一种乙型肝炎病毒检测试剂盒的制作方法

[0001]
本发明涉及一种乙型肝炎病毒检测试剂盒，属于检测试剂盒领域。


背景技术：

[0002]
据世界卫生组织(world health organization，who)报道，全球曾感染过乙肝病毒的人口超过20亿人，其中3.5-4亿人为慢性感染者。15％-40％的乙肝病毒慢性携带者病情将恶化，每年约有50-100万人口死于乙肝性肝硬化和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，hcc)。感染hbv后表现为急性自限性或是进入慢性病程，慢性hbv感染是导致肝硬化和肝细胞癌的最主要原因。
[0003]
我国是病毒性肝炎高流行区域，hbv携带者达1.3亿，其中慢性乙肝有2300万，在我国法定传染病中由乙肝病毒所致的死亡高居前列。我国乙肝疫苗计划免疫管理始于1992年；随后2002年政府对乙肝的防控高度重视，规定对新生儿免费接种，使中国人群中hbsag携带率从1992年的9.75％降至2006年的7.2％，目前我国疫苗接种率达98％以上，有效阻止了乙肝病毒的母婴垂直传播。但免疫虽然有效，仍然不能完全阻断hbv的母婴传播。持续性乙肝病毒感染与多种因素相关，可能受病毒、免疫反应和基因多样性的影响。约63％-85％的乙肝疫苗接种效果能被遗传因素解释。乙肝疫苗作用效果与乙肝病毒变异相关，且受母亲的乙肝病毒载量和hbeag滴度影响。研究表明micrornas的表达水平和肝癌转移、肝硬化和乙肝病毒感染相关，肝癌中表达异常的mirna己经发现的包括，mir-18、mir-21、mir-26、 mir-29、mir-101、mir-122、mir-125a、mir-139a、mir-143、mir-195、mir-199a/b-3p、 mir-221、mir-222、mir-224和let-7a等，在细胞生长、发育的各个过程中进行上调和下调。近年来的研究表明mir196a基因多态性在中国变异率高，与肿瘤发生机制相关，在细胞中还参与炎症反应、抗病毒作用、间叶干细胞分化及免疫反应。meta分析报道mir196a2c>t多态性和乙肝肝细胞癌的易感性显著相关，进行人种分层分析显示在亚洲人和高加索人中均检测到此关联。mir 196ac>t可能影响肝癌细胞的增殖和凋亡，研究显示这与调节凋亡因子 caspase-3和影响同源基因hoxb8的表达相关。儿童是乙肝的易感和高发人群，但是目前还没有针对儿童乙肝感染和mir 196ac>t相关检测的检测试剂盒。因此研究设计一款基于 mir-196a的乙肝检测试剂盒，对于临床大范围筛查和疾控有一定的作用。


技术实现要素：

[0004]
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得一种乙型肝炎病毒检测试剂盒。
[0005]
为实现上述发明目的，本发明采用的乙型肝炎病毒检测试剂盒的技术方案如下：
[0006]
所述检测试剂盒包括snp位点的两对上下游扩增引物及扩增模板提取试剂、dna聚合酶、dntps和缓冲液，第一轮扩增产物长于第二轮扩增产物且包含第二轮扩增产物，第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板进行，其中第一轮扩增引物如序列表seq id no：1～2所示，第二轮扩增引物如序列表seq id no：3～4所示。
[0007]
本发明中由于待测序列的特殊性，设计了两轮反向引物序列相同的扩增试剂盒，该试剂盒特异性高且扩增结果准确，使用简单方便，为后续的测序工作奠定了良好的基础。
[0008]
上述检测方法中提供的引物序列仅为基础的引物序列，检测过程中可以根据最后检测手段的不同对引物序列进行修饰，如在引物中加入荧光标记、生物素标记、纳米微球、磁珠等，修饰方法可采用本领域常规方法，上述各类型修饰应认为落入本发明的保护范围之内。
[0009]
本发明中的检测样本可以选自血样或口腔拭子，基因筛查无痛无副作用，可以快速准确地为乳腺原位癌的临床用药提供遗传方面的依据，便于临床用药及预后跟踪。
[0010]
扩增产物的检测方法可以参考现有的各类检测方法，在此不做限制。
[0011]
优选的，所述检测方法中第一轮和第二轮扩增体系相比，第二轮pcr扩增体系的体积为第一轮pcr扩增体系体积的至少2倍，引物浓度等比例改变，但模板加入量相同。上述扩增体系可以保证第二轮pcr扩增的彻底进行。
[0012]
优选的，为了保证两轮扩增反应均能够彻底进行，第二轮pcr扩增体系的变性时间延长，便于模板双链充分打开，退火温度略高于第一轮，但由于片段较短，可以适当减少循环数，保证扩增产物的特异性。
[0013]
作为一种优选的实施方式，两轮扩增体系的反应程序具体为：第一轮pcr扩增体系为 25μl，以提取的基因组dna为模板，反应程序为94℃2min；94℃15sec，50℃20sec， 72℃2min，共35个循环，72℃10min，4℃保温；
[0014]
第二轮pcr扩增体系如下表2所示，反应体系为50μl，以第一轮产物为模板，反应程序为94℃4min；94℃15sec，55℃20sec，72℃2min，共30个循环，72℃10min，4℃保温。
[0015]
作为一种优选的实施方式，两轮pcr反应中均采用primix taq酶，第一轮中加入10μ l，第二轮中加入25μl。
[0016]
扩增产物可以直接采用琼脂糖凝胶电泳进行定性检测，也可以进行其他方式的dna检测。
[0017]
本发明的试剂盒中包括第一轮扩增引物及其必要试剂，第二轮扩增引物及其必要试剂。
[0018]
优选的，扩增必要试剂中dna聚合酶为primix taq酶。
[0019]
优选的，所述试剂盒还包括dna回收试剂。
[0020]
本发明还提供了一种上述乙型肝炎病毒检测试剂盒的检测方法，所述检测方法针对第二轮扩增产物进行基因测序，第二轮扩增产物以第一轮扩增产物作为模板进行扩增。
[0021]
本发明还提供了一种乙型肝炎病毒检测试剂盒的应用，所述检测试剂盒可用于乳腺原位癌发病风险的基因诊断，以及mir 196ac>t的rs11614913位点作为其他诊断标志物或检测指标的检测。
[0022]
与现有技术相比，本发明采用两轮扩增的方法对同一段片段进行重复扩增，第二轮引物结合在第一次pcr产物内部，使得第二次pcr扩增片断短于第一次扩增，由于第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低，因此两轮扩增可以很好地修正第一次扩增中产生的错误片断，扩增的特异性非常高，基本杜绝了引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。高效准确地扩增待扩增片段并进行焦磷酸测序检测snp位点，可以快速的给出结论，便于临床对乙肝病毒儿童突破感染的疗效预判，取样方便并且检测高效快速成
本低，为患者减轻了经济及身体上的负担。
具体实施方式
[0023]
下面结合实施例对本发明提供的乙型肝炎病毒检测试剂盒作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0024]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
[0025]
一、试剂盒组成
[0026]
本实施例中的快速扩增试剂盒为针对mir 196ac>t的rs11614913位点进行两轮扩增的巢式pcr试剂盒，其中包括snp位点的两对上下游扩增引物及扩增模板提取试剂、dna 聚合酶、dntps和缓冲液。taq dna聚合酶为takara公司的ex taq dna聚合酶。
[0027]
本实施例试剂盒中采用的dna模板为处理后提取的人血dna模板，对于采集的人全血或组织来说，需要预先进行处理。如待扩增样品为未经处理的全血样品，需采用用于全血样品pcr的缓冲液，其中含有100mmol/l tris-hcl，50mmol/l kcl，ph 9.3～9.5。
[0028]
ncbi中记录的rs11614913为“c/t”碱基突变，序列中以“y”表示，序列具体如下：
[0029]
agctacccac attcgctgag aagcctaaac cgagctgaga gggagaggat cagagggagt ctagcaggag agtgcaggag agccagatgg acaagacagg ggacccagct ccagagtgga aggaagatcc agcttccccc agggccaggg ccagatgcag gggaatagct ccactgcggt gctgggggtg gggcaggtat ttggccgcca gtggtcccat ttcaccagat ttttcctgag caatttgctt agaccagaaa ctaatgaagg cagtcagacc ccttacccac ccagcaaccc aaagtctact ctctagtcct tagggaggtt gtgggggcgg aaagggggac ggggctgaat ttcttccttc cccaaccccc ttcccttctc ctccagatag atgcaaagct gaatctcccg ccctgctcgc tcagctgatc tgtggcttag gtagtttcat gttgttggga ttgagttttg aactcggcaa caagaaactg
[0030]
y
[0031]
ctgagttaca tcagtcggtt ttcgtcgagg gccccaaccc acctctccca ctcctaccct ccccagtggg actgccccac tgccccctcc cagatagggc aaagtgggtg cagaccaagg aggacaagct gtgagtgggg ttgcagaaca agtctggaga accctgcttt atgccgtcct ctcaacctat cccaatccct gtgattaagg gagaggagtc tttcctgcag ctattgtctc ctgggcccag ctgatggaga cagacaaaga gggtccagcc aattccaagg aaattcagga gtttgagtaa gaggtggcct ggcgggccag ctcagttggg cagcagggtg gggcagaatt attagcagaa agaggagcac agaaagagaa gacggtctct ggaatggtta gcctctccca cctaccacct ccagtcgact ggggctcaag attctcctta gaaaagtggg gtacctggag gttccaagag ttggggaact
[0032]
二、设计引物
[0033]
根据ncbi记录的rs11614913序列设计引物，采用primer premier 5设计两对扩增引物，并委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。两对扩增引物对应两轮pcr反应，第二轮待扩增片段包含于第一轮待扩增片段中，引物序列如序列表seq id no：1～4所示，f1、f2为forward primer， r1、r2为reverse primer。由于模板序列的特殊性，因此本发明中的两对引物的反向引物序列为同一段序列，待测snp位点均落入两段扩增产物中，具体如下表1所示：
[0034]
表1
[0035][0036][0037]
三、pcr反应及结果鉴定
[0038]
扩增引物如上表1所示，扩增体系如下表2所示，第一轮pcr扩增体系为25μl，以提取的基因组dna为模板，反应程序为94℃2min；94℃15sec，50℃20sec，72℃2min，共35个循环，72℃10min，4℃保温。
[0039]
第二轮pcr扩增体系如下表2所示，反应体系为50μl，以第一轮产物为模板，反应程序为94℃4min；94℃15sec，50℃20sec，72℃2min，共30个循环，72℃10min，4℃保温。
[0040]
两轮pcr反应体系具体如下表2所示：
[0041]
表2
[0042]
试剂第一轮使用量(μl)第二轮使用量(μl)primix taq
tm
(2
×
)10.025forward primer(20μm)0.51.0reverse primer(20μm)0.51.0模板5.05.0rnase free ddh
2
o7.221总量2550
[0043]
pcr产物纯化后经1％琼脂糖凝胶电泳，上样缓冲液中含有追踪染料，每孔上样量相同，电泳结果中400kb附近，200kb附近之间条带清晰可见。说明扩增体系稳定有效，引物扩增无误。
[0044]
四、诊断标志物单核苷酸多态性位点的检测
[0045]
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
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[0047]
[0048]

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