酰-l-半胱氨酸(nac)溶于40ml超纯水中，将此溶液在1000rpm的转速下常温搅拌15min，然后用浓度为1m的naoh将此溶液的ph值调节至10。在冰浴中以1000rpm的转速磁力搅拌下，向溶液中通入氮气且保持20min，然后加入0.0218gna2teo3，持续通入氮气15min，再加入0.0119gnabh4，持续通入10min氮气，最后将溶液转移至油浴锅中，在1000rpm的转速下150℃的油浴条件下回流反应20min，将所制备的产物过滤、透析，得到浓度为2.0×10-6g·l-1绿色荧光团g-cdteqds溶液，置于4℃冰箱中冷藏保存，备用；2)制备红色荧光团r-cdteqds：称取0.1142g水合氯化镉(cdcl2·2.5h2o)与0.1469gn-乙酰-l-半胱氨酸(nac)溶于40ml超纯水中，将此溶液在1000rpm的转速下常温搅拌15min，然后用浓度为1m的naoh将此溶液的ph值调节至10。在冰浴中以1000rpm的转速磁力搅拌下，向溶液中通入氮气且保持20min，然后加入0.0218gna2teo3，持续通入氮气15min，再加入0.0119gnabh4，持续通入10min氮气，最后将溶液转移至油浴锅中，在1000rpm的转速下150℃的油浴条件下回流反应15h，将所制备的产物过滤、透析，得到浓度为6.4×10-6g·l-1红色荧光团r-cdteqds溶液，置于4℃冰箱中冷藏保存，备用；3)制备g-cdte/r-cdteqds比率荧光探针：分别取1)中制备的g-cdteqds600μl和2)中制备的r-cdteqds150μl直接混合在一起，然后加入超纯水将混合液稀释定容至10ml，制备成g-cdte/r-cdteqds比率荧光探针，将其置于4℃冰箱中冷藏保存。此外，按照实施例1中的方法对所制备的g-cdte/r-cdteqds进行tem、荧光光谱、中红外、紫外和荧光寿命表征，表征结果显示本实施例所制备g-cdte/r-cdteqds的粒径约为3～4nm，该比率荧光探针包含了o-h、n-h、c-h、c＝o、c＝c和coo-等官能团，其中的富氧基团可以提高检测材料的分散性、稳定性和亲水性，另外，氨基和羧基的存在增强了g-cdte/r-cdteqds比率荧光探针与hg2+的特异性结合。此外，由于hg2+与g-cdte/r-cdteqds之间发生电子转移而引发荧光猝灭。综上，本实施例制备的g-cdte/r-cdteqds可用于对hg2+的特异性和高灵敏度检测。当前第1页1 2 3 

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