羊毛硫肽的筛选方法及无细胞蛋白合成体系和羊毛硫肽与流程

[0001]
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种羊毛硫肽的筛选方法及无细胞蛋白合成体系和羊毛硫肽。


背景技术：

[0002]
羊毛硫肽是一种典型的核糖体肽，是指含有硫醚键的环肽类化合物，目前在这类化合物中发现了多种生理活性物质，包括抗菌、抗病毒、镇痛、预防龋齿等。1928年rogers报道了从lactococcus lactis中分离的“明星”化合物乳酸链球菌素nisin，发现其对革兰氏阳性菌的抗菌活性很强。nisin作为一种食品添加剂目前已经在世界上多个国家使用，在数十年的使用历史中没有常出现明显的nisin抗性菌。nisin通过与膜结合的细胞壁结合前体脂质ii，导致肽聚糖的抑制合成和形成膜孔，从而杀死革兰氏阳性细菌。
[0003]
已有的羊毛硫肽活性不足，或者应用有限，还不能满足生产的需求，需要一种能够更全面、更快速挖掘新的羊毛硫肽的方法。


技术实现要素：

[0004]
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种羊毛硫肽的筛序方法及无细胞蛋白合成体系和羊毛硫肽。
[0005]
在获取羊毛硫肽的过程中，nisin的生物合成途径作为一种特别的机制，具有重要的借鉴意义。nisin的生物合成途径研究非常清晰，以nisin z为例，由基因簇上的nisz基因合成前体肽nisz，前体肽由leader peptide和core peptide构成，再由脱水酶nisb进行脱水，环化酶nisc进行环化形成羊毛硫氨酸环，这两个酶都是先识别前导区的保守序列再将核心肽区域的相关氨基酸进行催化，修饰后的前体肽(mlana)也被蛋白酶nisp识别前导区的序列后再对特定的序列“gaspr|it”进行切割而去除leader区域，最终形成成熟的nisin(如图1所示)。van heel等(van heel et al.,2016)利用nisin这种特别的机制做出了出色的对羊毛硫肽的基因组挖掘工作，通过融合潜在的多肽的核心肽与nisin前导肽形成杂交前体，并通过将前体转入l.lactis中与nisbc和nist(转运蛋白)共表达，通过发酵和maldi-tof检测，他们检测到54个候选者中的27个被nisbc脱水，并且在他们的研究中开发了5个与nisin类似的核心肽的新型羊毛硫肽，其具有抗菌活性。但是由于羊毛硫肽往往具有抗菌生物活性，在体内表达不能筛选出对宿主有毒性的羊毛硫肽，因此该方法具有一定的局限性。而且在体内表达需要将菌株进行单独发酵提取检测，过程繁琐，周期较长，使得对化合物的挖掘速率变慢。
[0006]
因此，需要一种能够更全面、更快速挖掘新的羊毛硫肽的方法。
[0007]
具体而言，本发明提供了如下技术方案：
[0008]
根据本发明的第一方面，本发明提供了一种羊毛硫肽的筛选方法，包括：(1)基于参考羊毛硫肽的序列，确定候选羊毛硫肽；(2)将所述候选羊毛硫肽的核心肽编码序列和前导肽序列相连，所得连接产物和载体连接，以便获得重组表达载体；(3)将所述重组表达载
体、细胞提取物和氨基酸预混液进行接触反应，以便获得所述候选羊毛硫肽；(4)基于所述候选羊毛硫肽的不同性能，筛选获得目标羊毛硫肽。
[0009]
本发明所提供的羊毛硫肽的筛选方法，以已有的或者已知的羊毛硫肽作为参考羊毛硫肽，选择与参考羊毛硫肽序列相似或者不相似的序列作为候选羊毛硫肽，然后将候选羊毛硫肽的核心肽编码序列和前导肽序列相连，进一步和载体连接，获得重组表达载体；然后以重组表达载体为模板，以细胞提取物作为相应的能量来源，以氨基酸预混液作为原料，获得相应的候选羊毛硫肽；根据候选羊毛硫肽的不同的性能，筛选获得合适性能的候选羊毛硫肽作为目标羊毛硫肽。本发明所提供的羊毛硫肽的筛选方法借助于无细胞蛋白合成体系，能够在体外快速、全面的获得目标羊毛硫肽，而且能够筛除掉对体内有毒性的羊毛硫肽，方法简单快速，适合挖掘新的目标羊毛硫肽。
[0010]
根据本发明的实施例，以上所述羊毛硫肽的筛选方法进一步包括如下技术特征：
[0011]
在本发明的一些实施例中，步骤(1)进一步通过下列中的至少一种确定所述候选羊毛硫肽：基于所述参考羊毛硫肽的核心肽序列，确定与所述参考羊毛硫肽的核心肽序列保守的序列作为所述候选羊毛硫肽；基于所述参考羊毛硫肽的序列，随机确定所述候选羊毛硫肽；基于所述参考羊毛硫肽的序列，在所述参考羊毛硫肽的不同位点进行饱和突变，以便确定所述候选羊毛硫肽。在确定候选羊毛硫肽时，可以采用多种方法，例如可以根据参考羊毛硫肽的核心肽序列，选择与该核心肽序列保守的序列作为候选羊毛硫肽，从而能够快速筛选得到所述候选羊毛硫肽。也可以随机确定一些序列作为候选羊毛硫肽，通过这种方法确定的候选羊毛硫肽经过最终筛选，可能会存在一些性能和参考羊毛硫肽具有很大不同的羊毛硫肽。当然也可以通过对参考羊毛硫肽的位点进行突变，获得不同于参考羊毛硫肽的候选羊毛硫肽。本领域技术人员在筛选羊毛硫肽的过程中，可以基于想要获得的羊毛硫肽的性能和用途，选择合适的方法以及合适的参考羊毛硫肽，来获得候选羊毛硫肽，然后基于无细胞蛋白合成体系，获得目标羊毛硫肽。
[0012]
在本发明的一些实施例中，步骤(2)中所述载体为质粒或dna模板。利用质粒或者dna模板可以快速制备重组表达载体。
[0013]
在本发明的一些实施例中，步骤(1)中所述参考羊毛硫肽为乳酸链球菌素。乳酸链球菌素作为典型的羊毛硫肽，以其为参考，借鉴乳酸链球菌素的生物合成体系，能够快速获得目标羊毛硫肽。
[0014]
在本发明的一些实施例中，所述氨基酸预混液为含有等浓度基本氨基酸的混合液。氨基酸预混液中含有20种基本氨基酸，每种氨基酸的浓度均相同，这些氨基酸预混液以重组表达载体为模板，以细胞提取物中的酶等补充能量，合成候选羊毛硫肽。
[0015]
在本发明的一些实施例中，步骤(3)中所述细胞提取物为大肠杆菌细胞提取物。大肠杆菌细胞提取物具有很强的蛋白合成能力，在每毫升反应混合物中的蛋白表达量通常在几微克到几毫克之间。例如可以利用s30抽提物进行抽提获得大肠杆菌细胞提取物，所获得的大肠杆菌细胞提取物中含有蛋白合成的各种组分。
[0016]
在本发明的一些实施例中，所述大肠杆菌细胞提取物通过下述方法获得：培养大肠杆菌，收集获得大肠杆菌菌体；将所述大肠杆菌菌体进行高压冷冻破碎，收集上清，以便获得所述大肠杆菌细胞提取物。
[0017]
根据本发明的第二方面，本发明提供了一种羊毛硫肽的筛选方法，包括：(a)基于
乳酸链球菌素的序列，确定候选羊毛硫肽；(b)将所述候选羊毛硫肽的核心肽编码序列和乳酸链球菌素的前导肽序列相连，所述连接产物与载体连接，以便获得重组表达载体；(c)将所述重组表达载体、nisb蛋白、nisc蛋白、含有nisp的表达载体、细胞提取物和氨基酸预混液进行接触反应，以便获得所述候选羊毛硫肽；(d)基于所述候选羊毛硫肽的不同性能，筛选获得合适的羊毛硫肽。
[0018]
在本发明的一些实施例中，在25～40摄氏度下进行所述接触反应。由此可以快速挖掘新的羊毛硫肽。
[0019]
根据本发明的第三方面，本发明提供了一种通过高通量筛选获得羊毛硫肽的方法，包括：基于参考羊毛硫肽的序列，在所述参考羊毛硫肽的不同位点进行饱和突变，以便确定候选羊毛硫肽；将所述候选羊毛硫肽的核心肽编码序列和前导肽序列相连，所述连接产物和载体连接，构建重组表达载体，以便获得突变体文库；利用微生物菌株对所述突变体文库进行转化表达，以便获得单克隆菌株；将所述单克隆菌株培养，破菌，离心，获得所述重组表达载体；所述重组表达载体、细胞提取物和氨基酸预混液进行接触反应，以便获得所述候选羊毛硫肽；基于所述候选羊毛硫肽的不同性能，筛选获得目标羊毛硫肽。通过对参考羊毛硫肽的序列进行突变获得候选羊毛硫肽，其涉及到大量的候选羊毛硫肽。在对这些候选羊毛硫肽进行筛选时，可以通过构建突变体文库，然后进行转化表达，获得含有不同突变体的单克隆菌株。对这些菌株进行培养，破菌分离获得不同的重组表达载体，可以将这些重组表达载体直接和细胞提取物以及氨基酸预混液进行接触反应，获得不同的候选羊毛硫肽，通过对性能指标测定，能够确定最终的目标羊毛硫肽。通过这种高通量筛选的方式对不同的羊毛硫肽突变体进行筛选，避开了使用试剂盒提取载体，表达蛋白的过程，从而可以大大节约了成本，适合大规模的操作和筛选。
[0020]
在本发明的一些实施例中，通过震荡进行所述破菌，通过离心进行所述分离。从而可以快速获得重组表达载体，和细胞提取物以及氨基酸预混液接触反应，获得候选羊毛硫肽。
[0021]
根据本发明的第四方面，本发明提供了一种无细胞蛋白合成体系，包括：nisb蛋白、nisz蛋白、含有nisp的表达载体、细胞提取物和氨基酸预混液。
[0022]
在本发明的一些实施例中，所述无细胞蛋白合成体系进一步包括：含有羊毛硫肽核心肽序列和前导肽的表达载体。
[0023]
根据本发明的第五方面，本发明提供了一种羊毛硫肽，所述羊毛硫肽包括选自下列中的至少之一：seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、seq id no:23、seq id no:24。这些羊毛硫肽对藤黄微球菌具有良好的抑制作用，能够作为药物治疗由藤黄微球菌所引起的感染。
附图说明
[0024]
图1是根据本发明的实施例提供的nisin的生物合成途径示意图。
[0025]
图2是根据本发明的实施例提供的无细胞蛋白合成体系产生的nisin与标准品的lc-ms-ms比对结果。
[0026]
图3是根据本发明的实施例提供的关于羊毛硫肽rl6的结构及相应的二级质谱图。
[0027]
图4是根据本发明的实施例提供的关于羊毛硫肽rl8的结构及相应的二级质谱图。
[0028]
图5是根据本发明的实施例提供的关于羊毛硫肽rl13的结构及相应的二级质谱图。
[0029]
图6是根据本发明的实施例提供的关于羊毛硫肽rl14的结构及相应的二级质谱图。
[0030]
图7是根据本发明的实施例提供的关于羊毛硫肽rl22的结构及相应的二级质谱图。
[0031]
图8是根据本发明的实施例提供的关于羊毛硫肽s29a的结构及相应的二级质谱图。
[0032]
图9是根据本发明的实施例提供的关于羊毛硫肽m5的结构及相应的二级质谱图。
[0033]
图10是根据本发明的实施例提供的筛选出的新的羊毛硫肽对大肠杆菌生长抑制的结果图。
[0034]
图11是根据本发明的实施例提供的在大肠杆菌中表达m5和nisin z的前体肽对大肠杆菌生长影响结果图。
[0035]
图12是根据本发明的实施例提供的模拟体内筛选m5和nisinz对大肠杆菌生长抑制的结果图。
具体实施方式
[0036]
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0037]
本文中，“无细胞蛋白合成体系”是一种以外源mrna或dna为模板，在细胞抽提物的酶系中补充底物和能量来合成蛋白的体外系统。该无细胞蛋白合成体系在本发明中也称为无细胞蛋白合成平台，即cfps平台。
[0038]
本发明所提供的无细胞蛋白合成体系借鉴乳酸链球菌素的生物合成途径，该体系中含有：nisb蛋白、nisz蛋白、含有nisp的表达载体、细胞提取物和氨基酸预混液。利用该体系可以快速获得羊毛硫肽，从而适用于挖掘新的羊毛硫肽以及羊毛硫肽的高通量筛选。
[0039]
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种羊毛硫肽的筛选方法，包括：(a)基于乳酸链球菌素的序列，确定候选羊毛硫肽；(b)将所述候选羊毛硫肽的核心肽编码序列和乳酸链球菌素的前导肽序列相连，所得连接产物与载体连接，以便获得重组表达载体；(c)将所述重组表达载体、nisb蛋白、nisc蛋白、含有nisp的表达载体、细胞提取物和氨基酸预混液进行接触反应，以便获得所述候选羊毛硫肽；(d)基于所述候选羊毛硫肽的不同性能，筛选获得合适的羊毛硫肽。
[0040]
其中，在基于乳酸链球菌素的序列，确定候选羊毛硫肽时，可以通过如下方法确定候选羊毛硫肽：基于乳酸链球菌素的核心肽序列，确定与所述乳酸链球菌素的核心肽序列保守的序列为所述候选羊毛硫肽。通过这种方法可以快速获得符合要求的羊毛硫肽。当然也可以随机确定一段序列作为候选羊毛硫肽；这种方法意味着更多的候选羊毛硫肽可能都是没有活性或者都不是想要的目标羊毛硫肽；但是在这个过程中也可能会获得一些性能非常好的羊毛硫肽。在另外一些实施方式中，可以通过对乳素链球菌序列的不同位点进行突变，获得候选羊毛硫肽。这种突变的方式可以获得大量的候选羊毛硫肽，面临着大量的筛选
工作。所以可以通过下述高通量筛选的方式获得羊毛硫肽。
[0041]
为此，在本发明的另一个方面，本发明提供了一种通过高通量筛选获得羊毛硫肽的方法，包括：基于乳酸链球菌素的序列，在所述乳酸链球菌素的不同位点进行饱和突变，以便确定候选羊毛硫肽；将所述候选羊毛硫肽的核心肽编码序列和乳酸链球菌素的前导肽序列相连，所述连接产物和载体连接，构建重组表达载体，以便获得突变体文库；利用微生物菌株对所述突变体文库进行转化表达，以便获得单克隆菌株；将所述单克隆菌株培养，破菌，分离获得所述重组表达载体；所述重组表达载体、nisb蛋白、nisc蛋白、含有nisp的表达载体，细胞提取物和氨基酸预混液进行接触反应，以便获得所述候选羊毛硫肽；基于所述候选羊毛硫肽的不同性能，筛选获得目标羊毛硫肽。
[0042]
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0043]
实施例1
[0044]
在本实施例中，构建调节乳酸链球菌素制备的几种关键组分的质粒，具体方法如下：
[0045]
(1)使用blood&cell culture dna mini试剂盒(qiagen，hileden，germany)根据说明获得来自乳酸乳球菌(lactococcus lactis)的基因组dna。
[0046]
(2)通过人工基因合成nisz序列nisz(seq id no:1)，然后根据表2中所示出的酶切位点nisz亚克隆到pjl1中，获得nisz表达质粒。
[0047]
同时，利用表1中示出的引物，从atcc11454酵母菌基因组上通过pcr的方式从基因组中扩增nisb(seq id no:2)、nisc(seq id no:3)和nisp(seq id no:4)基因，然后采用表2中所示出的酶切位点对pcr扩增片段进行酶切，同时对质粒pet28a用相同的酶进行切割，采用t4连接酶进行酶连后，挑选正确的克隆，并将阳性克隆进行测序，进行验证，构建得到nisb，nisc和nisp表达质粒。
[0048]
其中，seq id no:1-4所示核苷酸序列分别如下：
[0049]
nisz(seq id no:1)：atgagtacaaaagattttaacttggatttggtatctgtttcgaagaaagattcaggtgcatcaccacgcattacaagtatttcgctatgtacacccggttgtaaaacaggagctctgatgggttgtaacatgaaaacagcaacttgtaattgtagtattcacgtaagcaaataa。
[0050]
nisb(seq id no:2)：atgataaaaagttcatttaaagctcaaccgtttttagtaagaaatacaatattatctccaaacgataaacggagttttactgaatatactcaagtcattgagactgtaagtaaaaataaagtttttttggaacagttactactagctaatcctaaactctataatgttatgcagaaatataatgctggtctgttaaagaagaaaagggttaaaaaattatttgaatctatttacaagtattataagagaagttatttacgatcaactccatttggattatttagtgaaacttcaattggtgttttttcgaaaagttcacagtacaagttaatgggaaagactacaaagggtataagattggatactcagtggttgattcgcctagttcataaaatggaagtagatttctcaaaaaagttatcatttactagaaataatgcgaattataagtttggagatcgagtttttcaagtttataccataaatagtagtgagcttgaagaagtaaatattaaatatacgaatgtttatcaaattatttctgaattttgtgagaatgactatcaaaaatatgaagatatttgtgaaactgtaaccctttgctatggagacgaatatagagaactatcggaacaatatcttggcagtctgatagttaatcattatttgatctctaatttacaaaaagatttgttgtcagatttttcttgggacacttttttgactaaagttga
gcccacataaaaggatatagtaatgaagcctcgttgtcagctttgcaaaaaattatttttatttatgaaaagtttgaacttgaaattaaaaatcagtttctatggaaagatggacttgtagcagatgaattaaaaaaagagaaagtaattagggaagcaagtttcattagagatgcatggtgctatggaggtccaggtattagtctgctatacttatacggaggattagcactggataatgactattttgtagataaagcagaaaaaatattagagtcagctatgcaaagaaaacttggtattgattcatatatgatttgccatggctattctggtttaatagaaatttgttctttatttaagcggctattaaatacaaaaaagtttgattcatacatagaagaatttaatgttaatagtgagcaaattcttgaagaatacggagatgaaagtggcacgggttttcttgaaggaataagtggctgtatactggtattatcgaaatttgaatattcaatcaattttacttattggagacaagcactgttactttttgatgattttttgaaaggagggaagaggaaatga。
[0052]
nisp(seq id no:4)：gtgaaaaaaatactaggtttcctttttatcgtttgttcgttgggtttatcagcaactgtgcatggggagacaacaaattcacaacagttactctcaaataatattaatacggaattaattaatcataattctaatgcaattttatcttcaacagagggatcaacgactgattcgattaatctaggggagcagtcaactgcagtaaaatcgacaacaaggactgaattggatgtaactggtgctgctaaaactttattacagacatcagctgttcaaaaagaaatgaaagtttcgttgcaagaaactcaagttagttctgaattcagtaagagagatagcgttacaaataaagaagcagttccagtatctaaggatgagctacttgagcaaagtgaagtagtcgtttcaacatcatcgattcaaaaaaataaaatcctcgataataagaagaatagagctaactttgttacttcctctcagcttattaaggaaaaaccatcaaattctaaagatgcatctggtgtaattgataattctgcttctcctctatcttatcgtaaagctaaggaagtggtatctcttagacaacctttaaaaaatcaaaaagtagaggcacaacctctattgataagtaattcttctgaaaagaaagcaagtgtttatacaaattcacatgatttttgggattatcagtgggatatgaaatatgtgacaaataatggagaaagctatgcgctctaccagccctcaaagaaaatttctgttggaattattgattcaggaatcatggaagaacaccctgatttgtcaaatagtttaggaaattattttaaaaatcttgttcctaagggagggtttgataatgaagaacctgatgaaactggaaatccaagtgatattgtggacaaaatgggacacgggacggaagtcgcaggtcagattacagcaaatggtaatattttaggagtagcaccagggattactgtaaatatatacagagtatttggtgaaaatctttcgaaatcggaatgggtagctagagcaataagaagagctgcggatgatgggaacaaggtcatcaatataagtgctggacagtatcttatgatttcaggatcgtatgatgatggaacaaatgattatcaagagtatcttaattataagtcagcaataaattatgcaacagcaaaaggaagtattgttgtcgcagctcttggtaatgatagtttaaacatacaagataaccaaacaatgataaactttcttaagcgtttcagaagtataaaggttccgggaaaagttgtagatgcaccgagtgtatttgaggatgtaatagccgtaggtggaatagatagttatggtaatatttctgattttagtaatattggagcggatgcaatttatgctcctgctggcacaacggccaattttaaaaaatatgggcaagataaatttgtcagtcagggttattatttgaaagattggctttttacaactactaatactggctggtaccaatatgtttatggcaactcatttgctgctcctaaagtatctggggcactggcattagtagttgataaatatggaataaagaatcctaaccaactaaaaaggtttcttctaatgaattctccagaagttaatgggaatagagtattgaatattgttgatttattgaatgggaaaaataaagcttttagcttagatacagataaaggtcaggatgatgctattaaccataaatcgatggagaatcttaaagagtctagggatacaatgaaacaggaacaagataaagaaattcaaagaaatacaaataacaatttttctatcaaaaatgattttcataacatttcaaaagaagtaatttcagttgattataatattaatcaaaaaatggctaataatcgaaattcgagaggtgctgtttctgtacgaagtcaagaaattttacctgttactggagatggagaagattttttacctgctttaggtatagtgtgtatctcaatccctggtatattgaaaaggaagactaaaaattga。
[0053]
表1所用引物信息
[0054]
[0055][0056]
表2所构建质粒信息
[0057][0058]
其中，表2中质粒pyz-nisz、pyl02、pyl03、pyl04分别代表nisz表达质粒、nisb表达质粒、nisc表达质粒和nisp表达质粒。
[0059]
实施例2
[0060]
利用实施例1制备的nisz、nisb、nisc和nisp表达质粒重建nisin体外合成途径，具体方法如下：
[0061]
1、构建nisin体外反应体系(cfps)的主要成分的制备
[0062]
(1)获取nisb和nisc蛋白，方法如下：
[0063]
(a)用质粒pyl02和pyl03分别转化大肠杆菌bl21(de3)细胞，然后单菌落转化体在50ml补充有50μg/ml卡那霉素的培养基中37℃下生长过夜。
[0064]
(b)按照1％的接种量转接2l lb培养基直到od600达到0.6-0.8，然后将培养物冷却至18℃，加入iptg至终浓度0.5mm(nisb)或0.2mm(nisc)诱导，其中，对于nisc过表达，需加入另外的100μm zncl
2
以确保其活性。
[0065]
(c)步骤(b)的培养物继续培养生长20小时后，通过在4℃以5000g离心20分钟收获细胞，并重新悬浮于缓冲液a(20mm tris，ph 7.6,500mm nacl，10％甘油)中。
[0066]
(d)通过在10000-15000psig的可变压力下均质化裂解细胞悬浮液，并在4℃以25000g离心1小时，去上清，得到裂解后的细胞。
[0067]
(e)将裂解后的细胞加入ni-nta柱(ge healthcare，marlborough，ma，usa)并用2倍柱体积(cv)的缓冲液a洗涤，然后将过滤的上清液施加到柱上，树脂用含有0，25，50，100，200和500mm咪唑的2cv各缓冲液洗涤，得到纯化后的蛋白洗脱液。
[0068]
(f)将纯化后的蛋白洗脱液利用amicon ultra-15离心过滤装置(millipore，darmstadt，德国)浓缩含有所需蛋白质的洗脱液，并通过pd-10柱(ge)将缓冲液交换至储存缓冲液(100mm磷酸盐缓冲液，10％甘油，ph 7.6)，得到纯化后的蛋白。
[0069]
(g)用pierce bca蛋白质测定试剂盒(thermo fisher scientific，waltham，ma)测量步骤(f)得到的蛋白质的浓度，并在液氮中快速冷冻后，将蛋白质在-80℃储存。
[0070]
(2)制备细胞提取物，方法如下：
[0071]
(a)将大肠杆菌bl21(de3)接单克隆到10ml无抗lb培养基中，37度摇床过夜培养，将10ml培养物全部转接到1l typg中，37度摇床培养至od＝0.6-0.8后，终浓度为1mmiptg诱导，放回37度摇床继续培养至od＝6-94度，3500转，10分钟收集菌体。
[0072]
(b)用s30buffer(10mm tris-醋酸，14mm醋酸镁，60mm谷氨酸钾，2mm dtt ph 8.2)重悬菌体，离心3次称量，最后一次离心完去掉上清的细胞湿重，液氮速冻，可先放到-80度保存。使用前冻融，用1ml s30buffer/1g细胞湿重重悬菌体，使用高压冷冻破碎仪破碎细胞(800-900bar，10分钟)4度，30000rcf，30分钟收集上清，冰上分装，液氮速冻，-80℃保存。
[0073]
(3)4
×
premix(10ml)：1.6ml的2mm氨基酸混合液(该氨基酸混合液含有精胺酸、缬胺酸、色氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天门冬氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸)，0.4ml的100
×
ntpmix(ntpmix含有atp 120mm，gtp 85mm，utp 85mm和ctp 85mm)，4ml的10
×
盐溶液(盐溶液含有谷氨酸钾1.26m，谷氨酸钠0.04m，谷氨酸镁0.12m，醋酸铵0.1m和草酸钾0.04m)，0.8ml大肠杆菌的trnamix混合液，132μl的100mmnad
+
保存液，216μl的50mmcoa保存液，1.32ml1mpep保存液ph7.4，68μl20mg/ml叶酸保存液，160μl250mm腐胺保存液，240μl250mm亚精胺保存液，milli-q水1.064ml，将上述成份充分混匀后用离心管分装成500μl每管，保存在-80℃。
[0074]
2、nisin体外反应体系(cfps)的构建
[0075]
按照下表3体系加入以下成分，在30℃下进行6小时。通过在85℃温育10分钟终止反应，并且通过以10000g离心5分钟沉淀蛋白质，取上清液进行下游分析。
[0076]
表3体外重建反应体系
[0077]
成分体积(μl)pyz-nisz质粒0.4nisb蛋白1.0nisc蛋白0.4pyl04质粒0.2细胞提取物24
×
premix2水1.840.25mm zncl
2
0.16
[0078]
3、结果分析
[0079]
以10000g离心10分钟后获得cfps反应混合物的上清液，并进行lc-ms分析。使用装备有lcq-fleet esi-iontrap ms(thermo fisher)的hplc系统进行lc-ms分析，色谱条件如下：
[0080]
色谱柱：hypersil gold tm aq c18柱(2.1mm
×
100mm，3μm粒径，175孔径，thermo fisher)；
[0081]
流动相：a-0.01％(v/v)三氟乙酸水溶液(tfa)；b-100％乙腈(b)；
[0082]
洗脱液流程：0-10分钟，10％b；10-35分钟，10-80％b；35-40分钟80％b；
[0083]
流速：0.15毫升/分钟；
[0084]
温度：30℃。
[0085]
在m/z 200至1800的质量范围内取总离子流色谱图(tic)，并采用提取离子色谱图(xic)定性鉴定在相应的m/z为1111.7的无细胞生产的乳链菌肽z，乳酸链球菌肽z的[m+3h]
3+
，结果如图2所示。
[0086]
其中图2中图2a代表无细胞蛋白合成体系反应后的产生的nisin与nisin标准品在高分辨质谱中保留时间一致，图2b代表nisinz标准品的二级质谱图，图2c代表无细胞蛋白体系反应后的产生的nisin的二级质谱图，从图2示出的结果可以证明在体外重建了nisin的合成体系。
[0087]
实施例3
[0088]
实施例3以nisin核心肽序列作为保守序列，从数据库中筛选出了与nisin核心肽序列保守的羊毛硫肽，并借助于nisin的cfps系统，对各羊毛硫肽的功能进行了验证。
[0089]
以nisin核心肽的序列“sxslctpgcxtg”为保守序列从ncbi中调取了所有的与nisin核心肽区域保守的预测为羊毛硫肽的多条序列(截止2018年6月)，利用“bagel4”数据库(http://bagel4.molgenrug.nl/)筛选去除已知的羊毛硫肽，最终筛选出18条与nisin核心肽序列保守的未知功能的羊毛硫肽，将其核心肽序列分别命名为rl1-rl18。
[0090]
将这18条序列调整以符合nisp的识别位点(如果核心肽序列n端氨基酸不是“it”或“vt”的，在n端加入“it”)，调整后的核心肽序列分别加上nisin z的前导肽序列形成新的“杂交”的羊毛硫肽，将这18条新的“杂交”的羊毛硫肽克隆进入pjl1质粒上构建成prl1-prl18，同时将文献报道的nisin z和bagelicin(van heel et al.,2016)也按同样的方式构建作为验证cfps系统的正对照。
[0091]
将prl1-prl21依次替换pjl1-nisz投入到nisin的cfps系统中，按实施例2中的方法进行反应，取反应后的体系进行对藤黄微球菌的抑制的生测检测以及lc-ms-ms检测是否有预期脱水的理论分子量，结果如表4所示。
[0092]
从表4示出的结果可以看出，经过lc-ms-ms的检测，新发现的rl4，rl6,rl8，rl10,rl13,rl14,nisin z和bagelicin检测出经过修饰的多肽的理论分子量，且rl6,rl8,rl13,rl14和作为对照的nisin z和bagelicin都显示出了对藤黄微球菌的抑制活性，而其余物质均没表现出明显的抑菌圈。
[0093]
但其余多肽的cfps体系里可能也有新的羊毛硫肽产生，比如rl4和rl10通过lc-ms-ms检测出了经过修饰的多肽的理论分子量，却没有生测活性，表明在cfps系统里，这两种多肽可能形成了新的羊毛硫肽，但rl4和rl10对藤黄微球菌可能没有抑制效果，或者是在cfps系统里产生的rl4和rl10的产量不足以抑制藤黄微球菌的生长。但如果利用不同靶向的筛选系统可能能够从中筛选出更多可能的新化合物，比如rl4和rl10可能具有别的生理活性或功能。
[0094]
由于目前的lc-ms-ms的方法的限制，在其余cfps体系(rl1-3，rl5，rl7，rl9，rl11-12和rl15-18)中可能也存在新结构的羊毛硫肽，但由于检测系统限制未能检出。
[0095]
[0096][0097]
实施例4
[0098]
虽然无细胞系统能够高效合成新的羊毛硫肽，但由于该系统仅在微升级别反应，
因此在几微升体积里产生的羊毛硫肽不足以进行结构鉴定。因此，我们参照前人在大肠杆菌中异源表达nisin的方法(shi et al.,2011)，将筛选到的rl6，rl8，rl13和rl14在大肠杆菌体内进行前体肽的表达、修饰，再通过镍柱亲核纯化得到已经形成羊毛硫环的前体肽mlana，由trypsin进行前导肽的切割后形成成熟的羊毛硫肽。
[0099]
将最有效抑菌成分(脱8分子水)的组分作为未知羊毛硫肽的结构式，利用lc-ms-ms对最有效成分(脱8分子水)的组分进行二级质谱结构鉴定(质谱条件同实施例1)，并通过二级质谱图预测子离子的分子量可预测出各核心肽中发生脱水的丝氨酸或者苏氨酸的氨基酸残基位置，再将核心肽序列与nisin的结构进行对比可获得发生环化的结构，从而可以推测未知羊毛硫肽的二级结构，按照这个方法将最高抑菌活性组分的rl6、rl8、rl13及rl14进行结构分析如图3所示。
[0100]
对nisin常用指示菌株藤黄微球菌(m.luteus)和临床致病标准菌株金黄色葡萄球菌(s.aureus)和粪肠球菌(e.faecalis)以及临床分离的耐药菌株mrsa进行了最小抑菌浓度测定。结果如表6所示，新发现的羊毛硫肽rl14对藤黄微球菌的mic为0.0045μm，比商业化的nisin a低4倍，比nisin z低8倍，是6种化合物中对藤黄微球菌抑制效果最好的化合物；rl14对e.faecalis的mic为18.69μm比现常用商品nisin a和nisin z低4倍，也是测试的6种化合物中对e.faecalis抑制效果最好的化合物。但rl14对s.aureus和mrsa的mic均为74.75μm，效果比现有商品nisin a差。其余新发现的rl6、rl8、rl13未表现出优于现有商品nisin a或nisin z的抑菌活性，其中rl6针对m.luteus和e.faecalis活性与现有商品nisin z一致，而针对金黄色葡萄球菌和mrsa的活性都比nisin a和nisin z差，而rl8和rl13针对藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌和mrsa的效果都比nisin a和nisin z差，但针对粪肠球菌的活性与nisin a、nisin z和rl6一致，比rl14抑菌效果差。
[0101]
表6几种羊毛硫肽对微生物的抗菌活性mic测定值
[0102][0103]
实施例5
[0104]
通过上述实验，对目前已报道的与nisin保守但功能未知的基因进行了研究，同时想尝试利用无细胞系统去筛选与nisin无保守结构的羊毛硫肽，以验证这种方法的普适性并且探究其是否具有除了抑菌活性以外的生物活性。
[0105]
实施例5通过对随机选取的羊毛硫肽序列采用无细胞反应体系，对其功能进行验
证。包括如下：
[0106]
随机选取了18条羊毛硫肽序列(分别命名为rl22-rl39)，这些羊毛硫肽包括i型、ii型、iii型(由antismash预测)，选取其核心肽序列与nisin前导肽序列相连并克隆在pjl1载体上，分别形成质粒prl22-prl39，将质粒prl22-prl39依次替换pjl1-nisz投入到cfps系统中，孵育6小时后，利用lc-ms-ms对其cfps混合物进行检测，结果如下表7所示，仅有rl22检测到脱水后的相关分子量。将其进行对藤黄微球菌的活性测试，均没有抑菌圈的出现。
[0107]
表7与nisin骨架不同的羊毛硫肽在cfps中的脱水修饰测试
[0108]
[0109][0110]
其中，*表示将i/it添加到核心肽的n末端，成为nisp可识别的切割位点。修饰是基于观察到的lc-ms-ms的脱水残基的数量，括号内是核心肽中丝氨酸和苏氨酸的总数。核心肽中半胱氨酸，丝氨酸和苏氨酸用粗体标记。
[0111]
同样的，由于cfps体系里产生的rl22较少而不足以用多级质谱进行结构鉴定，因此，我们按照前述方法进行发酵纯化后，通过多级质谱对其进行结构判定，rl22的结构如图7所示。
[0112]
实施例6
[0113]
nisin只对革兰氏阳性菌有抑菌作用，对革兰氏阴性菌抑制作用却很弱，这极大的限制了nisin的应用。为了获得对革兰氏阴性菌有良好抑制效果的nisin突变体，扩大nisin的抗菌作用，本研究借助本实验室建立的无细胞反应平台，在体外合成nisin突变体，同时建立了一套高通量筛选方法，使得我们可以靶向筛选抗革兰氏阴性菌的nisin突变体。
[0114]
高通量筛选整体流程如下：
[0115]
(1)我们选择位于非保守位点的5个氨基酸残基(乳酸链球菌素肽z的4,12,15,24和29位)进行饱和突变，即将核心肽上编码这个5个氨基酸残基的碱基通过基因合成的方式进行饱和突变，突变后的核心肽与nisin的前导肽相连以后克隆于pjl1载体上形成nisin突变体文库。理论上，将该文库转化进入大肠杆菌dh10b中，每个转化子中就存在一种nisin的突变体。
[0116]
(2)使用thermo连续分液仪将lb培养基以每孔250μl分装于96孔细胞培养板(平底)中，使用qpix460全自动高通量克隆挑选系统对nisin突变体文库转化平板上的单克隆进行挑选，40min内可完成多达3000个单克隆的挑选工作，并将单克隆接种于相应孔中，37℃摇床培养18h。
[0117]
(3)使用biomek fxp工作站取50μl菌液至一新的96孔pcr半裙边板(尖底)中，然后加入50μl 40％的甘油以1:1的比例混合进行保种，剩余200μl菌液用96孔板专用离心机进行离心，4500rpm，20min，去上清。
[0118]
(4)使用thermo连续分液仪将灭过菌的纯水以每孔200μl分装于上述96孔细胞培养板中，然后在每孔中加入适量玻璃珠(孔中加入玻璃珠的体积跟玻璃珠上部液体的体积比为1:1最适)。
[0119]
(5)然后将上述平板在摇床中震荡破菌，999rpm，1h。后将平板从摇床中取出进行离心，4500rpm，1min，以确保玻璃珠都在96孔板底部。
[0120]
(6)借助biomek fx
p
工作站将平板中的上清转移至一新的96孔pcr半裙边板(尖
底)中，注意不要吸到玻璃珠，然后将上清离心浓缩干。
[0121]
(7)离心浓缩干的样品用biomek fx
p
工作站每孔加入30μl灭过菌的纯水复溶，即视为我们所提取的质粒。然后从中取4μl作为质粒，参照实施例2的无细胞蛋白合成体系进行体外反应，30℃摇床反应14h。
[0122]
(8)反应后的96孔pcr半裙边板(尖底)用旋蒸仪的水浴模块进行加热处理，85℃，5min。此加热步骤可去除反应体系中可能存在的杂菌，同时对生成的nisin突变体的活性并没有影响。
[0123]
(9)将上述96孔板离心，在超净台中取2μl上清加入200μl提前处理好的dh5α菌体中(取商业购买的大肠杆菌dh5α感受态20μl接种至5ml lb培养基中，至od值在0.6-0.8时取200μl加入到200ml lb培养基中稀释1000倍)。
[0124]
(10)用移液枪吹打混匀后各取100μl至两个新的96孔细胞培养板(平底)中，其中1板加入320μm经过过滤除菌的edta，另外1板不加入edta。
[0125]
(11)移液枪吹打混匀后用perkin elmer微孔板酶标仪测定菌液的初始od值，后将平板置于37℃培养箱中培养，分别测定平板中菌液在6h、7h以及8h的od
600
，观察菌体的od
600
在这几个小时中的变化情况。
[0126]
选择最低的δod600被认为是抑制革兰氏阴性细菌大肠杆菌生长的突变体。以这种方式从3,000个突变体中筛选出1个突变体，其表现出比革兰氏阴性细菌大肠杆菌更强的生长抑制作用。通过对这种突变体的lanas进行测序，发现其突变位点为i4r，k12w，a15p，a24k和s29q，将其命名为m5。
[0127]
接下来，为了验证cfps平台筛选的可靠性，我们使用在大肠杆菌中表达mlanas的方法纯化m5和前期报道对大肠杆菌有抑制作用的nisin突变体s29a，并在体外除去前导肽，通过lc-ms-ms鉴定了它们的结构(图9)。
[0128]
为了在与先前报道相似的条件下进行测试，选择具有320μmedta的dh5α作为测试条件，因为在这种条件下抑制不同浓度乳链菌肽的大肠杆菌生长的od变化更明显。我们用m5，s29a或乳链菌肽z处理大肠杆菌dh5α生长曲线，结果显示m5对革兰氏阴性菌大肠杆菌的生长抑制比乳链菌肽z和s29a更好(图10)。
[0129]
为了验证我们的cfps平台筛选优于体内筛选，模拟了一种体内高通量筛选方法，该方法将用于合成m5和nisin z的mlanas的质粒转移至大肠杆菌，并使用胰蛋白酶去除前导肽。具体如下：
[0130]
将单一重组大肠杆菌菌落挑取到96孔板的孔中培养，所述96孔板含有150μl含有50mg/l卡那霉素和34mg/l氯霉素的lb培养基，在37℃培养直至od600达到0.5。然后将温育温度改变为18℃并用0.5mm iptg诱导培养物。通过离心(4,500
×
g，20分钟)收获大肠杆菌细胞。将细胞沉淀重悬于150μl磷酸盐缓冲液(ph 7.6)中，并通过玻璃珠裂解后将100μl上清液用2.5％胰蛋白酶在37℃处理2小时。然后加入150μl大肠杆菌dh5α(5.0
×
105c.f.u.ml-1)进行共培养。对照：大肠杆菌dh5α。
[0131]
结果显示m5的mlana对大肠杆菌的生长具有抑制作用(图11)。使用该方法筛选抑制大肠杆菌效应乳链菌肽z比m5更好(图12)，这表明像m5这样的突变体难以在体内筛选，因为它们的mlanas阻碍细胞生长。该结果证实了我们的cfps平台进行多肽筛选的能力，并且表明我们的cfps平台在对肽的定向进化方面可以比体内系统表现更好。我们的cfps平台在
合成多肽和筛选靶标方面都更快。
[0132]
在本发明的描述中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
[0133]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0134]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

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