一种争光霉素族化合物的铜螯合物的纯化方法与流程

[0001]
本发明涉及一种争光霉素族化合物的铜螯合物的纯化方法。


背景技术：

[0002]
争光霉素族化合物包括平阳霉素(pingyangmycin，争光霉素a5)、博安霉素(boanmycin，争光霉素a6)、博宁霉素(boningmycin)是由我国学者自主研制开发，由于结构和活性都极为相似，因此统称为争光霉素族糖肽类抗肿瘤抗生素。其中平阳霉素是从我国浙江平阳县土壤中的放线菌培养液中分离得到的抗肿瘤抗生素。博安霉素，是轮枝链霉素菌平阳新变种所产生，属于平阳霉素的更新换代产品。博宁霉素是博安霉素末端氨体游离氨基的乙酰化物。平阳霉素和博安霉素已投入临床应用。主要抑制胸腺嘧啶核苷掺入dna，与dna结合使之破坏。另外它也能使dna单链断裂，并释放出部分游离碱基，可能因此破坏dna模板，阻止dna复制。由于争光霉素族化合物的铜螯合物稳定性较好便于保存，所以争光霉素族化合物多以铜螯合物的形式贮存，在需要使用时经脱铜精制即可得到铜螯合物原料药，然后制成药物制剂投入临床使用。
[0003]
由于争光霉素族化合物及其铜螯合物为极性很大的水溶性成分，分离纯化有相当的难度，因此铜螯合物的纯度成为制约争光霉素族化合物最终产品质量的瓶颈。目前，争光霉素族化合物的传统生产方法一般都是由微生物发酵直接获得铜螯合物，或者发酵后加铜盐形成铜螯合物，采用大孔弱酸树脂从发酵液中富集铜鳌合争光霉素族化合物(例如平阳霉素、博安霉素、博宁霉素)，盐酸洗脱，阴离子树脂中和，大孔树脂初步纯化，丙酮盐酸溶液解吸，解吸液浓缩冷冻干燥得粗品。然后氧化铝层析进一步纯化，之后再用葡聚糖骨架的cm-sephadex-c-25填料。甲酸铵洗脱层析，最后还要再用大孔树脂浓缩脱盐，冷冻干燥得蓝色冻干粉(张瑞，许鸿章，娄志贤等.争光霉素的研究-.争光霉素的分离、纯化、理化性质及鉴定[j].微生物学报,1980(1):78-83.)。该方法程序繁琐，周期长，溶剂和水用量大，收率低，提取产品纯度偏低。
[0004]
曾佳烽等(cn104231057a：曾佳烽,潘俊芳,王启运,等.平阳霉素及其同族化合物的铜螯合物的纯化方法)从平阳霉素的铜螯合物粗品出发，方法(1)将单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯(ps-dvb，简称psd)层析介质单独使用，或者，方法(2)将单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯(ps-dvb，简称psd)层析介质与单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质组合使用，作为填料进行层析。相对传统工艺效率有所提高，周期有所缩短，纯度大幅度提高。但该方法仍存在一定的不足：
[0005]
(1)不适用于纯度较低的粗品原料的纯化，必须使用纯度较高的平阳霉素或其同族化合物的铜螯合物粗品(纯度20％～60％)(详见其说明书第[0015]段)。纯度较低的争光霉素族铜螯合物粗品样品含有较多的色素和微生物代谢产生的杂蛋白等未知杂质，采用曾佳烽等公开的专利方法无法有效去除这些杂质，且其采用的分离层析介质容易被纯度较低的样品污染中毒，再生效果差，影响后续工业批量化生产。
[0006]
(2)不论方法(1)或(2)，在使用单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯(ps-dvb，简称psd)层
析介质进行纯化时，由于psd基质微球分离样品原理和普通大孔树脂相似，一般均为水相样品上柱吸附，然后采用不同浓度有机溶剂水相混合溶液来洗脱分离。争光霉素族化合物的铜螯合物为极性很大的水溶性成分，分离纯化有相当的难度；一般水相上柱，采用纯水相是无法洗脱下来的；都要使用有机溶剂，例如甲醇、乙醇、丙酮水溶液等度洗脱或梯度洗脱。争光霉素族样品上样时为纯水相，采用有机溶剂和水相混合体系洗脱，容易造成psd基质微球柱床塌陷，影响洗脱时的层析效果。
[0007]
(3)单次纯化的效果较低，需重复多次才能达到98％以上的纯度。
[0008]
方法(1)中，单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯(ps-dvb，简称psd)层析介质单独使用；单次层析，纯度一般提高到70％～85％，回收率>75％；需再经2～3次层析，纯度才能达到97％以上(详见其说明书第[0015]段)。由其实施例1-5、8-9可进一步证实，使用纯度低于55％的粗品，单次层析纯度仅能提高到89％以下，单独使用ps-dvb至少需三次才能达到98％以上的纯度；若使用纯度高于55％的粗品，单独使用ps-dvb仍需二到三次才能达到98％以上的纯度。
[0009]
方法(2)中，单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯(ps-dvb，简称psd)层析介质与单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质组合使用；以单分散聚甲基丙烯酸酯混合型阳离子交换层析介质为填料进行层析，单次层析，用于粗品纯化，纯度可提高20％～55％，回收率>75％，洗脱后，都要用方法(1)中ps-dvb进行脱盐。因此，通常实际要进行四次洗脱才能达到98％以上的纯度。


技术实现要素：

[0010]
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的争光霉素族化合物的铜螯合物纯化方法不足的缺陷而提供了一种争光霉素族化合物的铜螯合物的纯化方法。本发明的纯化工艺直接从传统工艺做出的争光霉素族化合物的铜螯合物粗品的富集浓缩液(纯度低于15％)出发，仅经两次层析分离，不需要循环套用即可得到总收率达55％以上，hplc面积归一法纯度98％以上的产品。可大幅度降低原工艺废水排放量30％以上，有效缩短工艺周期一半左右，分离介质相对原工艺低廉且使用寿命长，易于工业放大生产，具有较高的工业应用价值。
[0011]
本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题的。
[0012]
本发明提供了一种争光霉素族化合物的铜螯合物的纯化方法，其包括如下步骤，将含争光霉素族化合物的铜螯合物粗品的水溶液进行层析，层析填料为单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯层析介质，所述的单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯层析介质的粒径为10μm～60μm，层析的洗脱剂依次为铵盐的水溶液和水；收集洗脱液水，得到含争光霉素族化合物的铜螯合物纯品的水溶液即可；所述的铵盐在所述的水溶液中的质量百分比浓度为0.5％～1.5％；所述的含争光霉素族化合物的铜螯合物粗品的水溶液中，争光霉素族化合物的铜螯合物的纯度为大于50％。
[0013]
所述的争光霉素族化合物的铜螯合物可为本领域常规的由轮枝链霉菌平阳变种或其新变种(例如streptomyces verticillius var.pingyangensis cpcc200554、streptomyces verticillius var.pingyangensis cpcc 200552)菌种发酵得到的争光霉素族化合物(例如平阳霉素、博安霉素和博宁霉素中的一种或多种)与铜离子形成的螯合
物；本发明中，所述的争光霉素族化合物的铜螯合物可为平阳霉素的铜螯合物、博安霉素的铜螯合物和博宁霉素的铜螯合物中的一种或多种；又例如平阳霉素的铜螯合物和/或博安霉素的铜螯合物。
[0014]
所述的铵盐可为本领域中常规的铵盐，例如氯化铵、乙酸铵、甲酸铵、磷酸铵、磷酸二氢铵和磷酸氢铵中的一种或多种(例如氯化铵和/或乙酸铵)。
[0015]
所述的铵盐的水溶液的质量百分比浓度较佳地为1.0％。
[0016]
所述的含争光霉素族化合物的铜螯合物粗品的水溶液的ph值可为本领域常规的ph值，例如2.5～5.5，本发明中较佳地为4.0～4.5(例如4.1、4.2、4.25、4.33或4.4)。所述的ph值可采用本领域中常规的酸或碱调节得到。本领域技术人员可以理解，所述的酸的阴离子较佳地与所述的洗脱剂铵盐的阴离子相同；所述的酸可为盐酸、乙酸、甲酸和磷酸中的一种或多种(例如盐酸，又例如6m盐酸)，所述的碱可为碱金属氢氧化物(例如氢氧化钠和/或氢氧化钾)、碱金属碳酸盐(例如碳酸钠和/或碳酸钾)和碱金属碳酸氢盐(例如碳酸氢钠和/或碳酸氢钾)中的一种或多种(又例如氢氧化钠)。
[0017]
所述的单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯层析介质的粒径较佳地为30μm。
[0018]
所述的单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯层析介质的孔径可为本领域常规的孔径，例如(又例如)。
[0019]
所述的单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯层析介质较佳地为poly
rp-10、poly
rp-30、poly
rp-60、poly
rp-40、lxms-15、lxms-35、lxms-60、unips
tm-20、unips
tm-30、unips
tm-40或unips
tm-50，较佳地为unips
tm-30、poly rp-30或lxms-35。(poly
rp-10、poly
rp-30、poly
rp-40、poly
rp-60为苏州赛分科技有限公司提供，lxms-15、lxms-35、lxms-60为西安蓝晓科技新材料有限公司提供，unips
tm-20、unips
tm-30、unips
tm-40、unips
tm-50为苏州纳微科技股份有限公司提供)。
[0020]
所述的层析柱可采用本领域常规的方法进行预处理，例如预先用洗脱剂铵盐的水溶液平衡，本发明中较佳地预先用所述的铵盐的水溶液2bv平衡。
[0021]
所述的层析柱的高径比可为本领域常规的高径比，例如8:1～20:1，本发明中较佳地为10:1～15:1(例如10:1、12:1、14:1)。
[0022]
所述的洗脱剂的流速可为本领域常规的流速，例如0.05bv/h～0.2bv/h(又例如0.3bv/h～0.5bv/h)。
[0023]
所述的洗脱剂为铵盐的水溶液时，所述的铵盐的水溶液的用量可为4bv～6bv(例如5bv)。
[0024]
在所述的含争光霉素族化合物的铜螯合物粗品的水溶液中，所述的争光霉素族化合物的铜螯合物在所述的水溶液中的浓度较佳地为20g/l～65g/l(例如23g/l、23.4g/l、24g/l、24.53g/l、26g/l、28.57g/l、29g/l、30.81g/l、31g/l、33.78g/l、34.21g/l、43.5g/l、47.5g/l、48.4g/l、54.5g/l、56.14g/l、62.35g/l)。
[0025]
所述层析柱的载量可为本领域该类填料常规的载量，即单次洗脱中，单位体积填料可分离的样品的量；本发明中较佳地为1mg/ml～5mg/ml(2.03g/l、2.13g/l、2.31g/l、2.54g/l、2.74g/l、2.76g/l、2.78g/l、2.81g/l、3.08g/l、3.12g/l、3.15g/l、3.24g/l、3.27g/l、3.32g/l、3.39g/l、3.48g/l、3.59g/l)。
[0026]
所述的收集洗脱液的操作可为本领域常规的操作，例如hplc跟踪监测，收集含所
述的争光霉素族化合物的铜螯合物的洗脱液；本发明中较佳地为收集hplc纯度高于95％以上含所述的争光霉素族化合物的铜螯合物的洗脱液；更佳地，当洗脱液中所含所述的争光霉素族化合物的铜螯合物的浓度低于50μg/ml时停止收集。
[0027]
所述的纯化方法还可包括如下后处理步骤，将得到的含争光霉素族化合物的铜螯合物纯品的水溶液，经浓缩，冻干，得到争光霉素族化合物的铜螯合物即可；所述的浓缩可为所述的争光霉素族化合物的铜螯合物在所述的水溶液中的质量体积含量为30g/l～50g/l。
[0028]
所述的纯化方法还可包括如下步骤，将含争光霉素族化合物的铜螯合物的发酵富集浓缩液进行层析，层析柱填料为单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯层析介质，所述的单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯层析介质的粒径为100μm～200μm，层析的洗脱剂为水；收集洗脱液，得到所述的含争光霉素族化合物的铜螯合物粗品的水溶液即可；所述的含争光霉素族化合物的铜螯合物粗品的发酵富集浓缩液中，争光霉素族化合物的铜螯合物的纯度为大于5％。
[0029]
所述的含争光霉素族化合物的铜螯合物的发酵富集浓缩液的ph值可为本领域常规的ph值，例如2.5～5.5；本发明中较佳地为4.1～4.5(例如4.2、4.3、4.4或4.5)。所述的ph值可采用本领域常规的酸或碱进行调节得到，所述的酸可为盐酸、乙酸、甲酸和磷酸中的一种或多种(例如盐酸)，所述的碱可为碱金属氢氧化物(例如氢氧化钠和/或氢氧化钾)、碱金属碳酸盐(例如碳酸钠和/或碳酸钾)和碱金属碳酸氢盐(例如碳酸氢钠和/或碳酸氢钾)中的一种或多种(又例如氢氧化钠)。
[0030]
所述的发酵富集浓缩液的层析中，所述的洗脱剂可为本领域该类洗脱剂中常规的去离子水。
[0031]
所述的发酵富集浓缩液的层析中，所述的单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯层析介质的粒径较佳地为130μm～180μm。
[0032]
所述的发酵富集浓缩液的层析中，所述的单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯层析介质可为色谱3号、nm100、xr3sp或hz20ss，例如为xr3sp。(色谱3号和hz20ss为上海华震科技有限公司提供，xr3sp为上海逊尔化工科技有限公司提供，nm100为苏州纳微科技股份有限公司提供)。
[0033]
所述的发酵富集浓缩液的层析中，所述的层析柱可采用本领域常规的方法进行预处理，例如预先用洗脱剂平衡，本发明中较佳地预先用去离子水5bv平衡。
[0034]
所述的发酵富集浓缩液的层析中，所述的层析柱的高径比可为本领域常规的高径比，例如5:1～15:1；本发明中较佳地为5:1～10:1(例如6:1、7:1、8:1或9:1)。
[0035]
所述的发酵富集浓缩液的层析中，所述的洗脱剂的流速可为本领域常规的流速，本发明中较佳地为0.05bv/h～0.15bv/h(例如0.1bv/h)。
[0036]
所述的争光霉素族化合物的铜螯合物在所述的发酵富集浓缩液中的质量体积含量可为本领域常规的质量体积含量，例如25g/l～35g/l(又例如28g/l、30g/l、30.12g/l、31.8g/l、31.9g/l、32.4g/l、34.6g/l)。
[0037]
所述的发酵富集浓缩液的层析中，所述层析柱的载量可为本领域该类填料常规的载量(即单次洗脱中，单位体积填料可分离的样品的量；本发明中可为1g/l～7g/l(例如1.96g/l、2.08g/l、2.15g/l、2.66g/l、3.64g/l、3.98g/l、4.79g/l、4.87g/l、4.89g/l、4.98g/l、5.13g/l)。
[0038]
所述的发酵富集浓缩液的层析中，所述的收集洗脱液的操作可为本领域常规的操作，例如hplc跟踪监测，收集含所述的争光霉素族化合物的铜螯合物的洗脱液；本发明中较佳地为收集hplc纯度高于50％以上含所述的争光霉素族化合物的铜螯合物的洗脱液；更佳地，当所述的争光霉素族化合物的铜螯合物为多种时，分别收集(例如所述的争光霉素族化合物的铜螯合物为平阳霉素的铜螯合物和博安霉素的铜螯合物的混合物时，分别收集平阳霉素的铜螯合物和博安霉素的铜螯合物)。
[0039]
所述的含争光霉素族化合物的铜螯合物的纯化方法还可进一步包括如下发酵液富集步骤，
[0040]
步骤(1)、将含争光霉素族化合物的铜螯合物的发酵液进行酸调ph值、碱调ph值、过滤，得到含争光霉素族化合物的铜螯合物的发酵液的过滤液；
[0041]
步骤(2)、将步骤(1)含争光霉素族化合物的铜螯合物的发酵液的过滤液经大孔弱酸树脂柱富集层析，洗脱剂为稀盐酸，收集得到的洗脱液碱调ph值，浓缩，过滤，得到所述的含争光霉素族化合物的铜螯合物的发酵富集浓缩液。
[0042]
步骤(1)中，所述的含争光霉素族化合物的铜螯合物的发酵液可为采用本领域常规的发酵方法，由轮枝链霉菌平阳变种或其新变种(例如streptomyces verticillius var.pingyangensis cpcc 200554、streptomyces verticillius var.pingyangensis cpcc 200552)菌种直接发酵获得，或者发酵后得到的含争光霉素族化合物的发酵液加铜盐形成。
[0043]
或者，本发明中，所述的发酵液较佳地采用如下发酵工艺制备得到，本领域技术人员可以理解，具体发酵规模可根据需要进行调整：
[0044]
1培养基
[0045]
斜面培养基(g/l)：可溶性淀粉20.0，kno
3 10.0，k
2
hpo
4 5.0，mgso
4
·
7h
2
o 5.0，nacl 5.0，feso
4
·
7h
2
o 0.1，玉米浆5.0，琼脂20.0，ph7.4-7.6。
[0046]
种子发酵培养基(g/l)：玉米浆30.0，黄豆饼粉20.0，榴花酵母粉2.0，葡萄糖10.0，麦芽糊精10.0，kh
2
po
4 1.0，znso
4
.7h
2
o 0.5，cuso
4
.5h
2
o 0.1，ph 6.5。
[0047]
基础发酵培养基(g/l)：玉米浆7.5，冷榨黄豆饼粉35.0，榴花酵母2.0，葡萄糖5.0，淀粉(α-淀粉酶液化)60，nano
3 2.0；kh
2
po
4 1.0,znso
4
.7h
2
o0.5，cuso
4
.5h
2
o 0.1，ph 6.5。
[0048]
发酵罐补料(g/l)：玉米浆70.0，冷榨豆粉49.0，榴花酵母粉21.0，kh
2
po
4 1.0,znso
4
.7h
2
o 0.5，cuso
4
.5h
2
o 0.1，nano
3 2.0，ph自然，每次补料量1.6％，补料时间间隔为12h。
[0049]
2菌株培养培养条件
[0050]
斜面培养：将冷冻干燥管或甘油管中的孢子接种到斜面培养基上(茄子瓶，60ml/300ml)，放28.5-29℃恒温培养箱培养6-7天，当菌落凸起、表面呈丝绒状、孢子呈白色且丰富时终止培养。
[0051]
种子培养：用接种铲移取一定量的生长成熟的斜面到装有80ml/500ml种子培养基的三角摇瓶中，用8层纱布包扎好后放在摇床上，220rmp、28.5-29℃条件下培养24h。
[0052]
摇瓶发酵培养：5％接种量将生长好的种子液移种到装有35ml/250ml发酵培养基的三角摇瓶中培养，220rmp、28.5-29℃条件下培养168h。
[0053]
25l种子发酵罐发酵条件：装液量为16l，将培养好的种子摇瓶培养基80ml接种至
灭好菌的种子培养基当中，温度为28.5℃，通气比为1.0vvm，转速为0-14h为250r/min，14-18h为300r/min，18-24h为350r/min，24h之后为375r/min；发酵周期为24-28h。
[0054]
25l发酵罐发酵条件：装液量为16l，接种量为40％，温度为28.5℃，通气比为1.0vvm，转速0-4h为250r/min，4-6h为300r/min，6-8h为350r/min，8h之后为375r/min，发酵周期为168-192h。
[0055]
步骤(1)中，所述的酸可为本领域该类发酵液富集步骤中常规的酸，例如草酸。
[0056]
步骤(1)中，所述的酸调ph值可为本领域该类发酵液富集步骤中常规的ph值，例如2.0-3.0(例如2.1、2.3、2.5、2.6、2.7、2.8或2.9)。
[0057]
步骤(1)中，所述的碱可为本领域该类发酵液富集步骤中常规的碱，例如氢氧化钠，较佳地为6m naoh水溶液。
[0058]
步骤(1)中，所述的碱调ph值可为本领域该类发酵液富集步骤中常规的ph值，例如4.5-5.5(又例如4.6、4.7、4.8、4.9或5.0)。
[0059]
步骤(1)中，所述的过滤可为本领域该类发酵液富集步骤中常规的操作，例如10nm～200nm无机陶瓷膜过滤。
[0060]
步骤(2)中，所述的大孔弱酸树脂可为本领域该类发酵液富集步骤中常规的大孔弱酸树脂，例如：d157、d152、d155、xr140、xr157、zgd113或zgd115，较佳地为xr157、d157、zgd115或d155。(d157、d152、d155为上海华震科技有限公司提供，xr140、xr157为上海逊尔化工科技有限公司提供，zgd113、zgd115为杭州争光树脂有限公司提供)
[0061]
步骤(2)中，所述的洗脱剂稀盐酸的摩尔浓度可为本领域该类发酵液富集步骤中常规的摩尔体积浓度，例如0.1mol/l～0.5mol/l，较佳地为0.3mol/l。
[0062]
步骤(2)中，所述的调ph值可采用本领域该类发酵液富集步骤中常规的碱调节得到，例如氢氧化钠(例如6m naoh水溶液)。
[0063]
步骤(2)中，所述的层析柱预先用去离子水平衡，例如5bv去离子水平衡。
[0064]
本发明提供了一种争光霉素族化合物的铜螯合物的纯化方法，其包括如下步骤，将含争光霉素族化合物的铜螯合物的发酵富集浓缩液进行层析，层析柱填料为单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯层析介质，所述的单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯层析介质的粒径为100μm～200μm，层析的洗脱剂为水；收集洗脱液，得到所述的含争光霉素族化合物的铜螯合物粗品的水溶液即可；所述的含争光霉素族化合物的铜螯合物粗品的发酵富集浓缩液中，争光霉素族化合物的铜螯合物的纯度为大于5％。
[0065]
所述的含争光霉素族化合物的铜螯合物的发酵富集浓缩液的ph值可为本领域常规的ph值，例如2.5～5.5；本发明中较佳地为4.1～4.5(例如4.2、4.3、4.4或4.5)。所述的ph值可采用本领域常规的酸或碱进行调节得到，所述的酸可为盐酸、乙酸、甲酸和磷酸中的一种或多种(例如盐酸)，所述的碱可为碱金属氢氧化物(例如氢氧化钠和/或氢氧化钾)、碱金属碳酸盐(例如碳酸钠和/或碳酸钾)和碱金属碳酸氢盐(例如碳酸氢钠和/或碳酸氢钾)中的一种或多种(又例如氢氧化钠)。
[0066]
所述的发酵富集浓缩液的层析中，所述的洗脱剂可为本领域该类洗脱剂中常规的去离子水。
[0067]
所述的发酵富集浓缩液的层析中，所述的单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯层析介质的粒径较佳地为130μm～180μm。
[0068]
所述的发酵富集浓缩液的层析中，所述的单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯层析介质可为色谱3号、nm100、xr3sp或hz20ss，例如为xr3sp。(色谱3号和hz20ss为上海华震科技有限公司提供，xr3sp为上海逊尔化工科技有限公司提供，nm100为苏州纳微科技股份有限公司提供)。
[0069]
所述的发酵富集浓缩液的层析中，所述的层析柱可采用本领域常规的方法进行预处理，例如预先用洗脱剂平衡，本发明中较佳地预先用去离子水5bv平衡。
[0070]
所述的发酵富集浓缩液的层析中，所述的层析柱的高径比可为本领域常规的高径比，例如5:1～15:1；本发明中较佳地为5:1～10:1(例如6:1、7:1、8:1或9:1)。
[0071]
所述的发酵富集浓缩液的层析中，所述的洗脱剂的流速可为本领域常规的流速，本发明中较佳地为0.05bv/h～0.15bv/h(例如0.1bv/h)。
[0072]
所述的争光霉素族化合物的铜螯合物在所述的发酵富集浓缩液中的质量体积含量可为本领域常规的质量体积含量，例如25g/l～35g/l(又例如28g/l、30g/l、30.12g/l、31.8g/l、31.9g/l、32.4g/l、34.6g/l)。
[0073]
所述的发酵富集浓缩液的层析中，所述层析柱的载量可为本领域该类填料常规的载量(即单次洗脱中，单位体积填料可分离的样品的量；本发明中可为1g/l～7g/l(例如1.96g/l、2.08g/l、2.15g/l、2.66g/l、3.64g/l、3.98g/l、4.79g/l、4.87g/l、4.89g/l、4.98g/l、5.13g/l)。
[0074]
所述的发酵富集浓缩液的层析中，所述的收集洗脱液的操作可为本领域常规的操作，例如hplc跟踪监测，收集含所述的争光霉素族化合物的铜螯合物的洗脱液；本发明中较佳地为收集hplc纯度高于50％以上含所述的争光霉素族化合物的铜螯合物的洗脱液；更佳地，当所述的争光霉素族化合物的铜螯合物为多种时，分别收集(例如所述的争光霉素族化合物的铜螯合物为平阳霉素的铜螯合物和博安霉素的铜螯合物的混合物时，分别收集平阳霉素的铜螯合物和博安霉素的铜螯合物)。
[0075]
所述的含争光霉素族化合物的铜螯合物的纯化方法还可进一步包括如下发酵液富集步骤，
[0076]
步骤(1)、将含争光霉素族化合物的铜螯合物的发酵液进行酸调ph值、碱调ph值、过滤，得到含争光霉素族化合物的铜螯合物的发酵液的过滤液；
[0077]
步骤(2)、将步骤(1)含争光霉素族化合物的铜螯合物的发酵液的过滤液经大孔弱酸树脂柱富集层析，洗脱剂为稀盐酸，收集得到的洗脱液碱调ph值，浓缩，过滤，得到所述的含争光霉素族化合物的铜螯合物的发酵富集浓缩液。
[0078]
步骤(1)中，所述的含争光霉素族化合物的铜螯合物的发酵液可为采用本领域常规的发酵方法，由轮枝链霉菌平阳变种或其新变种(例如streptomyces verticillius var.pingyangensis cpcc 200554、streptomyces verticillius var.pingyangensis cpcc 200552)菌种直接发酵获得，或者发酵后得到的含争光霉素族化合物的发酵液加铜盐形成。
[0079]
或者，本发明中，所述的发酵液较佳地采用如下发酵工艺制备得到，本领域技术人员可以理解，具体发酵规模可根据需要进行调整：
[0080]
1培养基
[0081]
斜面培养基(g/l)：可溶性淀粉20.0，kno
3 10.0，k
2
hpo
4 5.0，mgso
4
·
7h
2
o 5.0，
nacl 5.0，feso
4
·
7h
2
o 0.1，玉米浆5.0，琼脂20.0，ph7.4-7.6。
[0082]
种子发酵培养基(g/l)：玉米浆30.0，黄豆饼粉20.0，榴花酵母粉2.0，葡萄糖10.0，麦芽糊精10.0，kh
2
po
4 1.0，znso
4
.7h
2
o 0.5，cuso
4
.5h
2
o 0.1，ph 6.5。
[0083]
基础发酵培养基(g/l)：玉米浆7.5，冷榨黄豆饼粉35.0，榴花酵母2.0，葡萄糖5.0，淀粉(α-淀粉酶液化)60，nano
3 2.0；kh
2
po
4 1.0,znso
4
.7h
2
o0.5，cuso
4
.5h
2
o 0.1，ph 6.5。
[0084]
发酵罐补料(g/l)：玉米浆70.0，冷榨豆粉49.0，榴花酵母粉21.0，kh
2
po
4 1.0,znso
4
.7h
2
o 0.5，cuso
4
.5h
2
o 0.1，nano
3 2.0，ph自然，每次补料量1.6％，补料时间间隔为12h。
[0085]
2菌株培养培养条件
[0086]
斜面培养：将冷冻干燥管或甘油管中的孢子接种到斜面培养基上(茄子瓶，60ml/300ml)，放28.5-29℃恒温培养箱培养6-7天，当菌落凸起、表面呈丝绒状、孢子呈白色且丰富时终止培养。
[0087]
种子培养：用接种铲移取一定量的生长成熟的斜面到装有80ml/500ml种子培养基的三角摇瓶中，用8层纱布包扎好后放在摇床上，220rmp、28.5-29℃条件下培养24h。
[0088]
摇瓶发酵培养：5％接种量将生长好的种子液移种到装有35ml/250ml发酵培养基的三角摇瓶中培养，220rmp、28.5-29℃条件下培养168h。
[0089]
25l种子发酵罐发酵条件：装液量为16l，将培养好的种子摇瓶培养基80ml接种至灭好菌的种子培养基当中，温度为28.5℃，通气比为1.0vvm，转速为0-14h为250r/min，14-18h为300r/min，18-24h为350r/min，24h之后为375r/min；发酵周期为24-28h。
[0090]
25l发酵罐发酵条件：装液量为16l，接种量为40％，温度为28.5℃，通气比为1.0vvm，转速0-4h为250r/min，4-6h为300r/min，6-8h为350r/min，8h之后为375r/min，发酵周期为168-192h。
[0091]
步骤(1)中，所述的酸可为本领域该类发酵液富集步骤中常规的酸，例如草酸。
[0092]
步骤(1)中，所述的酸调ph值可为本领域该类发酵液富集步骤中常规的ph值，例如2.0-3.0(例如2.1、2.3、2.5、2.6、2.7、2.8或2.9)。
[0093]
步骤(1)中，所述的碱可为本领域该类发酵液富集步骤中常规的碱，例如氢氧化钠，较佳地为6m naoh水溶液。
[0094]
步骤(1)中，所述的碱调ph值可为本领域该类发酵液富集步骤中常规的ph值，例如4.5-5.5(又例如4.6、4.7、4.8、4.9或5.0)。
[0095]
步骤(1)中，所述的过滤可为本领域该类发酵液富集步骤中常规的操作，例如10nm～200nm无机陶瓷膜过滤。
[0096]
步骤(2)中，所述的大孔弱酸树脂可为本领域该类发酵液富集步骤中常规的大孔弱酸树脂，例如：d157、d152、d155、xr140、xr157、zgd113或zgd115，较佳地为xr157、d157、zgd115或d155。(d157、d152、d155为上海华震科技有限公司提供，xr140、xr157为上海逊尔化工科技有限公司提供，zgd113、zgd115为杭州争光树脂有限公司提供)
[0097]
步骤(2)中，所述的洗脱剂稀盐酸的摩尔浓度可为本领域该类发酵液富集步骤中常规的摩尔体积浓度，例如0.1mol/l～0.5mol/l，较佳地为0.3mol/l。
[0098]
步骤(2)中，所述的调ph值可采用本领域该类发酵液富集步骤中常规的碱调节得到，例如氢氧化钠(例如6m naoh水溶液)。
[0099]
步骤(2)中，所述的层析柱预先用去离子水平衡，例如5bv去离子水平衡。
[0100]
本发明还提供了一种争光霉素族化合物的铜螯合物的原料药，其采用如上所述的争光霉素族化合物的铜螯合物的纯化方法制备得到。
[0101]
本发明中，bv是指层析柱内装载填料的体积，称为床容积(bed volume)。
[0102]
本发明中，bv/h是指每小时通过溶液的体积为填料床容积，即流量速度。例如溶液通过层析柱的流量速度为2bv/h～4bv/h，即每小时通过溶液的体积为填料床容积的2～4倍。
[0103]
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0104]
本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0105]
本发明的积极进步效果在于：本发明的纯化工艺(1)直接从传统工艺做出的争光霉素族化合物的铜螯合物粗品的富集浓缩液(纯度可低于15％)出发，经过100μm～200μm单分散聚苯乙烯/二乙烯基苯(ps-dvb)层析介质层析初步分离，只需分离一次即可得到纯度大于50％，收率大于80％的争光霉素族化合物的铜螯合物。
[0106]
(2)从纯度大于50％的争光霉素族化合物的铜螯合物出发，经过10μm～60μm单分散ps-dvb微球层析柱纯水相层析分离，只需分离一次即可，得到纯度大于98％，收率大于80％的争光霉素族化合物的铜螯合物。
[0107]
(3)通过两步连用，每步只需分离一次即可，不需要循环套用即可达到总收率50％以上，hplc面积归一法纯度98％以上的效果。本发明的纯化工艺，不使用有机溶剂，易于工业放大生产，具有较高的工业应用价值。
具体实施方式
[0108]
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0109]
实施例中，平阳霉素的铜鳌合物和博安霉素的铜鳌合物均简称平阳霉素和博安霉素。
[0110]
仪器与试剂见下表：
[0111]
表1.仪器
[0112][0113]
表2.试剂
[0114]
试剂规格生产厂家naoh分析纯国药试剂nh4cl分析纯国药试剂hcl分析纯国药试剂去离子水 自制甲醇分析纯国药试剂草酸分析纯国药试剂乙醇分析纯国药试剂
[0115]
下述实施例中检测方法如下：
[0116]
色谱柱agilent eclipse plus-18(5μm,4.6*250mm)；以己烷磺酸钠溶液(取己烷磺酸钠7.53g与乙二胺四醋酸二钠3.72g，加0.08mol/l醋酸溶液使溶解并稀释至1000ml)，用氨溶液调节ph至4.3)为流动相a；以甲醇-乙腈(7:3)为流动相b，检测波长为254nm。按照表一进行线性梯度洗脱。样品采用50％甲醇水溶液稀释，12000r/min高速离心后取上清进样。
[0117]
表3 hplc检测时间梯度表
[0118]
时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)07030156832355545367030407030
[0119]
采用峰面积归一法评价其hplc纯度；采用外标法获得溶液中争光霉素族单组分化合物的含量。通过与参比化合物的保留时间和紫外光谱比较，确定了分析物的色谱峰。采用
基于标准曲线的峰面积法对pym和bam进行定量分析。用5个实验数据点建立了标准曲线。平阳霉素和博安霉素回归方程分别是y＝8.284x-21.3(r
2
＝0.9991)和y＝10.17x-3.4(r
2
＝0.9993)。y和x分别是分析物的峰面积(mau)和浓度(μg/ml)。
[0120]
平阳霉素标品：盐酸平阳霉素，中检所标准品，规格：8mg，产品批号：130424-201104。
[0121]
博安霉素对照品：注射用盐酸博安霉素(制剂)，吉林敖东药业集团延吉股份有限公司，规格：8.0mg,批号：20180301。
[0122]
下述实施例中，发酵液采用如下发酵工艺制备得到(本领域技术人员可以理解，具体发酵规模可根据需要进行调整，具体菌种见实施例)：
[0123]
1培养基
[0124]
斜面培养基(g/l)：可溶性淀粉20.0，kno
3 10.0，k
2
hpo
4 5.0，mgso
4
·
7h
2
o 5.0，nacl 5.0，feso
4
·
7h
2
o 0.1，玉米浆5.0，琼脂20.0，ph7.4-7.6。
[0125]
种子发酵培养基(g/l)：玉米浆30.0，黄豆饼粉20.0，榴花酵母粉2.0，葡萄糖10.0，麦芽糊精10.0，kh
2
po
4 1.0，znso
4
.7h
2
o 0.5，cuso
4
.5h
2
o 0.1，ph 6.5。
[0126]
基础发酵培养基(g/l)：玉米浆7.5，冷榨黄豆饼粉35.0，榴花酵母2.0，葡萄糖5.0，淀粉(α-淀粉酶液化)60，nano
3 2.0；kh
2
po
4 1.0,znso
4
.7h
2
o0.5，cuso
4
.5h
2
o 0.1，ph 6.5。
[0127]
发酵罐补料(g/l)：玉米浆70.0，冷榨豆粉49.0，榴花酵母粉21.0，kh
2
po
4 1.0,znso
4
.7h
2
o 0.5，cuso
4
.5h
2
o 0.1，nano
3 2.0，ph自然，每次补料量1.6％，补料时间间隔为12h。
[0128]
2菌株培养培养条件
[0129]
斜面培养：将冷冻干燥管或甘油管中的孢子接种到斜面培养基上(茄子瓶，60ml/300ml)，放28.5-29℃恒温培养箱培养6-7天，当菌落凸起、表面呈丝绒状、孢子呈白色且丰富时终止培养。
[0130]
种子培养：用接种铲移取一定量的生长成熟的斜面到装有80ml/500ml种子培养基的三角摇瓶中，用8层纱布包扎好后放在摇床上，220rmp、28.5-29℃条件下培养24h。
[0131]
摇瓶发酵培养：5％接种量将生长好的种子液移种到装有35ml/250ml发酵培养基的三角摇瓶中培养，220rmp、28.5-29℃条件下培养168h。
[0132]
25l种子发酵罐发酵条件：装液量为16l，将培养好的种子摇瓶培养基80ml接种至灭好菌的种子培养基当中，温度为28.5℃，通气比为1.0vvm，转速为0-14h为250r/min，14-18h为300r/min，18-24h为350r/min，24h之后为375r/min；发酵周期为24-28h。
[0133]
25l发酵罐发酵条件：装液量为16l，接种量为40％，温度为28.5℃，通气比为1.0vvm，转速0-4h为250r/min，4-6h为300r/min，6-8h为350r/min，8h之后为375r/min，发酵周期为168-192h。
[0134]
实施例1
[0135]
主产平阳霉素单组分发酵液，采用好氧发酵方法获得，放罐体积60l，菌种为streptomyces verticillius var.pingyangensis cpcc 200554，单位15μg/ml(总含量约900mg，采用草酸调ph值2.3，搅拌30min后，采用6m naoh调ph值4.9，然后陶瓷膜过滤得滤液68l(中间加纯化水稀释)，滤液总含量853mg。过滤液上1l zgd115树脂，高径比4:1，流速2bv/h，物料上完后0.3m盐酸溶液0.2bv/h流速洗脱，洗脱液用6m naoh调ph值4.4，然后旋蒸
浓缩至28g/l，过滤得过滤液23ml，含量645mg。收率71.7％，hplc纯度为8.95％。
[0136]
然后上色谱3号300ml填料床层析分离，高径比8:1，流速0.1bv/h，去离子水洗脱层析分离，hplc跟踪监测，收集hplc纯度高于50％以上洗脱液。然后浓缩收集洗脱液至31g/l浓缩液18ml，含量556mg。单步收率86.2％，hplc纯度为63.14％。
[0137]
接着添加0.18g氯化铵，ph采用6m hcl调至4.25，上200ml高径比10:1的poly
rp-30层析柱，流速0.1bv/h。接着采用1％氯化铵水溶液0.5bv/h洗脱，用量5bv，然后采用去离子水同流速洗脱，待平阳霉素hplc面积归一法纯度大于95％，开始收集，待单位低于50μg/ml停止收集。洗脱液浓缩至31g/l浓度，冻干得高纯度平阳霉素铜鳌合物干粉511mg，单步收率91.9％，总收率56.7％，hplc纯度99.16％。
[0138]
实施例2
[0139]
菌种为streptomyces verticillius var.pingyangensis cpcc 200554，主产平阳霉素单组分，采用好氧发酵方法获得，发酵液放罐体积58l，单位17μg/ml，总含量约986mg，采用草酸调ph值2.7，搅拌30min后，采用6m naoh调ph值4.7，然后陶瓷膜过滤得滤液72l(中间加纯化水稀释)，滤液总含量937mg。过滤液上1l xr157树脂，高径比4:1，流速2bv/h，物料上完后0.4m盐酸溶液0.2bv/h流速洗脱，洗脱液用6m naoh调ph值4.4，然后旋蒸浓缩至30g/l，过滤得过滤液26ml，含量798mg。单步收率80.9％，hplc纯度7.69％。
[0140]
然后上xr3sp 300ml填料床层析分离，高径比10:1，流速0.1bv/h，去离子水洗脱层析分离，hplc跟踪监测，收集hplc纯度高于50％以上洗脱液。然后浓缩收集洗脱液至31g/l浓缩液22ml，含量678mg。单步收率85％，hplc纯度64.82％。
[0141]
接着添加0.22g乙酸铵，ph采用6m hcl调调至4.33，上200ml高径比12:1的lxms-35层析柱，流速0.1bv/h。接着采用1％乙酸铵水溶液0.5bv/h洗脱，用量5bv，然后采用去离子水同流速洗脱，待平阳霉素hplc面积归一法纯度大于95％，开始收集，待单位低于50μg/ml停止收集。洗脱液浓缩至42g/l浓度，冻干得高纯度平阳霉素铜鳌合物干粉613mg，单步收率90.4％，总收率62.1％，hplc纯度98.63％。
[0142]
实施例3
[0143]
菌种为streptomyces verticillius var.pingyangensis cpcc 200554，主产平阳霉素单组分，采用好氧发酵方法获得平阳霉素发酵液放罐体积63l，单位13μg/ml，总含量约819mg，采用草酸调ph值2.1，搅拌30min后，采用6m naoh调ph值4.8，然后陶瓷膜过滤得滤液79l(中间加纯化水稀释)，滤液总含量769mg。过滤液上1l d155树脂，高径比6:1，流速2bv/h，物料上完后0.2m盐酸溶液0.2bv/h流速洗脱，洗脱液用6m naoh调ph值4.3，然后旋蒸浓缩至23g/l，过滤得过滤液25ml，含量589mg。收率71.9％，hplc纯度9.16％。
[0144]
然后上xr3sp 300ml填料床层析分离，高径比9:1，流速0.1bv/h，去离子水洗脱层析分离，hplc跟踪监测，收集hplc纯度高于50％以上洗脱液。然后浓缩收集洗脱液至26g/l浓缩液19.5ml，含量507mg。单步收率86％，hplc纯度59.14％。
[0145]
接着添加0.20g甲酸铵，ph采用6m hcl调至4.4，上200ml高径比14:1的lxms-60层析柱，流速0.1bv/h。接着采用1％甲酸铵水溶液0.5bv/h洗脱，用量5bv，然后采用去离子水同流速洗脱，待平阳霉素hplc面积归一法纯度大于95％，开始收集，待单位低于50μg/ml停止收集。洗脱液浓缩至34g/l浓度，冻干得高纯度平阳霉素铜鳌合物干粉439mg，单步收率86.6％，总收率53.6％，hplc纯度99.21％。
[0146]
实施例4
[0147]
菌种为streptomyces verticillius var.pingyangensis cpcc 200554，主产平阳霉素单组分，采用好氧发酵方法获得平阳霉素发酵液放罐体积62l，单位14μg/ml，总含量约868mg，采用草酸调ph值2.1，搅拌30min后，采用6m naoh调ph值4.6，然后陶瓷膜过滤得滤液83l(中间加纯化水稀释)，滤液总含量813mg。过滤液上1l d157树脂，高径比5:1，流速2bv/h，物料上完后0.2m盐酸溶液0.2bv/h流速洗脱，洗脱液用6m naoh调ph值4.3，然后旋蒸浓缩至26g/l，过滤得过滤液23ml，含量624mg。收率71.9％，hplc纯度8.67％。
[0148]
然后上hz20ss 300ml填料床层析分离，高径比5:1，流速0.1bv/h，去离子水洗脱层析分离，hplc跟踪监测，收集hplc纯度高于50％以上洗脱液。然后浓缩收集洗脱液至23g/l浓缩液18ml，含量461mg。单步收率73.9％，hplc纯度68.97％。
[0149]
接着添加0.18g磷酸二氢铵，ph采用6m hcl调至4.2，上200ml高径比12:1的poly
rp
40层析柱，流速0.1bv/h。接着采用1％磷酸二氢铵水溶液0.5bv/h洗脱，用量5bv，然后采用去离子水同流速洗脱，待平阳霉素hplc面积归一法纯度大于95％，开始收集，待单位低于50μg/ml停止收集。洗脱液浓缩至43g/l浓度，冻干得高纯度平阳霉素铜鳌合物干粉428mg，单步收率93％，总收率59.3％，hplc纯度98.62％。
[0150]
实施例5
[0151]
菌种为streptomyces verticillius var.pingyangensis cpcc 200554，主产平阳霉素单组分，采用好氧发酵方法获得平阳霉素发酵液放罐体积59l，单位15μg/ml，总含量约885mg，采用草酸调ph值2.1，搅拌30min后，采用6m naoh调ph值4.6，然后陶瓷膜过滤得滤液79l(中间加纯化水稀释)，滤液总含量824mg。过滤液上1l xr140树脂，高径比5:1，流速2bv/h，物料上完后0.2m盐酸溶液0.2bv/h流速洗脱，洗脱液用6m naoh调ph值4.3，然后旋蒸浓缩至26g/l，过滤得过滤液28ml，含量728mg。收率82.25％，hplc纯度9.14％。
[0152]
按照实施例4第二步处理方法，填料替换为nm100，得到24g/l浓缩液21ml，含量624mg。单步收率85.7％，hplc纯度55.24％。
[0153]
按照实施例4第三步处理方法，填料替换为poly
rp
60，得高纯度平阳霉素铜鳌合物干粉543mg，单步收率86.9％，总收率61.35％，纯度98.47％。
[0154]
实施例6
[0155]
发酵液放罐体积15.2l，streptomyces verticillius var.pingyangensis cpcc200552菌种，经有氧发酵得到发酵液，平阳霉素和博安霉素单位分别为158.61μg/ml和42.17μg/ml，总含量2379.15mg平阳霉素和632.55mg博安霉素，采用草酸调ph值2.3，搅拌30min后，然后200nm陶瓷膜过滤得滤液20l(中间加纯化水稀释)，采用6m naoh调ph值4.9，滤液中总含平阳霉素2275.39mg和博安霉素600.93mg。过滤液上300ml zgd115树脂，高径比4:1，流速2bv/h，物料上完后0.3m盐酸溶液0.2bv/h流速洗脱，洗脱液用6m naoh调ph值4.4，然后旋蒸浓缩至28g/l，过滤得过滤液87ml，含量1934.08mg平阳霉素和510.79mg博安霉素。hplc纯度分别为9.15％和8.16％，收率81.29％和80.75％。
[0156]
然后上色谱3号500ml填料床层析分离，高径比8:1，流速0.1bv/h，去离子水洗脱层析分离，hplc跟踪监测，分别收集平阳霉素和博安霉素hplc纯度均高于50％以上洗脱液，分别得到含1740.15mg平阳霉素和462.18mg博安霉素的洗脱液，然后分别浓缩洗脱液至40ml和15ml。hplc纯度分别为60.58％和58.96％，单步收率分别为89.97％和90.48％。
[0157]
接着分别添加0.40g和0.15g氯化铵，ph采用6m hcl调至4.25，分别上500ml和150ml高径比10:1的poly
rp-30层析柱，填料微球孔径为流速0.1bv/h。接着采用1％氯化铵水溶液0.5bv/h洗脱，用量5bv，然后采用去离子水同流速洗脱，待平阳霉素或博安霉素hplc面积归一法纯度大于95％，开始收集，待单位低于50μg/ml停止收集。洗脱液浓缩至20ml和5ml，冻干得分别得到高纯度平阳霉素和博安霉素铜鳌合物干粉1548.74mg和405.72mg，此单步收率分别为89.03％和87.78％，总收率分别为65.09％和64.14％。hplc纯度分别为98.14％和99.08％。
[0158]
实施例7
[0159]
发酵液放罐体积15.5l，streptomyces verticillius var.pingyangensis cpcc200552菌种，经有氧发酵得到发酵液，平阳霉素和博安霉素单位分别为147.54μg/ml和38.17μg/ml，总含量2286.87mg平阳霉素和591.64mg博安霉素，采用草酸调ph值2.8，搅拌30min后，然后200nm陶瓷膜过滤得滤液20l(过滤后期加纯化水稀释)，采用6m naoh调ph值4.8，滤液中总含平阳霉素2218.26mg和博安霉素567.96mg。过滤液上300ml xr157树脂，高径比4:1，流速2bv/h，物料上完后0.4m盐酸溶液0.2bv/h流速洗脱，洗脱液用6m naoh调ph值4.3，然后旋蒸浓缩至30.12g/l，中性滤纸过滤得过滤液80ml，含量1913.15mg平阳霉素和481.64mg博安霉素。hplc纯度分别为8.78％和7.55％，收率分别为83.65％和81.41％。
[0160]
然后上xr3sp 500ml填料床层析分离，高径比8:1，流速0.1bv/h，去离子水洗脱层析分离，hplc跟踪监测，分别收集平阳霉素和博安霉素hplc纯度均高于50％以上洗脱液，分别得到含1635.74mg平阳霉素和414.69mg博安霉素的洗脱液，然后分别浓缩洗脱液至30ml和18ml。hplc纯度分别为58.26％和61.38％，单步收率分别为85.49％和86.10％。
[0161]
接着分别添加0.30g和0.18g氯化铵，ph采用6m hcl调至4.4，分别上500ml和150ml高径比10:1的unips
tm-50层析柱，填料微球孔径为流速0.1bv/h。接着采用1％氯化铵水溶液0.5bv/h洗脱，用量5bv，然后采用去离子水同流速洗脱，待平阳霉素或博安霉素hplc面积归一法纯度大于95％，开始收集，待单位低于50μg/ml停止收集。洗脱液浓缩至约18ml和4ml，冻干得分别得到高纯度平阳霉素和博安霉素铜鳌合物干粉1509.78mg和374.47mg，单步收率分别为92.29％和90.30％，总收率分别为66.02％和63.29％。hplc纯度分别为98.35％和99.13％。
[0162]
实施例8
[0163]
发酵液放罐体积14.8l，streptomyces verticillius var.pingyangensis cpcc200552菌种，经有氧发酵得到发酵液，平阳霉素和博安霉素单位分别为161.27μg/ml和46.88μg/ml，总含量2386.79mg平阳霉素和693.82mg博安霉素，采用草酸调ph值2.6，搅拌30min后，然后50nm陶瓷膜过滤得滤液20l(过滤后期加纯化水稀释)，采用6m naoh调ph值4.7，滤液中总含平阳霉素2243.58mg和博安霉素652.19mg。过滤液上300ml d155树脂，高径比4:1，流速2bv/h，物料上完后0.5m盐酸溶液0.2bv/h流速洗脱，洗脱液用6m naoh调ph值4.5，然后旋蒸浓缩至32.4g/l，中速滤纸过滤得过滤液77ml，含量1929.48mg平阳霉素和560.88mg博安霉素。hplc纯度分别为9.13％和7.47％，收率分别为80.83％和81.26％。
[0164]
然后上hz20ss 500ml填料床层析分离，高径比8:1，流速0.1bv/h，去离子水洗脱层析分离，hplc跟踪监测，分别收集平阳霉素和博安霉素hplc纯度均高于50％以上洗脱液，分
别得到含1661.28mg平阳霉素和472.91mg博安霉素的洗脱液，然后分别浓缩洗脱液至35ml和14ml。hplc纯度分别为61.85％和59.27％，单步收率分别为86.09％和84.31％。
[0165]
接着分别添加0.35g和0.14g氯化铵，ph采用6m hcl调至4.1，分别上500ml和150ml高径比10:1的lxms-35层析柱，填料微球孔径为35层析柱，填料微球孔径为流速0.1bv/h。接着采用1％氯化铵水溶液0.5bv/h洗脱，用量5bv，然后采用去离子水同流速洗脱，待平阳霉素或博安霉素hplc面积归一法纯度大于95％，开始收集，待单位低于50μg/ml停止收集。洗脱液浓缩至约22ml和6ml，冻干得分别得到高纯度平阳霉素和博安霉素铜鳌合物干粉1533.36mg和435.73mg，单步收率分别为92.18％和92.13％，总收率分别为64.24％和62.80％。hplc纯度分别为98.11％和99.09％。
[0166]
实施例9
[0167]
发酵液放罐体积15.4l，streptomyces verticillius var.pingyangensis cpcc200552菌种，经有氧发酵得到发酵液，平阳霉素和博安霉素单位分别为137.63μg/ml和31.54μg/ml，总含量2119.50mg平阳霉素和485.72mg博安霉素，采用草酸调ph值2.9，搅拌30min后，然后50nm陶瓷膜过滤得滤液20l(过滤后期加纯化水稀释)，采用6m naoh调ph值4.9，滤液中总含平阳霉素1899.07mg和博安霉素435.21mg。过滤液上300ml d157树脂，高径比4:1，流速2bv/h，物料上完后0.5m盐酸溶液0.2bv/h流速洗脱，洗脱液用6m naoh调ph值4.3，然后旋蒸浓缩至31.8g/l，中速滤纸过滤得过滤液约63ml，含量1622.31mg平阳霉素和371.24mg博安霉素。hplc纯度分别为7.44％和6.19％，收率分别为76.54％和76.43％。
[0168]
然后上hz20ss 500ml填料床层析分离，高径比10:1，流速0.1bv/h，去离子水洗脱层析分离，hplc跟踪监测，分别收集平阳霉素和博安霉素hplc纯度均高于50％以上洗脱液，得到含1403.30mg平阳霉素和318.89mg博安霉素的洗脱液，然后分别浓缩洗脱液至29ml和13ml。hplc纯度分别为58.97％和60.24％，单步收率分别为86.50％和85.89％。
[0169]
接着分别添加0.29g和0.13g氯化铵，ph采用6m hcl调至4.4，分别上500ml和150ml高径比10:1的poly
rp-60层析柱，填料微球孔径为60层析柱，填料微球孔径为流速0.1bv/h。接着采用1％氯化铵水溶液0.5bv/h洗脱，用量5bv，然后采用去离子水同流速洗脱，待平阳霉素或博安霉素hplc面积归一法纯度大于95％，开始收集，待单位低于50μg/ml停止收集。洗脱液浓缩至约18ml和5ml，冻干得分别得到高纯度平阳霉素和博安霉素铜鳌合物干粉1281.38mg和292.13mg，单步收率分别为91.31％和91.62％，总收率分别为60.45％和60.13％。hplc纯度分别为98.43％和99.15％。
[0170]
实施例10
[0171]
发酵液放罐体积15.1l，streptomyces verticillius var.pingyangensis cpcc200552菌种，经有氧发酵得到发酵液，平阳霉素和博安霉素单位分别为157.59μg/ml和43.03μg/ml，总含量2379.61mg平阳霉素和649.75mg博安霉素，采用草酸调ph值2.8，搅拌30min后，然后200nm陶瓷膜过滤得滤液20l(过滤后期加纯化水稀释)，采用6m naoh调ph值4.7，滤液中总含平阳霉素2286.81mg和博安霉素625.71mg。过滤液上300ml zgd113树脂，高径比4:1，流速2bv/h，物料上完后0.2m盐酸溶液0.2bv/h流速洗脱，洗脱液用6m naoh调ph值4.4，然后旋蒸浓缩至34.6g/l，中速滤纸过滤得过滤液约74ml，含量2014.69mg平阳霉素和548.12mg博安霉素。hplc纯度分别为9.18％和8.69％，收率分别为84.66％和84.35％。
[0172]
然后上xr3sp 500ml填料床层析分离，高径比10:1，流速0.1bv/h，去离子水洗脱层
析分离，hplc跟踪监测，分别收集平阳霉素和博安霉素hplc纯度均高于50％以上洗脱液，分别得到含1796.51mg平阳霉素和485.63mg博安霉素的洗脱液，然后分别浓缩洗脱液至32ml和17ml。hplc纯度分别为67.58％和68.36％，单步收率分别为89.17％和88.59％。
[0173]
接着分别添加0.32g和0.17g氯化铵，ph采用6m hcl调至4.4，分别上500ml和150ml高径比12:1的unips
tm-30层析柱，填料微球孔径为流速0.1bv/h。接着采用1％氯化铵水溶液0.5bv/h洗脱，用量5bv，然后采用去离子水同流速洗脱，待平阳霉素或博安霉素hplc面积归一法纯度大于95％，开始收集，待单位低于50μg/ml停止收集。洗脱液浓缩至约21ml和7ml，冻干得分别得到高纯度平阳霉素和博安霉素铜鳌合物干粉1652.78mg和441.92mg，单步收率分别为91.99％和90.82％，总收率分别为69.44％和68.01％。hplc纯度分别为98.20％和99.38％。
[0174]
实施例11
[0175]
发酵液放罐体积14.9l，streptomyces verticillius var.pingyangensis cpcc200552菌种，经有氧发酵得到发酵液，平阳霉素和博安霉素单位分别为161.76μg/ml和39.17μg/ml，总含量2410.22mg平阳霉素和589.63mg博安霉素，采用草酸调ph值2.5，搅拌30min后，然后50nm陶瓷膜过滤得滤液20l(过滤后期加纯化水稀释)，采用6m naoh调ph值4.9，滤液中总含平阳霉素2265.61mg和博安霉素557.79mg。过滤液上300ml d157树脂，高径比4:1，流速2bv/h，物料上完后0.2m盐酸溶液0.2bv/h流速洗脱，洗脱液用6m naoh调ph值4.2，然后旋蒸浓缩至31.9g/l，中速滤纸过滤得过滤液约74ml，含量1948.42mg平阳霉素和485.28mg博安霉素。hplc纯度分别为8.23％和7.14％，收率分别为80.83％和82.30％。
[0176]
然后上xr3sp 500ml填料床层析分离，高径比6:1，流速0.1bv/h，去离子水洗脱层析分离，hplc跟踪监测，分别收集平阳霉素和博安霉素hplc纯度均高于50％以上洗脱液，分别得到含1621.08mg平阳霉素和410.54mg博安霉素的洗脱液，然后分别浓缩洗脱液至26ml和12ml。hplc纯度分别为61.88％和59.76％，单步收率分别为83.19％和84.51％。
[0177]
接着分别添加0.26g和0.12g氯化铵，ph采用6m hcl调至4.2，分别上500ml和150ml高径比14:1的lxms-60层析柱，填料微球孔径为60层析柱，填料微球孔径为流速0.1bv/h。接着采用1％氯化铵水溶液0.5bv/h洗脱，用量5bv，然后采用去离子水同流速洗脱，待平阳霉素或博安霉素hplc面积归一法纯度大于95％，开始收集，待单位低于50μg/ml停止收集。洗脱液浓缩至约18ml和5ml，冻干得分别得到高纯度平阳霉素和博安霉素铜鳌合物干粉1496.27mg和376.88mg，单步收率分别为92.31％和91.80％，总收率分别为62.08％和63.92％。hplc纯度分别为98.49％和99.23％。
[0178]
实施例12
[0179]
采用实施例1-11方法任意组合获得纯度为51.32％的平阳霉素粗品，考察poly
rp-30孔径填料纯化效果。平阳霉素浓缩液体积28ml，浓度29g/l，含量约812mg，加入0.30g氯化铵，采用6m hcl调ph至4.4，上400ml高径比为12:1的层析柱，流速为0.08bv/h。
[0180]
然后采用1％氯化铵溶液0.3bv/h流速洗脱，用量5bv，接着采用去离子水同流速洗脱，待平阳霉素纯度高于95％时开始收集，待单位低于50μg/ml时停止收集。洗脱液浓缩至20ml，冻干得平阳霉素铜螯合物干粉704mg。收率86.7％，hplc纯度98.15％。
[0181]
对比例1
[0182]
发酵液放罐体积15.1l，streptomyces verticillius var.pingyangensis cpcc200552菌种，经有氧发酵得到发酵液，平阳霉素和博安霉素单位分别为154.56μg/ml和37.31μg/ml，总含量2333.86mg平阳霉素和563.38mg博安霉素，采用草酸调ph值2.6，搅拌30min后，然后50nm陶瓷膜过滤得滤液21l(过滤后期加纯化水稀释)，采用6m naoh调ph值4.7，滤液中总含平阳霉素2155.31mg和博安霉素527.67mg。过滤液上300ml d157树脂，高径比4:1，流速2bv/h，物料上完后0.2m盐酸溶液0.2bv/h流速洗脱，洗脱液用6m naoh调ph值4.7，然后旋蒸浓缩中速滤纸过滤得过滤液约81ml，含量1848.12mg平阳霉素和464.79mg博安霉素。收率8.45％和7.32％，hplc纯度79.18％和82.50％。
[0183]
然后上500ml unipsm 60-300(苏州纳微科技提供)填料床层析分离，高径比8:1，流速0.1bv/h，去离子水洗脱层析分离，hplc跟踪监测，分别收集平阳霉素和博安霉素hplc纯度均高于50％以上洗脱液，分别得到含943.89mg平阳霉素和230.14mg博安霉素的洗脱液，然后分别浓缩洗脱液至18ml和8ml。hplc纯度分别为56.32％和53.25％，单步收率分别为51.07％和49.51％。平阳霉素和博安霉素不能有效分离，单步收率明显偏低。
[0184]
对比例2
[0185]
对比实例1获得的平阳霉素和博安霉素浓缩液接着分别添加0.18g和0.08g氯化铵，ph采用6m hcl调至4.5，分别上250ml和80ml高径比14:1的unipmm 40-500(苏州纳微科技提供)层析柱，填料微球孔径为技提供)层析柱，填料微球孔径为流速0.1bv/h。接着采用1％氯化铵水溶液0.5bv/h洗脱，用量5bv，然后采用去离子水同流速洗脱，待平阳霉素或博安霉素hplc面积归一法纯度大于95％，开始收集，待单位低于50μg/ml停止收集。洗脱液浓缩至约10ml和5ml，冻干得分别得到高纯度平阳霉素和博安霉素铜鳌合物干粉512.34mg和96.09mg，单步收率分别为54.27％和41.75％，hplc纯度分别为95.27％和95.66％。单步收率和最终纯度均较低。
[0186]
对比例3
[0187]
发酵液放罐体积14.4l，streptomyces verticillius var.pingyangensis cpcc200552菌种，经有氧发酵得到发酵液，平阳霉素和博安霉素单位分别为168.12μg/ml和39.35μg/ml，总含量2420.93mg平阳霉素和566.64mg博安霉素，采用草酸调ph值2.4，搅拌30min后，然后50nm陶瓷膜过滤得滤液22l(过滤后期加纯化水稀释)，采用6m naoh调ph值4.9，滤液中总含平阳霉素2243.33mg和博安霉素524.56mg。过滤液上300ml zgd115树脂，高径比4:1，流速2bv/h，物料上完后0.2m盐酸溶液0.2bv/h流速洗脱，洗脱液用6m naoh调ph值4.6，然后旋蒸浓缩滤纸过滤得过滤液约62ml，含量2024.71mg平阳霉素和469.80mg博安霉素。hplc纯度8.54％和7.13％，收率分别为83.63％和82.74％。
[0188]
然后上xr3sp 500ml填料床层析分离，高径比12:1，流速0.1bv/h，采用1％氯化铵水溶液未能洗脱下来，然后采用10％甲醇溶液洗脱层析分离，hplc跟踪监测，分别收集平阳霉素和博安霉素hplc纯度均高于50％以上洗脱液，分别得到含1293.38mg平阳霉素和316.57mg博安霉素的洗脱液，然后分别浓缩洗脱液至15ml和10ml。hplc纯度分别为53.76％和56.28％，单步收率分别为63.87％和67.44％。平阳霉素和博安霉素不能有效分离，收率均偏低。
[0189]
对比例4
[0190]
对比实例3获得的平阳霉素和博安霉素浓缩液接着分别添加0.15g和0.10g氯化铵，ph采用6m hcl调至4.3，分别上200ml和100ml高径比14:1的unips
tm-30层析柱，填料微球
孔径为流速0.1bv/h。采用2％氯化铵水溶液未能洗脱下来，然后采用10％甲醇溶液同流速洗脱，待平阳霉素或博安霉素hplc面积归一法纯度大于95％，开始收集，待单位低于50μg/ml停止收集。洗脱液浓缩至约10ml和5ml，冻干得分别得到高纯度平阳霉素和博安霉素铜鳌合物干粉652.44mg和161.73mg，单步收率分别为50.44％和51.09％。hplc纯度分别为96.13％和95.39％。平阳霉素和博安霉素不能有效分离，纯度和收率均偏低。
[0191]
对比例5
[0192]
发酵液放罐体积15.6l，streptomyces verticillius var.pingyangensis cpcc200552菌种，经有氧发酵得到发酵液，平阳霉素和博安霉素单位分别为158.49μg/ml和41.59μg/ml，总含量2472.45mg平阳霉素和648.80mg博安霉素，采用草酸调ph值2.9，搅拌30min后，然后50nm陶瓷膜过滤得滤液23l(过滤后期加纯化水稀释)，采用6m naoh调ph值4.4，滤液中总含平阳霉素2267.51mg和博安霉素628.65mg。过滤液上300ml d157树脂，高径比4:1，流速2bv/h，物料上完后0.2m盐酸溶液0.2bv/h流速洗脱，洗脱液用6m naoh调ph值4.6，然后旋蒸浓缩过滤得过滤液约63ml，含量2040.55mg平阳霉素和529.87mg博安霉素。hplc纯度8.46％和7.52％，收率分别为82.53％和81.67％。
[0193]
争光霉素族化合物在ph偏高或者碱性状态下结构不稳定，例如ph值6.5，在高于室温的情况下，在层析过程中易产生杂质。
[0194]
浓缩液改用6m hcl调ph至3.0后上色谱3号500ml填料床层析分离，高径比10:1，流速0.1bv/h，去离子水洗脱层析分离，hplc跟踪监测，分别收集平阳霉素和博安霉素hplc纯度均高于50％以上洗脱液，分别得到含894.67mg平阳霉素和265.19mg博安霉素的洗脱液，然后分别浓缩洗脱液至15ml和10ml。hplc纯度分别为53.14％和56.26％，单步收率分别为43.84％和50.04％。平阳霉素和博安霉素收率均偏低。
[0195]
对比例6
[0196]
对比实例5获得的平阳霉素和博安霉素浓缩液接着分别添加0.32g和0.17g氯化铵，ph采用6m hcl调至2.4，分别上300ml和100ml高径比12:1的unips
tm-30层析柱，填料微球孔径为流速0.1bv/h。接着采用1％氯化铵水溶液0.5bv/h洗脱，用量5bv，然后采用去离子水同流速洗脱，待平阳霉素或博安霉素hplc面积归一法纯度大于95％，开始收集，待单位低于50μg/ml停止收集。洗脱液浓缩至约12ml和6ml，冻干得分别得到高纯度平阳霉素和博安霉素铜鳌合物干粉531.70mg和155.16mg，单步收率分别为59.43％和58.51％。hplc纯度分别为95.67％和96.28％。纯度和收率均偏低。

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