一种瓜氨酸催化转化基因的单核苷酸多态性检测试剂盒的制作方法

[0001]
本发明涉及一种瓜氨酸催化转化基因的单核苷酸多态性检测试剂盒，属于检测试剂盒领域。


背景技术：

[0002]
肽基精氨酸脱亚氨酶(peptidylarginine deiminase，pad)在较高钙离子浓度条件下可催化蛋白质中的精氨酸残基转换为瓜氨酸残基。由于蛋白质瓜氨酸化后结构的稳定性发生变化， pad介导的蛋白质翻译后修饰可导致目标蛋白质的结构和调控功能发生一系列改变，结果影响生理病理过程。人pad家族包含5个成员，分别为padi 1、2、3、4、6，它们均集聚在染色体1p36.13区域内。近年来，有研究者发现pad家族成员及其瓜氨酸化功能在肿瘤发生过程中起着重要作用。mcelwee等用转录组测序技术发现，人乳腺癌细胞系中padi2mrna 表达水平与原癌基因人类表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor-2，her2) 的高表达相关，而her2是诊断乳腺癌公认的分子标志物。cherrington等发现，在犬乳腺肿瘤细胞cmt25中表皮细胞生长因子(epidermal growth factor，egf)可上调padi2的转录和翻译，而padi2可通过增强肿瘤微环境的炎症反应促进肿瘤进展。这些发现提示padi2可能参与乳腺癌等肿瘤的癌变过程。
[0003]
通过进一步深入研究，发现padi2基因的snp位点除了乳腺癌外，多个位点与乳腺癌、宫颈癌、胃癌、肺癌、直肠癌发病明显相关。免疫组化实验发现，padi2在95％的乳腺浸润性导管癌、97.5％的结肠腺癌、88％的食管癌、92.5％的肺癌和90％甲状腺乳头状癌组织高表达。除了一些间充质样细胞和内皮细胞外，padi2在正常宫颈组织、肺组织、卵巢组织或甲状腺组织中不表达，在乳腺、结肠、食管、胃、肝和直肠正常组织的上皮细胞中低表达。 elisa实验发现padi2在86％的肝癌、38％宫颈癌和32％胃癌患者外周血中表达水平上升2 倍以上。通过对上述患者的padi2基因进行筛查，筛选出padi2基因的rs2746533、rs2076616、 rs10788656位点与上述癌症高度相关。故设计一款瓜氨酸催化转化基因的单核苷酸多态性检测试剂盒，可以作为临床癌症发病情况的前期筛查，具有十分重要的临床意义。


技术实现要素：

[0004]
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得一种瓜氨酸催化转化基因的单核苷酸多态性检测试剂盒。
[0005]
为实现上述发明目的，本发明采用的瓜氨酸催化转化基因的单核苷酸多态性检测试剂盒对padi2基因多态性进行检测，具体技术方案如下：
[0006]
所述试剂盒内包括三对扩增引物、taq酶、dntps和缓冲液，其中扩增引物用于扩增 rs2746533位点、rs2076616位点和rs10788656位点中的至少两个snp位点，每对引物分别对应其中一个snp位点的上下游区域。试剂盒中包含三对引物分别对应三个snp位点，扩增时可以同时扩增三个snp位点或任意选择两个位点进行扩增，使得试剂盒的使用更加灵活，并且三对引物经过精确设计，扩增效率高错配低，扩增产物易检测易分离，便于进一步的测序
或检测工作的顺利进行。
[0007]
优选的，rs2746533位点的上下游扩增引物序列如序列表seq id no：1～2所示。
[0008]
优选的，rs2076616位点的上下游扩增引物序列如序列表seq id no：3～4所示。
[0009]
优选的，rs10788656位点的上下游扩增引物序列如序列表seq id no：5～6所示。
[0010]
优选的，所述扩增体系中，每个snp位点的扩增引物和模板的加入量相同。
[0011]
本发明中的扩增试剂盒一般采用处理过的dna样品作为扩增模板，样品一般来源于人全血或组织，处理样品可以减少血液中的免疫球蛋白g、血红蛋白和乳铁蛋白对pcr反应体系的干扰。
[0012]
优选的，所述扩增试剂盒还包括全血样品pcr缓冲液，所述缓冲液含有100mmol/l tris-hcl，50mmol/l kcl，ph 9.3～9.5。全血样品pcr缓冲液是本发明的一种优选的实施方案，其他类型的全血pcr试剂均可以采用，不限于本发明中的缓冲液和缓冲液配方。
[0013]
优选的，扩增体系为25μl的pcr体系，体系中同时含有rs2746533位点、rs2076616 位点和rs10788656位点的扩增引物。
[0014]
所述扩增体系具体为：
[0015]
10
×
pcr buffer 2μl；
[0016]
mg
2+
(25mmol/l)1μl；
[0017]
dntps(25mmol/l)0.6μl；
[0018]
taq酶(5u/μl)0.3μl；
[0019]
模板2μl；
[0020]
rs2746533位点、rs2076616位点和rs10788656位点上下游引物(10μmol/l)各1μl；无菌双蒸水补齐至25μl。
[0021]
本试剂盒推荐的多重pcr反应条件为：94℃预变性5.5min；然后94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸50s，36个循环后，再次72℃延伸5min。
[0022]
本试剂盒中一般采用提纯处理后的dna样本进行扩增检测。但本试剂盒中还包括全血扩增缓冲液，便于将采集到的人全血样品直接进行扩增，扩增时以全血样品缓冲液替换现有的pcr体系中的pcr buffer。
[0023]
与现有技术相比，本发明采用多重pcr的扩增方法，同时扩增padi2信号通路的多个重要snp位点，且可以根据实际需要灵活选择扩增的位点组合，可以起到一盒多用的作用，试剂盒中的引物特异性高，错配率低，引物长度和t
m
值设计合理，扩增产物便于检测分离。一次扩增多条目的产物，不仅大大提高了扩增效率，降低了扩增成本。这种检测试剂盒可以扩展延伸到其他的snp位点检测中，具有良好的推广价值。
附图说明
[0024]
图1是本发明提供的pcr扩增产物电泳图。
具体实施方式
[0025]
下面结合实施例对本发明提供的瓜氨酸催化转化基因的单核苷酸多态性检测试剂盒作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0026]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
[0027]
本实施例中的快速扩增试剂盒为针对padi2的三个频率较高的snp位点进行同时扩增的多重pcr试剂盒，其中包括三对snp位点的上下游扩增引物及扩增模板、taq dna聚合酶、dntps和缓冲液。taq dna聚合酶为takara公司的ex taq dna聚合酶。本实施例中的三个模板分别为rs2746533、rs2076616、rs10788656位点。
[0028]
本实施例试剂盒中采用的dna模板为处理后的提取的dna模板，对于采集的人全血或组织来说，需要预先进行处理。如待扩增样品为未经处理的全血样品，需采用用于全血样品pcr的缓冲液，其中含有100mmol/l tris-hcl，50mmol/l kcl，ph 9.3～9.5。
[0029]
一、扩增引物设计
[0030]
本发明的瓜氨酸催化转化基因的单核苷酸多态性检测试剂盒以，padi2基因的 rs2746533、rs2076616、rs10788656位点作为检测对象。
[0031]
ncbi中记录的rs2746533为“c/t”碱基突变，序列中以“y”表示，序列具体如下： taaatgaattataatcccattttgaagaaccgatttataaccaatgaaaaggttataatg taatttatattcttggaggaacaagattttcatttgggattatttccttcaaccattcaa caaacatttgttgtatgccactaagcgccaggcacggcgttgggctctgcaaacacagtg gttagtagcagtctggacctggtccctactggcatggaacccatcactccccaacatgca aagcccacatttaaaggccagcctctgccccttcagtgatgcgctctttagaaatgccag y
[0032]
ccactatattcagaaatccgcagggcacaaaacttccagcaagtcactgttgtggtgaaa tgggcagtgggggtggggggtcttctttaaacaggcccccttcccatctacctagccagt acccatccaatgagtccccagagcctccagaagctgttgtctcctctctggggacagcag ctcctgcctttggaggccaaagccccagatctctccagccccagagctgaaaacaccaag tgcctatttgagggtgtctgtctggagacttagagtttgtcatgtgtgtgtgtgtgtttg
[0033]
ncbi中记录的rs2076616为“c/t”碱基突变，序列中以“y”表示，序列具体如下： cctccaccacagggggctaaccccaggggccagggtgggtctcctactagtgggccattc ctatgctatgctccaccctgctcaaagcgccaaaggggtgggtccaggctaggagacctc gatgccccccagcaaagcctgcacgtgtctgccagggtcctctgagccatgctcctggga tcagtctccttgctgcttctgctccccacggattccctgtgggcaatgtttcctgacaca ctccacgcctgtgtcctggcctgccctgctccctgcctaggtctaaggcccagagtcctg ctgattagcgcgaggctctaagcagccacccaggtggggtttgctgaccacctactgcgc gctctgtacttcctgccccactctgacccctcccccaactgtgggttataccaactctga ctgcaggctgaaccccaaatcccagtttcaggttgtgccctaccctggggccaggcatct cagccagccttgctcttgct
[0034]
y
[0035]
tggggagaaactggatgaggagaagaggtcctgtccctctagagaagcccccatcactga gggcgtgctgtgctcacaagaatctctatcacaaagacctttcatccccagaccctagcc tctcaggcccaccctgtttcgctcagaaaaaaagggaaggacctggctgctctcgcaaac acaagagcccctcatttttatccccaggccactttgggaaaggatacaatgggtgctata gaaaggtgaggctggatctagctgagatgtatgagaatgagccctggcagccgactgccc aggttcaactcctggtttaaccaccacgagacactaggcaaatgaattaaacttcctgtt aatttccttagttaagggtagtttgccatagtttctccatctgtaagacagaacgtccaa aagtttctgctgccgggggtggttgtgagcatccaaacttgtgaagttctacttacaaag caccctcaagctccctggga
[0036]
ncbi中记录的rs10788656为“c/g”碱基突变，序列中以“s”表示，序列具体如下：
[0037]
atcactgtggccatgtctcctgcctaccatggaatcccagaacccaggacatggatatgc tcagtgt
agtctttggcaatacatgaatgaatgcacctgcccttcttggctttccaagct gtattacacaagtgatttaaaaaacaaacgaacaaacaaaaaaaacccagaaatcaggtc atgggctttcttgaaaatattcactggctcctcagtgcctacccatacaagaatatccaa actcttcatcctggtgttgaactaggcacatttggccattgcaactcagcttgactctct ggtttcattttctgcggttccttccaccacttcagctccctgcattgttccatctactgt gcattttgacatatgttgttccttttaccagcaagactttcccctgacttctctgcctgg caaatgtccatctctccttgaagacctaactccatccatttgcccccacagttactggcc cttttggcagttcactcctt
[0038]
s
[0039]
aaggtagggattggatcttcttgtttgtttgtttgtttgtttcagcacctggcctagtat gggcacaccgtaagtataaatgtttgctgcaggagggctggaggaggcgggcttacttat atggtcgttcattcactcaacatgtatttactgagcacttacaatgtgccaggcacagtt ctaggcattgaggggtagattagtgaaaaagcaaacacattccctgggcccatggaaaag acagacctttttttttttttttttttttttgggacggagtcttcctctgttgcccaggct ggagtgcagtggcatgatcttggctcactgcaatctctacctcctgggttcaagcgattc tcctgcctcagcctcctgagtagccgggattataggagcccaccaccacgcctggctatt tttaatttttgtattttttagtagagacggggtttcaccatgttgtccaggctggtttgg gactcctgacttcaagtgat
[0040]
根据上述序列设计三对扩增引物，引物序列具体如下：
[0041][0042][0043]
二、多重pcr
[0044]
抽取静脉血进行全基因组dna的抽提，后提后的dna序列为扩增模板。
[0045]
多重选择25μl的pcr体系，其中
[0046]
10
×
pcr buffer 2μl；
[0047]
mg
2+
(25mmol/l)1μl；
[0048]
dntps(25mmol/l)0.6μl；
[0049]
taq酶(5u/μl)0.3μl；
[0050]
模板2μl；
[0051]
rs2746533位点、rs2076616位点和rs10788656位点上下游引物(10μmol/l)各1μl；无菌双蒸水补齐至25μl。
[0052]
pcr反应条件：94℃预变性5.5min；然后94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸50s， 36个循环后，再次72℃延伸5min。
[0053]
三、pcr产物验证
[0054]
选择2％琼脂糖凝胶电泳，电泳图如图1所示，条带1为dna marker，条带2为阴性对照，条带3为扩增产物，电泳结果证明扩增结果无误。
[0055]
将电泳结果胶回收后送测序，测序结果也与目的产物序列一致。
[0056]
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
[0057]
[0058]
[0059]
[0060]

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