红色荧光金纳米团簇及其靶向复合物的制备方法和应用与流程

本发明涉及纳米材料及靶向复合物，具体涉及一种红色荧光金纳米团簇及其靶向复合物的制备方法和应用。

背景技术：

近年来，荧光金纳米团簇(auncs)作为有前途的新型荧光纳米材料，由于其独特的理化性质和良好的光学性质而备受关注。据文献报道，荧光auncs通常由几到几百个au原子组成，其尺寸小于2nm，与电子的费米波长相当。与大金纳米颗粒(aunps)不同，超小荧光auncs在可见光区域不显示表面等离子体共振吸收，但在可见光区域的近红外(nir)拥有明显的荧光发射。通过设计和控制尺寸，auncs可以具有较大的斯托克斯位移，量子限制效应，寿命长，强光致发光，水溶性，光稳定性，生物相容性等优良特性。得益于这些出色的性能，荧光auncs在生物标记，生物传感，生物成像和靶向癌症治疗应用中具有广阔的应用前景。

为了获得荧光auncs，研究人员探索出了许多合成方法。如超声合成，种子生长法，微乳液法，单层保护法，相转移合成，刻蚀方法等。这些方法通常可分为自下而上方法和自上而下方法。然而这些方法制备过程繁琐，耗时，不环保，所以使用更为简便，环境友好的的方法合成荧光auncs是十分有意义的。同时，在合成auncs的基础上进行功能化，制备多样化的团簇，能使其具有更优异的性质，从而开发更广泛的应用。如2013年qiao等人利用ova保护的auncs作为成像部分，fa作为靶向配体，pnas的均聚物作为连接基，制备了纳米共轭物fa-ova-auncs，表明其有望成为潜在早期肿瘤诊断的成像剂。2016年，wang等人利用金纳米簇与碳硼烷氨基衍生物(gncs-cb)的自组装对癌细胞进行生物成像，并将这种碳硼烷化合物靶向递送到肿瘤中。这些纳米荧光探针为靶向肿瘤检测开辟了一条新途径。目前，荧光auncs的合成过程较为复杂，而且功能化荧光auncs的报道比较少。因此，采用简单以及绿色的手段合成荧光auncs意义重大。

综上所述，针对荧光auncs的合成过程复杂，功能化荧光auncs少有报道的现状，致力于用简单的方法合成荧光auncs，并通过透明质酸(ha)与所制备的荧光auncs进行自组装形成金纳米团簇复合物，希望其成为一种具有合成技术稳定，荧光性稳定，生物相容性好，体内毒性低，成功靶向肿瘤细胞等多种优势的靶向系统，为临床癌症的识别诊断提供新策略。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种红色荧光金纳米团簇及其复合物的制备方法，所制备的红色荧光金纳米团簇可在细胞成像中的应用，所制备的荧光金纳米团簇复合物可在靶向识别肿瘤细胞中应用。

本发明提供的一种红色荧光金纳米团簇，是以溶菌酶和四氯金酸为原料，去离子水为溶剂，通过微波反应制备得到。

本发明提供的一种红色荧光金纳米团簇的制备方法，包括如下步骤：

(1)将溶菌酶溶液和四氯金酸溶液加入微波管中混匀，并搅拌；

(2)将步骤(1)得到的混合液转移到微波反应器中，进行微波反应；

(3)将步骤(2)得到的产物经过透析，最终得到红色荧光的金纳米团簇溶液。

步骤(1)所述的溶菌酶和四氯金酸的摩尔比为1:3-8，优选1:6。

步骤(2)所述的微波反应的温度为25～70℃，ph为7～13，时间为5～50min。

步骤(3)所述的透析是用截留分子量为8000～14000da的透析袋透析48h。

上述方法制备的红色荧光金纳米团簇可以与透明质酸通过物理吸附作用进行自组装，合成金纳米团簇复合物，从而获得靶向肿瘤细胞的荧光纳米体系。

所述的金纳米团簇和透明质酸的质量比为1:3-7，优选1:5。

本发明的有益效果：

本发明以生物相容性好的溶菌酶作为保护剂和还原剂，与四氯金酸通过微波法进行反应合成红色荧光金纳米团簇，方法简单且环保。

本发明将制备的金纳米团簇与透明质酸通过物理吸附作用进行自组装，获得靶向性金纳米团簇复合物，该复合物能成功靶向识别肿瘤细胞。

本发明制备的红色荧光金纳米团簇和金纳米团簇复合物水溶性好，荧光性质稳定，生物相容性优良，毒性低，在生物成像、生物标记以及肿瘤识别方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为红色荧光金纳米团簇的透射电镜图

图2为金纳米团簇复合物的透射电镜图

图3为红色荧光金纳米团簇的荧光激发，发射光谱图

图4为红色荧光金纳米团簇的红外光谱图

图5为红色荧光金纳米团簇的x射线光电子能谱分析图

图6为金纳米团簇，金纳米团簇复合物的紫外可见吸收光谱图

图7为金纳米团簇，金纳米团簇复合物的荧光发射光谱图

图8为不同浓度的红色荧光金纳米团簇对体外培养hela、3t3细胞活性的影响

图9为不同浓度的金纳米团簇复合物对体外培养hela、3t3细胞活性的影响

图10为红色荧光金纳米团簇的细胞成像图

图11为金纳米团簇复合物的靶向细胞成像图

图12为采用流式细胞术定量检测肿瘤细胞和正常细胞对金纳米团簇复合物的摄取量图

具体实施方式

以下实施例进一步阐述本发明的内容，但本发明并不局限于这些实施例。

实施例1

红色荧光金纳米团簇(auncs@lzm，aul)的制备：

(1)分别将(4mm，107.1μl)四氯金酸水溶液和(7.14x10^-2mm，1ml)溶菌酶水溶液加入微波管中，搅拌5min；

(2)将步骤(1)得到的混合液转移到微波反应器中，在50℃下微波反应5min；

(3)将步骤(2)得到的产物用截留分子量为8000～14000da的透析袋透析48h，最终得到红色荧光金纳米团簇溶液；

(4)进一步制成红色荧光金纳米团簇粉末。

实施例2

红色荧光金纳米团簇的形貌表征：

将制备的少量干燥红色荧光金纳米团簇粉末分散于水中，滴到铜网上，干燥后，利用透射电子显微镜分析样品的形貌。

制备的红色荧光金纳米团簇的电镜图见图1，从图中可看出，红色荧光金纳米团簇呈球形，晶格间距为0.25nm，表明与面心立方(fcc)au/ag的(111)晶面相似，其值为0.23nm。

实施例3

红色荧光金纳米团簇的荧光光谱测定：

取1ml红色荧光金纳米团簇溶液加入荧光杯，用荧光仪测定团簇的荧光光谱图。

制备的红色荧光金纳米团簇的荧光光谱图见图3，从图中可以看出，团簇的最佳激发波长为380nm，最佳发射波长为650nm，位于近红外区，避开细胞内自发荧光的干扰。插图为紫外照射(365nm)拍摄的图片。

实施例4

红色荧光金纳米团簇的红外光谱表征：

取少量干燥的金纳米团簇与干燥的kbr混合(质量比约为1:100)研磨压片，测定其红外光谱。

制备的红色荧光金纳米团簇的红外光谱图见图4，从图中可看出团簇表面主要有羟基、羰基。并且位于868cm^-1的峰归因于类似于醌的不饱和c＝c结构，这可能是由于溶菌酶中的酪氨酸残基被四氯金酸氧化为醌，表明了团簇的成功制备。

实施例5

红色荧光金纳米团簇的xps表征：

对红色荧光金纳米团簇溶液的干燥粉末，进行了xps表征。

制备的红色荧光金纳米团簇的xps光谱图见图5，从图中可看出，xps谱显示了键合能在284.8ev，399.8ev，531.3ev，169.15ev，83.6ev处的五个峰，分别归属于c1s，n1s，o1s，s2p，au4f元素，表明制得的金纳米团簇主要由c，n，o，s，au元素组成。

实施例6

检测了不同浓度的实施例1制备的红色荧光金纳米团簇对肿瘤细胞(hela)和正常细胞(3t3)的毒性。

首先将处于对数生长期的hela和3t3细胞按5.0×10³/孔的浓度分别接种于96孔板中，待细胞贴壁后，移去旧的培养液，加入200μldmem培养基配制的不同浓度的红色荧光金纳米团簇设为实验组(a:(0.1mg/ml)，b:(0.2mg/ml)，c:(0.4mg/ml)，d:(0.8mg/ml)，e:(1.2mg/ml)，设置6个平行组，每组均以未处理的hela和3t3细胞作为对照组，培养24h后，加入mtt溶液(20μl/孔)，孵育5h后，利用酶标仪检测实验组和对照组在490nm处的吸光度，从而计算细胞存活率。

不同浓度的红色荧光金纳米团簇对体外培养hela、3t3细胞毒性的影响见图8，从图中可以看出，团簇的毒性很小，生物相容性良好。

实施例7

实施例1制备的红色荧光金纳米团簇在细胞成像方面的应用实验：

将对数期生长的hela细胞(密度：1.0×10⁵个/盘)接种于35mm培养皿中，置于培养箱(37℃，5％co2)培养至细胞完全贴壁，弃除旧液，加入含1.5mg团簇的1.5ml培养液孵育24h后，弃除旧液，冷pbs洗涤2-3次，然后置于荧光显微镜下观察团簇与细胞标记情况。

红色荧光金纳米团簇在细胞成像方面的应用实验结果见图10(bright：细胞明场照片，red：金纳米团簇复合物标记细胞荧光成像(激发波长为405nm)，merge：叠加场。)在荧光显微镜下观察细胞标记情况，可以看到细胞呈现出明亮红色荧光，并且主要位于细胞质中，说明本发明制备的红色荧光金纳米团簇在细胞成像方面具有良好的应用潜力。

实施例8

金纳米团簇复合物(auncs@lzm@ha，aulh)的制备：

采用的载体为实施例1制备的红色荧光金纳米团簇。

采用的透明质酸(ha)分子式为c14h22nnao11，分子量为3000，山东西亚化学股份有限公司，规格为25g。

将红色荧光金纳米团簇通过物理吸附作用与透明质酸自组装成金纳米团簇复合物，即获得靶向肿瘤细胞的荧光纳米体系，具体制备方法包括如下步骤：

称取1mg红色荧光金纳米团簇于微波管中，加入1ml去离子水，充分溶解后，加入5mg透明质酸，置于搅拌器上，过夜反应12h后，转移至3500da的透析袋，置于含去离子水500ml的大烧杯中，搅拌进行透析48h。

实施例9

对实施例8所制备的金纳米团簇复合物进行形貌表征：

制备的金纳米团簇复合物的透射电镜图见图2，从图中可看出，团簇复合物呈现为球形。

实施例10

为了证实金纳米团簇与透明质酸的成功自组装，分别测定了金纳米团簇与金纳米团簇复合物的紫外吸收光谱。

金纳米团簇与金纳米团簇复合物纳米体系的紫外可见吸收光谱图见图6，从图中可以看出，与金纳米团簇相比，金纳米团簇复合物的紫外吸收峰发生了红移，证明透明质酸已经成功加载到了团簇表面。

实施例11

为了进一步证实金纳米团簇与透明质酸的成功自组装，分别测定了金纳米团簇与金纳米团簇复合物的荧光光谱图。

金纳米团簇与金纳米团簇复合物纳米体系的荧光光谱图见图7，从图中可以看出，与金纳米团簇相比，金纳米团簇复合物的荧光强度略微降低，证明透明质酸已经成功加载到了团簇表面。

实施例12

检测了不同浓度的实施例8制备的金纳米团簇复合物对肿瘤细胞(hela)和正常细胞(3t3)的毒性。

首先将处于对数生长期的hela和3t3细胞按5.0×10³/孔的浓度分别接种于96孔板中，待细胞贴壁后，移去旧的培养液，加入200μldmem培养基配制的不同浓度的金纳米团簇复合物纳米体系设为实验组(a:(0.1mg/ml)，b:(0.2mg/ml)，c:(0.4mg/ml)，d:(0.8mg/ml)，e:(1.2mg/ml)，设置6个平行组，每组均以未处理的hela和3t3细胞作为对照组，培养24h后，加入mtt溶液(20μl/孔)，孵育5h后，利用酶标仪检测实验组和对照组在490nm处的吸光度，从而计算细胞存活率。

金纳米团簇复合物的细胞毒性见图9，从图中可以看出，即使复合物浓度达到1.2mg/ml，细胞存活率仍然达到80％以上，表明所合成的金纳米团簇复合物具有出色的生物相容性。

实施例13

实施例8制备的金纳米团簇复合物在靶向细胞成像方面的应用实验：

将对数期生长的hela细胞(密度：1.0×10⁵个/盘)接种于35mm培养皿中，置于培养箱(37℃，5％co2)培养至细胞贴壁，弃除旧液，首先用pbs缓冲液洗涤细胞，然后用不同的材料处理细胞。具体来说，其中一组细胞与金纳米团簇复合物(1mg/ml)一起孵育2小时，另一组细胞用透明质酸(8mg/ml)预处理30分钟，然后与金纳米团簇复合物(1mg/ml)孵育2小时。还有一组细胞与金纳米团簇(1mg/ml)共孵育2小时。正常(3t3)细胞作为对照组，与金纳米团簇复合物(1mg/ml)一起孵育2小时。接下来，吸出所有细胞培养皿中培养液，用pbs洗涤细胞，并用多聚甲醛固定细胞。最后，通过荧光显微镜观察细胞并拍摄图片。

金纳米团簇复合物在靶向细胞成像方面的应用见图11(bright：细胞明场照片，red：金纳米团簇复合物标记细胞荧光成像(激发波长为405nm)，merge：叠加场。)在荧光显微镜下观察细胞标记情况，可以看到只用金纳米团簇复合物处理的肿瘤细胞(hela)中呈现出明亮红色荧光，而用透明质酸预处理后再用金纳米团簇复合物处理的肿瘤细胞中红色荧光较弱。同样用金纳米团簇处理的肿瘤细胞中红色荧光也较弱。说明金纳米团簇复合物能靶向肿瘤细胞。而且用金纳米团簇复合物处理的正常细胞(3t3)中红色荧光也十分弱，进一步表明金纳米团簇复合物具有靶向肿瘤特性。

实施例14

利用流式细胞术检测实施例8制备的金纳米团簇复合物的靶向性：

通过流式细胞仪对金纳米团簇复合物的靶向性进行了定量分析。用透明质酸受体过表达的hela细胞、mcf-7细胞和hepg2细胞用作肿瘤细胞模型。相反，选择透明质酸受体低表达的3t3细胞和dc细胞作为正常细胞模型。肿瘤细胞以每孔1×10⁵个细胞的密度接种到35mm培养皿中。细胞生长18小时后，首先用pbs洗涤细胞，然后用不同的材料处理细胞。具体来说，其中一组细胞与金纳米团簇复合物(1mg/ml)一起孵育2小时，另一组细胞与金纳米团簇(1mg/ml)共孵育2小时，还有一组细胞用透明质酸(8mg/ml)预处理30分钟，然后与金纳米团簇复合物(1mg/ml)孵育2小时。正常(3t3)细胞的实验处理方法是将细胞与金纳米团簇复合物(1mg/ml)一起孵育2小时。处理完后，吸出所有细胞培养皿中培养液，用pbs洗涤细胞，随后，通过无edta的胰酶水解将细胞重悬于pbs缓冲液中，最后通过流式细胞术检测发射峰位于650nm处的荧光强度以比较各实验组中细胞对纳米颗粒的摄取，进而判断金纳米团簇复合物的靶向性。

流式细胞术检测实施例8制备的金纳米团簇复合物的靶向性结果见图12，在金纳米团簇复合物孵育的hela，mcf-7，hepg2这些细胞中，荧光强度很强(图12a)，这说明三种肿瘤细胞吸收了大量纳米颗粒。但是，将hela，mcf-7和hepg2细胞先用游离透明质酸预处理30分钟后，再将它们与金纳米团簇复合物一起孵育。发现这三种细胞中荧光强度明显低于没有预处理的细胞，表明游离透明质酸抑制了肿瘤细胞对纳米颗粒的摄取。计算出的抑制率分别为80.56％，85.45％和65.04％，可见纳米颗粒对mcf-7的靶向作用最佳，其次是hela细胞，而hepg2细胞最差，这归因于不同肿瘤细胞表面表达的透明质酸受体(cd44)不同，金纳米团簇复合物表面的ha与这几种肿瘤细胞表面过表达的cd44受体特异性结合，使得金纳米团簇复合物能够靶向肿瘤细胞。此外，对于经金纳米团簇复合物处理的正常细胞3t3、dc细胞组(低表达cd44)(图12a)，其细胞内荧光强度非常低，这说明这两个正常细胞对纳米粒子的摄取很小，这间接证明了纳米粒子具有肿瘤靶向性。图12b将每种处理过的细胞内的荧光强度做出柱状图，清楚地显示了以上三种肿瘤细胞对金纳米团簇复合物的吸收明显大于上述的正常细胞。因此上述这些结果很好地证明了制备的金纳米团簇复合物能靶向肿瘤细胞。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除