一种类胡萝卜素生产细菌的定性和定量检测方法与流程

[0001]
本发明属于细菌的定性和定量检测技术领域，具体涉及一种类胡萝卜素生产细菌的定性和定量的检测方法。


背景技术：

[0002]
类胡萝卜素(carotenoids)是一类天然存在于自然界中的脂溶性色素，属于萜类化合物，含有一系列的甲基支链和共轭双键，因其甲基、共轭双键的数目和取代基的属性而呈现不同的颜色特征。类胡萝卜素因其抗氧化的特性而具有许多有益的生物活性和药用价值，比如清除氧化自由基、延缓衰老、防癌抗癌、增强机体免疫等。类胡萝卜素存在着巨大的市场前景。
[0003]
近年来，在医学、食品、保健等方面的应用也越来越多，并且其作为食品添加剂和营养品，已经得到了fda、who等国际组织的认可。
[0004]
目前，类胡萝卜素的生产方法主要分为植物(高等植物和藻类)提取和微生物发酵的方法。细菌作为一种潜在的类胡萝卜素来源也越来越受到科研工作者的关注。被报道的天然类胡萝卜素的生产细菌(光合和非光合细菌)主要有:着色细菌属(chromatium)、红球菌属(rhodopila)、红杆菌属(rhodobacter)和红微菌属(rhodomicrobiun)等光合细菌和黄杆菌(flavobacterium)、副球菌(paracoccus)鞘氨醇单胞菌(sphingomonas)和短波单胞菌(brevundimonas)等非光合细菌。
[0005]
目前用于鉴定和检测类胡萝卜素生产细菌的方法非常繁琐，包括特殊的细菌培养、复杂的鉴定、繁琐的类胡萝卜素提取、分离及鉴定等步骤；操作过程成本高、难度大、时间长。这种传统检测方法严重限制了类胡萝卜素生产细菌方面的研究。随着国内国际市场对天然类胡萝卜素需求的日益增长，不但需要开发更多的天然类胡萝卜素资源，而且也需要更方便、快速、高效的检测技术。现代分子生物学技术是一种非常高效的检测技术，已被广泛应用于农业、畜牧业、医学等各个领域。然而，迄今为止分子生物学方法还没有被用于检测类胡萝卜素生产菌中。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于提供一种类胡萝卜素生产细菌的定性和定量检测方法，能够快速、准确、高效、简便地对类胡萝卜素生产细菌进行定性和定量检测；以解决现有技术存在的问题。
[0007]
一对用于定性和定量检测类胡萝卜素生产细菌的特异性引物，基于类胡萝卜素合成关键基因的特异性引物，特异性引物序列为：
[0008]
上游引物crtif：cctccackaggraaccatacacccca
[0009]
下游引物crtir：caractacagtnttcgaggc。
[0010]
本发明的引物可以实现细菌八氢番茄红素脱氢酶基因(crti)的pcr扩增和环境样品中crti基因的快速定量。该引物为利用多种细菌(brevundimonas vesicularis，
methylobacterium extorquens am1和sphingomonas elodea strain atcc 31461等)的crti同源区域设计出的特异性引物。
[0011]
一种类胡萝卜素生产细菌的定性和定量检测方法，主要包括以下步骤：
[0012]
(1)从已知的类胡萝卜素生产细菌中提取细菌基因组dna，以提取细菌基因组dna为模板，采用crtif和crtir为上下游引物进行pcr扩增目的基因片段；并对目的基因片段进行琼脂糖凝胶电泳验证；
[0013]
(2)提取待检细菌的基因组dna，按照步骤(1)中的pcr条件进行扩增；进行琼脂糖凝胶检测，并进行测序和比对；如果琼脂糖凝胶检测扩增片段与目的基因片段大小相同，且进行测序和比对为八氢番茄红素脱氢酶基因，即可快速确定其为类胡萝卜素生产菌；
[0014]
(3)切胶回收纯化步骤(1)pcr扩增的基因片段，连接t载体后转化到dh5α大肠杆菌中；涂平板培养24小时后挑选阳性克隆子进行测序验证和扩大培养；利用克隆成功的大肠杆菌菌液提取质粒，测量质粒浓度，计算出质粒的拷贝数；
[0015]
(4)将提取的质粒进行10倍的梯度稀释，获得不同浓度的标准液，再以标准液为模板进行荧光定量pcr扩增获得ct值；以拷贝数为横坐标(x)和对应的ct值为纵坐标构建标准曲线，获得的线性方程；
[0016]
(5)提取待测环境样品，提取环境样品dna作为pcr扩增和荧光定量pcr扩增的模板；参照步骤(1)和(2)以待测环境样品的dna为模板pcr扩增出300bp及可以确定为阳性，进一步确认可以进行测序验证；参照步骤(4)的条件进行定量pcr扩增，检测样品的ct值，并利用步骤(4)中的线性方程获得环境中的类胡萝卜素生产菌dna的拷贝数。
[0017]
八氢番茄红素脱氢酶基因(crti)广泛存在于类胡萝卜素生产菌基因组中，其序列保守性强。
[0018]
优选的，步骤(1)所述pcr扩增的反应体系(20μl)为：
[0019][0020]
pcr扩增条件为：预变性94℃30秒，94℃5秒，60℃30秒和72℃1分钟40个循环，延伸72℃10分钟。
[0021]
优选的，所述类胡萝卜素生产细菌包括短波单胞菌和鞘氨醇单胞菌。
[0022]
优选的，所述已知的类胡萝卜素生产细菌为扇贝短波单胞菌(brevundimonas scallop zheng&liu，cctcc:m2019023(参见201910475244.8)。步骤(4)获得的线性方程为：y＝-3.5536x+40.599。构建的标准曲线的r
2
值>0.90，可信度高，扩增效率e>90％。
[0023]
优选的，步骤(4)所述荧光定量pcr扩增的反应体系为：10μl sybr premix ex taq ii(tli rnaseh plus)(2x)，0.8μl目的基因上游引物，0.8μl目的基因下游引物，2μldna模板和6.4μl dd h
2
o；步骤(4)所述荧光定量pcr扩增的扩增条件为：预变性95℃30秒，95℃5秒和60℃30秒45个循环，50℃30秒。
[0024]
优选的，步骤(3)质粒的拷贝数的计算公式：
[0025]
dna拷贝数＝(6.02
×
10
23
)
×
(质粒浓度
×
10-9
)/(质粒碱基数
×
660)。
[0026]
优选的，步骤(5)所述待测环境样品包括水样、泥土样、生物样。
[0027]
与现有技术相比，本发明是一种快速定量检测环境中类胡萝卜素生产细菌的dna的方法，是一种全新的环境中检测类胡萝卜素生产菌的方法。本发明根据类胡萝卜素生产菌中八氢番茄红素脱氢酶基因(crti)的保守性，设计特异性引物，利用pcr扩增来鉴别类胡萝卜素生产菌的阳性菌落，并通过荧光定量pcr方法定量检测环境中类胡萝卜素生产菌。在不进行细菌培养的基础上，快捷、简便、准确地定性、定量检测环境中的类胡萝卜素生产菌。相比传统的16s rrna结合类胡萝卜素提取鉴定的方法，具有检测效率高，准确性好，灵敏度高，操作简便，易于推广等特点；具有广阔的应用前景。
附图说明
[0028]
图1为细菌的类胡萝卜素合成通路图；
[0029]
图2为本发明的八氢番茄红素脱氢酶(crti)的多序列同源性比对和相应的引物；
[0030]
图3为特异性引物扩增类胡萝卜素生产的阳性和阴性细菌的凝胶电泳图；
[0031]
图4为crti基因的定量pcr标准曲线图。
具体实施方式
[0032]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
[0033]
实施例1
[0034]
引物设计及特异性验证
[0035]
(1)引物序列设计与筛选
[0036]
利用多种细菌(brevundimonas vesicularis，methylobacterium extorquens am1和sphingomonas elodea strain atcc 31461等)的crti同源区域设计出的特异性引物，如图1。
[0037]
下载genebank中的细菌八氢番茄红素脱氢酶基因(crti)的蛋白序列，进行多序列的同源性比对，如图2。根据引物设计的原则，使用软件premier 5.0进行引物设计。并进行ncbi的特异性比对，筛选出一对特异性引物(crtif和crtir)。完成引物的设计和合成。
[0038]
特异性引物序列为：
[0039]
上游引物crtif：cctccackaggraaccatacacccca
[0040]
下游引物crtir：caractacagtnttcgaggc。
[0041]
(2)引物的特异性验证
[0042]
分别对类胡萝卜素生产阳性细菌：短波单胞菌(brevundimonas vesicularis)，鞘氨醇单胞菌(sphingomonas paucimobilis和sphingomonas sp.nic1)和类胡萝卜素生产阴性细菌：副溶血弧菌(vibrio parahemolyticus)和大肠杆菌(escherichia coli)的细菌基因组dna为模板进行引物特异性验证pcr实验。以上细菌都来源于本发明实验室的独立和培养。pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明阳性细菌均出现300bp条带，而阴性细菌都没有，如图3。
[0043]
pcr反应体系为：10μl 2
×
easytaq pcr supermix，1μl dna模板，1μl上下游引物和7μl ddh
2
o。pcr反应条件为：预变性94℃30秒，94℃5秒，60℃30秒和72℃1分钟40个循环，
延伸72℃10分钟。
[0044]
实施例2：
[0045]
扇贝短波单胞菌crti基因克隆测序及质粒标准曲线的构建
[0046]
(1)扇贝短波单胞菌crti基因克隆及测序
[0047]
用tiangen公司的细菌dna提取试剂盒(dp302-02)提取短波单胞菌基因组dna，以该菌dna为模板进行特异性引物(crtif和crtir)pcr扩增，pcr反应体系和条件参照实施例1。pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，并用tiangen凝胶回收试剂盒进行切胶纯化回收，回收的产物与takara公司的pmd18t载体在16℃连接2小时。连接产物转化至感受态细胞(dh5α)并涂平板培养过夜。挑取阳性单克隆菌落用lb培养基进行扩大培养，阳性菌液送北京六合华大基因科技有限公司进行序列测定。测得序列长度为297bp，序列如seq id no.1所示，并且经过blast分析，确定其为短波单胞菌crti基因序列。
[0048]
(2)质粒标准曲线的构建
[0049]
以上述扩大培养的阳性菌液为材料，进行质粒提取(tiangen的小量质粒提取试剂盒)。在紫外分光光度计上测定提取质粒浓度，计算出短波单胞菌crti基因的拷贝数，计算公式为：基因拷贝数＝(6.02
×
10
23
)
×
(质粒浓度
×
10-9
)/(质粒碱基数
×
660)。计算结果得到短波单胞菌crti基因的拷贝数为8.71
×
10
9
copies/μl。再将提取的质粒进行10倍梯度稀释，得到8.71
×
10
2
，8.71
×
10
3
，8.71
×
10
4
，8.71
×
10
5
，8.71
×
10
6
，8.71
×
10
7
和8.71
×
10
8
copies/μl梯度浓度，并以此为模板进行荧光定量pcr扩增，测定其对应的ct值，构建标准曲线。
[0050]
实施结果：得到标准曲线(图4)和对应的线性方程：y＝-3.5536x+40.599。其中标准曲线的相关系数r
2
值为0.99，可行度高。并且扩增效率e为91.2％，符合荧光定量对标准曲线的要求。
[0051]
实施例3：检测海洋贝类(华贵栉孔扇贝)肠道内的类胡萝卜素生产细菌dna的拷贝数。
[0052]
无菌条件下，收集华贵栉孔扇贝的肠道内容物样品，对样品进行tiangen粪便试剂盒提取其dna。按照实施例1和2分别进行pcr扩增和荧光定量pcr扩增检测。实施结果：pcr扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测出现300bp条带，而对照组(dd h
2
o)未出现目的条带。荧光定量pcr测得其对应的ct值为21.2，结合已构建的标准曲线，计算得到该样品的类胡萝卜素生产菌的拷贝数为2.87
×
10
5
copies/μl。
[0053]
另外，凡利用类胡萝卜素合成酶关键基因快速检测类胡萝卜素生产细菌的方法也为本发明所述创意思想之所及。

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