作为用于鉴定炎性免疫细胞，特别是CD8+记忆T细胞的表观遗传标志物的CXCR3的制作方法

本发明涉及用于特异性鉴定来自哺乳动物的包含免疫细胞(特别是cd8+效应t细胞和记忆t细胞、辅助性t(th)1细胞和自然杀伤t(nkt)细胞中的至少一种)的样品中c-x-c基序趋化因子受体3(cxcr3)免疫细胞亚群的方法(特别是体外方法)，其包括分析seqidno.1所示的哺乳动物cxcr3的基因区中至少一个cpg位置的表观遗传修饰/性质(包括甲基化状态)，其中当与其它免疫细胞(特别是cd8+效应t细胞和记忆t细胞、辅助性t(th)1细胞和自然杀伤t(nkt)细胞中的至少一种)相比时，所述基因区中所述至少一个cpg位置的脱甲基化或缺乏甲基化指示所述样品中所述cxcr3特异性免疫细胞亚群。根据本发明的分析可以在表观遗传水平上鉴定上述细胞，并将它们与复杂样品中的所有其它细胞(例如其它血液细胞或免疫细胞)区分开。本发明还提供了用于定量上述细胞(特别是在复杂样品中的上述细胞)的改进方法。所述方法可以在没有纯化和/或富集细胞的步骤的情况下进行，优选地在全血和/或非胰蛋白酶消化的组织中进行。

此外，本发明涉及用于进行上述方法的试剂盒及其各自的用途。本发明的一个目的是提供一种新的、更稳定的方法来定量检测和测量哺乳动物的任何实体器官、组织内的血液或体液中的cxcr3特异性免疫细胞亚群(如cd8+效应t细胞和记忆t细胞、辅助性t(th)1细胞和自然杀伤t(nkt)细胞)。

发明背景

cd8+记忆t细胞、辅助性t(th)1细胞和自然杀伤t细胞(nkt)是抗感染和抗癌t细胞的重要子集(参见，例如，samjit和khannakm，understandingmemorycd8+tcells.immunollett.2017年5月；185:32-39)。cd8+记忆t细胞可以细分为效应(cd3+、cd8+、cd45ra+、ccr7-、cd40l-)cd8+t细胞、效应记忆(cd3+、cd8+、cd45ra-、ccr7-、cd40l-)cd8+t细胞和中央记忆(cd3+、cd8+、cd45ra+、ccr7+、cd40l-)cd8+t细胞。辅助性t(th)1细胞是cd3+、cd4+、cd45ra-、ccr6-和cxcr3+，自然杀伤t细胞(nkt)是cd3+、cd8+、cd56+。

即使个体中几乎所有的细胞都含有完全相同的dna编码互补序列，高等生物体也必须在不同类型的组织中强加和维持不同模式的基因表达。大多数基因调控是暂时的，这取决于细胞的当前状态和外部刺激的变化。另一方面，持续调控是表观遗传学-可遗传调控模式的主要作用，所述表观遗传学-可遗传调控模式不改变dna的基本遗传编码。dna甲基化是表观遗传调控的典型形式；它用作细胞的稳定存储器，并在维持各种细胞类型的长期身份方面发挥关键作用。最近，发现了其它形式的表观遗传调控。除了“第五个碱基”5-甲基胞嘧啶(mc)之外，还可以发现第六个(5-羟甲基胞嘧啶，hmc)、第七个(5-甲酰基胞嘧啶，fc)和第八个(5-羧基胞嘧啶，cc)(michaelj.booth等人，quantitativesequencingof5-methylcytosineand5-hydroxymethylcytosineatsingle-baseresolutionscience，2012年5月18日，vol.336no.6083pp.934-937)。

所述dna修饰的主要靶标是两核苷酸序列胞嘧啶-鸟嘌呤(‘cpg位点’)；在本文中，胞嘧啶(c)可以进行简单的化学修饰以变成甲酰化的、甲基化的、羟甲基化的或羧基化的。在人类基因组中，cg序列比预期的稀少得多，除了在被称为“cpg岛”的某些相对密集的簇中。cpg岛经常与基因启动子相关，并且据估计超过一半的人类基因具有cpg岛(antequera和bird,procnatlacadsciusa90:11995-9,1993)。

dna的异常甲基化经常与从健康细胞到癌细胞的转化有关。在所观察到的效果中包括基因组范围的低甲基化、肿瘤抑制基因的增加的甲基化和许多致癌基因的低甲基化(例如，通过jones和laird，naturegenetics21:163-167,1999；esteller,oncogene21:5427-5440，2002；以及laird,naturereviews/cancer3:253-266，2003综述的)。已经认识到甲基化谱是肿瘤特异性的(即，特定基因或甚至单个cpg的甲基化模式中的变化是特定肿瘤类型的诊断)，并且现在存在对膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、食道癌、胃癌、肝癌、肺癌和前列腺癌的诊断标志物的广泛收集(例如，由laird,naturereviews/cancer3:253-266，2003概述的)。

对于最近所描述的胞嘧啶的修饰之一(5-羟甲基化)，显示了氧化性亚硫酸氢盐测序在cpg岛处作图和定量5hmc的效用(michaelj.booth等人，quantitativesequencingof5-methylcytosineand5-hydroxymethylcytosineatsingle-baseresolutionscience，2012年5月18日，vol.336no.6083pp.934-937)。在与转录调节子相关的cpg岛中和在长散在的核元件中发现高水平的5hmc。这提示这些区域可能在胚胎干细胞中经历表观遗传重编程。

wo2012/162660描述了使用dna甲基化阵列的方法，其被提供用于鉴定细胞或细胞混合物以及用于定量血液或组织中的细胞分布的改变，以及用于诊断、预测和治疗疾病状况，特别是癌症。该方法使用新鲜的和存档的样品。

kurachi等人(参见：kurachi等人，chemokinereceptorcxcr3facilitatescd8(+)tcelldifferentiationintoshort-livedeffectorcellsleadingtomemorydegeneration.jexpmed.2011年8月1日；208(8):1605-20.doi:10.1084/jem.20102101.epub2011年7月25日)公开了在早期扩增阶段中炎性刺激的强度在cd8(+)t细胞的效应细胞对记忆细胞命运决定中起关键作用。他们证明趋化因子受体cxcr3通过调控t细胞募集到抗原/炎症位点而参与促进cd8(+)t细胞对效应细胞命运而不是记忆细胞命运的定型。在全身性病毒或细菌感染后，cxcr3(-/-)抗原特异性cd8(+)t细胞的收缩显著减弱，导致完全功能记忆cd8(+)t细胞的大量积聚。感染后早期，cxcr3(-/-)抗原特异性cd8(+)t细胞未能聚集在脾脏中炎性细胞因子(如il-12和ifn-α)丰富的边缘区，因此接受相对较弱的炎性刺激。因此，与野生型cd8(+)t细胞相比，cxcr3(-/-)cd8(+)t细胞表现出cd25的暂时性表达并优先分化成记忆前体效应细胞。这一系列事件对于经由抑制cxcr3介导的t细胞迁移到发炎的微环境来产生增加数量的抗原特异性记忆cd8(+)t细胞的疫苗接种策略的发展具有重要的意义。

lleo等人(参见：lleo等人，dnamethylationprofilingofthexchromosomerevealsanaberrantdemethylationoncxcr3promoterinprimarybiliarycirrhosis)描述了在30名pbc患者和30名对照的研究中，原发性胆汁性肝硬化(pbc)严格地由cd4+、cd8+和cd14+细胞的x染色体甲基化图谱所定义。分离来自分选的cd4+、cd8+和cd14+亚群的基因组dna，超声处理并进行免疫沉淀以用于甲基化分析。将所有产物杂交到定制平铺的四重阵列，所述阵列含有通过ucsc注释的27,728个cpg岛和22,532个特征明确的refseq启动子区。此外，然后使用亚硫酸氢盐测序对来自pbc患者和对照的后续组的独立样品进行验证。因此，用来自所有对象的cdna样品通过定量实时pcr评估所选x连锁基因的表达水平。总共20个、15个和19个不同的基因启动子反映了pbc患者中cd4+t细胞、cd8+t细胞和cd14+细胞中dna甲基化的显著差异。有趣的是，cd8+t细胞中存在fundc2的过度甲基化和cd4+t细胞中存在cxcr3的显著脱甲基化，这与来自早期pbc患者的cd4+t细胞中cxcr3的表达水平成负相关。数据提供了可能作为自身免疫指标的具有表观遗传改变的一组基因，并且强调cxcr3在pbc的自然史中的作用。

考虑到上述情况，本发明的目的是提供基于dna甲基化分析作为优越的工具的改进的，特别是稳定的方法，以便更方便和可靠地检测、鉴定、辨别和定量cxcr3+特异性免疫细胞亚群(如cd8+记忆t细胞、辅助性t(th)1细胞和自然杀伤t细胞(nkt))。

本发明通过提供用于特异性鉴定来自哺乳动物的包含免疫细胞的样品中c-x-c基序趋化因子受体3(cxcr3)免疫细胞亚群的方法来解决上述目的，所述方法包括分析seqidno.1所示的哺乳动物cxcr3基因区中的至少一个cpg位置的甲基化状态，其中当与其它免疫细胞相比时，所述基因区中的所述至少一个cpg位置的脱甲基化或缺乏甲基化指示所述样品中的所述cxcr3特异性免疫细胞亚群。

优选的方法是，其中所述cxcr3特异性免疫细胞亚群包含cd8+效应t细胞和记忆t细胞、辅助性t(th)1细胞和自然杀伤t(nkt)细胞中的至少一种，并且是与除cd8+记忆t细胞或效应t细胞、辅助性t(th)1细胞和/或自然杀伤t(nkt)细胞之外的免疫细胞进行比较。所有经鉴定的细胞属于cxcr3+特异性免疫细胞亚群。

cxcr3能够调控白细胞运输。趋化因子与cxcr3的结合诱导各种细胞应答，最显著的是整联蛋白激活、细胞骨架改变和趋化性迁移。cxcr3配体相互作用吸引th1细胞并促进th1细胞成熟。作为趋化因子诱导的细胞脱敏(磷酸化依赖性受体内化)的结果，细胞应答通常快速且持续时间短。细胞应答在细胞内受体的去磷酸化和随后再循环至细胞表面后恢复。cxcr3的标志是其在体外培养的效应t细胞/记忆t细胞中和在存在于多种类型发炎组织中的t细胞中的显著表达；cxcr3在激活后在幼稚细胞上被快速诱导，并且优先在th1型cd4+t细胞和效应cd8+t细胞上保持高度表达。此外，cxcl9、cxcl10和cxcl11通常由炎性损伤中的局部细胞产生，这表明cxcr3及其趋化因子参与炎性细胞的募集。人cxcr3基因位于x染色体上；ensembl-id:ensg00000186810。

本发明还基于发明人惊奇地鉴定cxcr3基因区作为特异性表观遗传标志物，从而还允许特异性鉴定cxcr3特异性免疫细胞亚群，诸如cd8+记忆t细胞或效应t细胞、辅助性t(th)1细胞和/或自然杀伤t(nkt)细胞，以及所述分析的临床常规应用。

令人惊奇的是，亚硫酸氢盐可转化的和不可转化的胞嘧啶的区别模式特别并且甚至排他地限于seqidno.1所示的基因组区域，用于如使用seqidno.1所示的扩增子，并且特别是在seqidno.2和/或3所示的亚硫酸氢盐转化的序列中(用于amp3188的cpg转化序列和tpg转化的序列)所显示的cxcr3特异性免疫细胞亚群，特别是cd8+记忆t细胞或效应t细胞、辅助性t(th)1细胞和/或自然杀伤t(nkt)细胞。

发明人可以特异性地证明，在cd8+记忆t细胞或效应t细胞、辅助性t(th)1细胞和/或自然杀伤t(nkt)细胞中，所公开的cpg基序几乎被完全脱甲基化(即达到超过70％，优选80％，优选超过90％，最优选超过95％)，而相同的基序在非cd8+记忆t细胞或效应t细胞、非辅助性t(th)1细胞和/或非自然杀伤t(nkt)细胞中被完全甲基化。作为优选的实施方案，该方法提供了cd8+效应t细胞和记忆t细胞的鉴定，其中所公开的cpg基序被完全脱甲基化(即超过95％)。这允许区分和鉴定所述样品中所述cd8+效应t细胞和记忆t细胞与所有其它细胞。作为优选的实施方案，该方法还包括基于免疫细胞标志物cd4预先分选所述样品的步骤，和基于所述甲基化状态的分析特异性鉴定辅助性t(th)1细胞的后续步骤。

前述区域内的cpg基序的差异甲基化是鉴定cxcr3特异性免疫细胞亚群(如cd8+记忆t细胞或效应t细胞、辅助性t(th)1细胞和/或自然杀伤t(nkt)细胞)的有价值的工具，诸如在用于鉴定和定量自身免疫性疾病、移植排斥、癌症、过敏症、原发性和继发性免疫缺陷(如例如hiv感染和aids、移植物抗宿主病(gvh)、血液恶性肿瘤、类风湿性关节炎、多发性硬化)、或在任何可预见的诊断环境中与细胞毒性t细胞相关的免疫状态将需要或具有至少一些价值。该测定允许测量cxcr3特异性免疫细胞亚群(例如cd8+记忆t细胞或效应t细胞、辅助性t(th)1细胞和/或自然杀伤t(nkt)细胞)，而不需要纯化或任何染色程序。

根据本发明的方法的另一个优选方面还包括基于将所分析的区域中的所述甲基化频率的相对量与优选完全脱甲基化的对照基因(如例如gapdh)中的甲基化频率的相对量进行比较，对cxcr3特异性免疫细胞亚群的细胞(优选cd8+记忆t细胞或效应t细胞、辅助性t(th)1细胞和/或自然杀伤t(nkt)细胞)的相对量进行定量。因此，所述定量是基于如本文中所述和所分析的cxcr3的遗传区(例如seqidno.1)中的亚硫酸氢盐可转化dna与不可转化dna的比率来实现的。最优选的是cxcr3特异性免疫细胞亚群(特别是cd8+记忆t细胞或效应t细胞、辅助性t(th)1细胞和/或自然杀伤t(nkt)细胞)的相对量的定量是基于cxcr3的亚硫酸氢盐可转化dna的相对量和细胞非特异性基因(优选地被称为“对照基因”或“对照区”，如例如gapdh基因)的亚硫酸氢盐可转化dna的相对量的(优选平行或同时)分析。

在根据本发明的方法的另一个优选实施方案中，所述亚硫酸氢盐可转化性分析包括用至少一个合适引物对的引物扩增，所述引物对可以基于seqidno.1适当设计，优选为seqidno.4-9任一项所示的寡聚物。

与facs和mrna测量相比，使用根据本发明的方法，测量和分析可以在不依赖于纯化、储存的情况下进行，并且在一定程度上也可以进行组织质量的测量和分析。

优选地，扩增涉及聚合酶、pcr或化学扩增反应，或如下所述的本领域技术人员已知的其它扩增方法，例如在msp、重甲基(heavymethyl)、scorpion、ms-snupe、甲基化荧光检测(methyllight)、亚硫酸氢盐测序、焦磷酸测序、甲基特异性限制测定和/或数字pcr的上下文中(参见，例如kristensen和hansenpcr-basedmethodsfordetectingsingle-locusdnamethylationbiomarkersincancerdiagnostics,prognostics,andresponsetotreatmentclinicalchemistry55:81471–1483(2009))。

通过扩增，产生cxcr3基因区的扩增子，其是用于实施根据本发明方法的特别优选的“工具”。因此，如本文所述的seqidno.4至9中任一项所示的寡聚物或由基于seqidno.4和6或7和9所示的引物对扩增的扩增子构成本发明的优选实施方案。因此，seqidno.1所示的序列(以及，如果需要的话，与其互补的序列)可以被用于设计用于扩增的引物，即，作为相关序列中的“信标”。类似地，可以基于seqidno.1所示的扩增子设计另外的引物和探针。扩增可以在基因组和/或亚硫酸氢盐(即“转化的”)dna序列中进行。

本领域技术人员还将能够选择cpg位置的特定子集，以便最小化待分析的位点的量，例如选自seqidno.1所示的扩增子中的cpg位置的至少一个cpg位置，并且优选地选自seqidno.1所示的扩增子3188中的cpg位置34、71、77、102、130、150、163、170、184、224、227、235、278、299、305、337、379、390、407、419和429。优选的是3、4、5、6、7、8、9或10个位置的组合，其分析产生足够的数据和/或信息以便在本发明的上下文中提供信息。

本领域技术人员还将能够选择cpg位置的特定子集以便最小化待分析的位点的量，例如对于待鉴定的所有三种细胞类型，cpg位置71、77、102、130、150、163、170和184中的至少一个，或者对于特定亚硫酸氢盐可转化区域(seqidno.1)的扩增子第3188号中的cd8+t细胞，cpg位置224、227、235、278、299、305和337中的至少一个，或存在于seqidno.1所示的亚硫酸氢盐可转化区上的所有位点。可以排除amp3188中位置102和/或184中的一个或多个。

为了分析cpg位置的亚硫酸氢盐可转化性，可以使用任何已知的分析dna甲基化的方法。在根据本发明的方法的优选实施方案中，甲基化状态的分析包括选自甲基化特异性酶促消化、亚硫酸氢盐测序、焦磷酸测序的方法，选自启动子甲基化、cpg岛甲基化、msp、重甲基、甲基化荧光检测、ms-snupe的分析，以及依赖于扩增dna的检测的其它方法。这些方法是本领域技术人员熟知的，并且可以在相应的文献中找到。

在根据本发明的方法的优选实施方案中，所述方法适于常规应用，例如在dna芯片上。基于上述信息和相应的文献，本领域技术人员将能够将上述方法调整到此类设置中。

在根据本发明的方法的另一个优选实施方案中，所述方法在不进行纯化和/或富集待鉴定的所述细胞的步骤的情况下进行，优选使用全血和/或非胰蛋白酶消化的组织进行。

在根据本发明的方法的另一个优选实施方案中，所述鉴定包括所述cxcr3特异性免疫细胞亚群(特别是cd8+记忆t细胞和效应t细胞、辅助性t(th)1细胞和自然杀伤t细胞(nkt)，并且优选th1细胞、cd8+记忆t细胞和效应t细胞)与所有主要外周血细胞类型和/或非血细胞(优选地，但不限于，细胞毒性t细胞、粒细胞、单核细胞、b细胞、cd56++nk细胞和其它辅助性t细胞，以及衍生自除血液以外的其它器官的其它细胞类型)的区别。

在根据本发明方法的另一个优选实施方案中，样品选自哺乳动物体液，其包括人血液样品，或组织、器官或白细胞样品、或此类组织、器官或白细胞或细胞类型的样品的纯化或分离级分。优选地，所述哺乳动物是小鼠、山羊、狗、猪、猫、牛、大鼠、猴或人。如果需要，可以适当地合并样品。

根据本发明的方法的另一个优选方面还包括基于所鉴定的cxcr3特异性免疫细胞亚群(如cd8+记忆t细胞和效应t细胞、辅助性t(th)1细胞和自然杀伤t细胞(nkt)，优选所述cd8+记忆t细胞和效应t细胞)推断所述哺乳动物的免疫状态的步骤。这些细胞可以被定量并用作相对定量更详细的亚群的基准，或其可以被用作预测和/或筛查和/或诊断和/或预后和/或不良事件检测因子，或其可以被用于最终检测该群体以确定总体免疫活性状态。

在根据本发明的方法的另一个优选实施方案中，所述哺乳动物患有或可能患有自身免疫性疾病、移植排斥、传染性疾病、癌症和/或过敏症，例如但不限于克氏锥虫感染、疟疾和hiv感染；血液恶性肿瘤，例如但不限于慢性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、慢性淋巴细胞性白血病、移植物抗宿主和宿主抗移植物病、蕈样真菌病、结外t细胞淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤和其它t细胞、b细胞和nk细胞肿瘤，t细胞缺陷如但不限于淋巴细胞减少症、重症联合免疫缺陷(scid)、omenn综合征，软骨-毛发发育不全、获得性免疫缺陷综合征(aids)，和遗传病况如迪乔治综合征(dgs)、染色体断裂综合征(cbs)、多发性硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肖格伦综合征、系统性硬化、皮肌炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、银屑病、白癜风、大疱性类天疱疮、斑秃、特发性扩张性心肌病、1型糖尿病、格雷夫斯氏病、桥本氏甲状腺炎、重症肌无力、iga肾病、膜性肾病和恶性贫血；以及b细胞和t细胞组合病症，如但不限于共济失调毛细血管扩张(at)和wiskott-aldrich综合征(was)；以及癌症，如但不限于乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、胰腺癌、肝细胞癌、胆管癌、黑色素瘤和头颈癌。

然后根据本发明的方法的另一个优选方面涉及上述方法，其还包括测量和/或监测应答于提供给所述哺乳动物的化学和/或生物物质(即，应答于所述患者的治疗)的cxcr3特异性免疫细胞亚群(特别是cd8+效应t细胞和记忆t细胞、辅助性t(th)1细胞和自然杀伤t(nkt)细胞中至少一种)的量。所述方法包括上述步骤，并将所鉴定的所述细胞的所述相对量与从同一个哺乳动物中较早或平行获取的样品和/或对照样品进行比较。基于由本发明的方法提供的结果，主治医师将能够推断患者的免疫状态，并相应地调整潜在疾病的治疗。

优选地，所述方法在不进行纯化和/或富集细胞的步骤的情况下进行，优选在全血和/或非胰蛋白酶消化的组织中进行，或者可能含有所述cxcr3特异性免疫细胞亚群(例如作为例如用于细胞转移到患者体内的样品的cd8+效应t细胞和记忆t细胞、辅助性t(th)1细胞和自然杀伤t(nkt)细胞中的至少一种)的任何其它生物样品进行。

然后根据本发明的方法的另一个优选方面涉及上述方法，其还包括配制所鉴定的所述cxcr3特异性免疫细胞亚群(特别是cd8+效应t细胞和记忆t细胞、辅助性t(th)1细胞和自然杀伤t(nkt)细胞中的至少一种)以用于移植到患者体内。用于这些目的的药物制剂及其制备方法根据移植药物领域已知的方法进行。

根据本发明的方法的另一个优选方面涉及seqidno.4至9任一项所示的寡聚物，或seqidno.1至3任一项所示的扩增子。

本发明的另一个优选方面涉及用于基于cxcr3的基因区中的cpg位置的亚硫酸氢盐可及性分析鉴定、定量和/或监测哺乳动物中c-x-c基序趋化因子受体3(cxcr3)免疫细胞亚群的试剂盒，其包含用于进行如本文中所述的根据本发明的方法的组分，特别是包含a)亚硫酸氢盐试剂，和b)用于分析选自seqidno:1所示的区域中的cpg位置的cpg位置的甲基化状态的材料的试剂盒，所述材料为诸如选自seqidno:4至9所示的序列的寡聚物，所述c-x-c基序趋化因子受体3(cxcr3)免疫细胞亚群优选为cd8+效应t细胞和记忆t细胞、辅助性t(th)1细胞和自然杀伤t(nkt)细胞，更优选为cd4+th1细胞、或cd8+效应t细胞和记忆t细胞。

本发明还包括根据本发明的寡聚物或扩增子或试剂盒用于鉴定、定量和/或监测如本文中所述的哺乳动物中的c-x-c基序趋化因子受体3(cxcr3)免疫细胞亚群的用途，所述c-x-c基序趋化因子受体3(cxcr3)免疫细胞亚群优选为cd8+效应t细胞和记忆t细胞、辅助性t(th)1细胞和自然杀伤t(nkt)细胞，更优选为cd4+th1细胞、或cd8+效应t细胞和记忆t细胞。

如上所述，最近发现了三种新的胞嘧啶修饰。因此，预期未来的科学发现将校正过去所描述的修饰的表观遗传模式。这些过去的胞嘧啶修饰模式包括亚硫酸氢盐可转化的(非甲基化的，未修饰的)和不可转化的(甲基化的，修饰的)胞嘧啶。如上所述，两个末端都需要被校正。根据新的科学发现：(i)非亚硫酸氢盐可转化的胞嘧啶包括5-甲基胞嘧啶(mc)和5-羟甲基胞嘧啶(hmc)，和(ii)亚硫酸氢盐可转化的(即“亚硫酸氢盐可转化性”)胞嘧啶包括5-甲酰基胞嘧啶(fc)、5-羧基胞嘧啶(cc)以及未修饰的胞嘧啶。

另外，过去的发明基于：(i)亚硫酸氢盐可转化的胞嘧啶与染色质总量的比率(细胞类型独立的，100％亚硫酸氢盐可转化的dna基因座)或(ii)亚硫酸氢盐可转化的胞嘧啶(fc、cc、未修饰的胞嘧啶)与非亚硫酸氢盐可转化的胞嘧啶(hm和mc)的比率。这些比率表征细胞类型、细胞分化、细胞阶段以及病理学细胞阶段。因此，新技术将产生新的、更特异性的比率，并且可以补充当前的细胞特异性、细胞状态特异性以及表观遗传修饰的病理学模式，并且因此限定潜在的新生物标志物。作为生物标志物发现的新比率可以限定为：

生物标志物比率＝a/b

a＝∑(c和/或mc和/或hmc和/或fc和/或cc)

b＝∑(c和/或mc和/或hmc和/或fc和/或cc)，

其中a和b彼此不同的是一种至四种类型的修饰。发现新的dna修饰将扩大这种列举。

为了本申请的定义的目的，dna序列中的“表观遗传修饰”被称为以下的术语：(i)亚硫酸氢盐可转化的胞嘧啶(5-甲酰基胞嘧啶，(fc)和/或5-羧基胞嘧啶(cc))和(ii)非亚硫酸氢盐可转化的胞嘧啶(包括5-甲基胞嘧啶(mc)、5-羟甲基胞嘧啶(hmc))。由于两种甲基化mc和hmc都不是亚硫酸氢盐可转化的，因此不可能区分这两种甲基化。同样，fc、cc以及未修饰的胞嘧啶是亚硫酸氢盐可转化的，也不能相互区分。术语“甲基化的”dna包括mc以及hmc。术语“非甲基化的”dna包括fc、cc和未修饰的dna。预期dna修饰的新变体将在将来被发现。每种类型的修饰将是亚硫酸氢盐可转化的或不可转化的。然而，由于本方法可靠地区分两个组，因此这些新的修饰将也可以用作标志物。

此外，除了dna的修饰之外，组蛋白还经历了翻译后修饰，其改变了它们与dna以及核蛋白的相互作用。修饰包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、类泛素化、瓜氨酸化和adp-核糖基化。组蛋白h2a、h2b和h3的核心也可以被修饰。组蛋白修饰在多种生物学过程中起作用，如基因调控、dna修复、染色体浓缩(有丝分裂)和精子发生(减数分裂)。对于这些修饰，特定的修饰模式对于不同的细胞类型、细胞阶段、分化状态也是特异性的，并且可以分析亚硫酸氢盐可转化性或类似方法的此类模式，以便鉴定某些细胞和细胞阶段。本发明还包括这些修饰的用途。

总之，使用如本文中所述的cxcr3基因区和特别是扩增子作为标志物，本发明的发明人非常特异性地鉴定、定量和特别是区分c-x-c基序趋化因子受体3(cxcr3)免疫细胞亚群(优选为cd8+效应t细胞和记忆t细胞、辅助性t(th)1细胞和自然杀伤t(nkt)细胞中的至少一种)，以及它们与样品中其它细胞类型(例如与其它血细胞和/或免疫细胞)的关系。

现在将基于以下实施例并参考附图和序列表进一步描述本发明，但不限于此。出于本发明的目的，如本文中所引用的所有参考文献通过引用整体并入。

图1显示了根据本发明的第3188号扩增子(seqidno.2)上的cpg位点的分析。表中的水平框对应于所分析的扩增子中的cpg位置(例如cpg1、2等)，其中所指示的位置(amp3188:34对应于扩增子3188...等的cpg1)，并且列对应于所分析的细胞类型。blc-b细胞；ctl-细胞毒性t细胞；grc-粒细胞；moc-单核细胞；nkc-自然杀伤细胞；t4m-cd4+中央记忆细胞；t4n-cd4+幼稚t细胞；t8m–cd8+中央记忆t细胞；t8n-cd8+幼稚t细胞；thc-辅助性t细胞；the-1型辅助性t细胞；和thz-2型辅助性t细胞。

图2显示了本发明的扩增子3188的序列。指示引物和探针序列(分别用下划线、双下划线标出)，cpg位置为粗体。

图3显示了根据本发明的扩增子的基因组区，扩增子3188位置显示为框。

seqidno.1显示了根据本发明的第3188号扩增子的序列(参见图3)。

seqidno.2和3分别显示了扩增子3188的cpg转化的序列和tpg转化的序列的序列。

seqidno.4至9显示了根据本发明的特异性寡聚物(引物和探针)的序列。

实施例

实施例1

为了鉴定cd8+记忆t细胞和效应t细胞、辅助性t(th)1细胞和自然杀伤t细胞(nkt)，对来源于序列seqidno.1的人基因组区(特别是amp3188区)的亚硫酸氢盐转化样品进行qpcr。对于血细胞亚型中扩增子区域的实际表观遗传图谱，所分析的免疫细胞群如图1中所示。

所开发的优选的qpcr测定系统的亚硫酸氢盐转化的靶区域是(也参见图2):

cpg模板变体(甲基化的，即未转化的cg)(seqidno:2):

tpg模板变体(未甲基化的，即转化的cg)(seqidno:3):

优选的测定条件如下：

tpg系统：

热分布：

cpg系统：

热分布：

优选的引物和探针序列是：

fam-荧光素

bhq1-(non-fluorescentblackholesigmaaldrich)

结果：

在成功应用上述测定后，在扩增子3188中发现了以下目的细胞类型的脱甲基化水平：

序列表

<110>艾皮恩蒂斯有限公司(epiontisgmbh)

<120>作为用于鉴定炎性免疫细胞，特别是cd8+记忆t细胞的表观遗传标志物的cxcr3

<130>e31947wo

<150>de102018112644.1

<151>2018-05-25

<160>9

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>481

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

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<211>481

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<213>智人(homosapiens)

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<213>智人(homosapiens)

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<213>智人(homosapiens)

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<213>智人(homosapiens)

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