促卵泡生成素受体活性检测试剂盒及其检测方法与流程

[0001]
本发明涉及一种促卵泡生成素受体活性检测试剂盒及其检测方法，属于检测试剂盒领域。


背景技术：

[0002]
女性在进入青春期后，卵巢在来自垂体的卵泡刺激素(fsh)作用下，发育卵子并排卵，卵泡刺激素受体(fshr)与fsh结合后，激发颗粒细胞增殖与分化，分泌卵泡液使卵泡生长发育。fshr失活突变对女性主要表现为高促性腺激素水平的原发性和继发性闭经、不孕，可伴有卵巢发育不良，fshr激活突变主要导致女性在自然妊娠过程中容易发生卵巢过渡刺激综合症(ohss)。目前hgmd(the human gene mutation database)记载的关于fshr 的突变均为错义点突变，且只有13种，但根据临床病患的样本检测后发现，确有新突变产生。拟对新突变进行检测定性，确定其与卵泡发育受阻及其相关症状之间的原因，为临床提供一个新的fshr的基因测序标准。


技术实现要素：

[0003]
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得一种促卵泡生成素受体活性检测试剂盒及其检测方法。
[0004]
为实现上述发明目的，本发明采用的促卵泡生成素受体活性检测试剂盒及其检测方法的技术方案如下：
[0005]
所述试剂盒包括两对扩增引物、多重pcr混合反应液，其中扩增引物用于扩增肥胖基因多态性位点，包括rs6165位点和rs6166位点，每对引物分别对应一个snp位点的上下游区域。
[0006]
优选的，所述rs6165位点的扩增引物序列如序列表seq id no：1～2所示。
[0007]
优选的，所述rs6166位点的扩增引物序列如序列表seq id no：3～4所示。
[0008]
优选的，所述多重pcr混合反应液包括dna聚合酶、mg
2+
和dntps。更进一步优选的，多重pcr混合反应液中还包括pcr稳定剂和增强剂。
[0009]
优选的，所述扩增体系中，每个snp位点的扩增引物和模板的加入量相同。
[0010]
本发明中的检测试剂盒一般采用处理过的dna样品作为扩增模板，样品一般来源于人全血或组织，处理样品可以减少血液中的免疫球蛋白g、血红蛋白和乳铁蛋白对pcr反应体系的干扰。
[0011]
优选的，所述检测试剂盒还包括全血样品pcr缓冲液，所述缓冲液含有100mmol/l tris-hcl，50mmol/l kcl，ph 9.3～9.5。全血样品pcr缓冲液是本发明的一种优选的实施方案，其他类型的全血pcr试剂均可以采用，不限于本发明中的缓冲液和缓冲液配方。
[0012]
优选的，试剂盒扩增体系为50μl的pcr体系，体系中同时含有rs6165位点和rs6166 位点的扩增引物。
[0013]
所述扩增体系具体为：
gaagaaactc atcatttcta ccctgcacaa agacagtgat gtatttgcta tactggatct gagatgttga ttctatttct ttttgtattt ttctagctct gagcttcatc caatttgcaa caaatctatt ttaaggcaag aagttgatta tatgactcag
[0032]
v
[0033]
ctaggggtca gagatcctct ctggcagaag acaatgagtc cagctacagc agaggatttg acatgacgta cactgagttt gactatgact tatgcaatga agtggttgac gtgacctgct cccctaagcc agatgcattc aacccatgtg aagatatcat ggggtacaac atcctcagag tcctgatatg gtttatcagc atcctggcca tcactgggaa catcatagtg ctagtgatcc taactaccag ccaatataaa ctcacagtcc ccaggttcct tatgtgcaac ctggcctttg ctgatctctg cattggaatc tacctgctgc tcattgcatc agttgatatc cataccaaga gccaatatca caactatgcc attgactggc aaactggggc aggctgtgat gctgctggct ttttcactgt ctttgccagt gagctgtcag tctacactct gacagctatc accttggaaa gatggcatac catcacgcat
[0034]
根据ncbi中公布的多态性位点进行引物设计，rs6166位点为“a/g”碱基突变，以“r”表示。具体序列如下：
[0035]
ggtgagcatc tgcctgccca tggatattga cagccctttg tcacagctgt atgtcatgtc cctccttgtg ctcaatgtcc tggcctttgt ggtcatctgt ggctgctata tccacatcta cctcacagtg cggaacccca acatcgtgtc ctcctctagt gacaccagga tcgccaagcg catggccatg ctcatcttca ctgacttcct ctgcatggca cccatttctt tctttgccat ttctgcctcc ctcaaggtgc ccctcatcac tgtgtccaaa gcaaagattc tgctggttct gtttcacccc atcaactcct gtgccaaccc cttcctctat gccatcttta ccaaaaactt tcgcagagat ttcttcattc tgctgagcaa gtgtggctgc tatgaaatgc aagcccaaat ttataggaca gaaacttcat ccactgtcca caacacccat ccaaggaatg gccactgctc ttcagctccc agagtcacca
[0036]
r
[0037]
tggttccact tacatacttg tccctctaag tcatttagcc caaaactaaa acacaatgtg aaaatgtatc tgagtattga atgataattc agtcttgcct ttgaagggta tgtcacaaag agctgacagt gcttctacac atttcatcta atttaatatt cctggcatac ctttaaggta aattggtcag gaactattaa ttccatgtga tacattagga agctgaatta ttagtaacaa caataataat taaagaatgc aatactgtat tacatatttt atccttatat atgttatttt tgcacgttat gttcaaagtg cttttgttca gatatctcaa gtgatccctg ttaaataagc aggacaggga ttattcttgg agttttacaa atgaggaaac cacgactcaa agagttaagt gacttgttca aaattgttta gtttgtaaga ggcagagcca ggattaggta ttccgactcc cagagaattt cccagagaag
[0038]
针对上述序列设计特异性扩增引物，便于进行快速高效的扩增。引物序列如下：
[0039][0040][0041]
本实施例采用多重pcr法对两个snp位点进行同时扩增后检测。
[0042]
二、试剂盒组成
[0043]
本实施例中的快速检测试剂盒为针对与fshr活性相关度高两个较高的snp位点进行同时扩增的多重pcr试剂盒，其中包括两对snp位点的上下游扩增引物及扩增模板提取试剂、多重pcr混合反应液，反应液包括dna聚合酶、mg
2+
、dntps、pcr稳定剂和增强剂。
[0044]
本实施例试剂盒中采用的dna模板为处理后提取的人血dna模板，对于采集的人全血或组织来说，需要预先进行处理。如待扩增样品为未经处理的全血样品，需采用用于全血样品pcr的缓冲液，其中含有100mmol/l tris-hcl，50mmol/l kcl，ph 9.3～9.5。
[0045]
三、多重pcr
[0046]
多重pcr选择platinum multiplex pcr master mix作为反应体系，其中包括dna聚合酶、mg
2+
、dntps、pcr稳定剂和增强剂，本次实验选择invitrogen platinum multiplex pcr master mix，pcr体系为50μl，其中
[0047]
2
×
platinum multiplex pcr master mix 25μl；
[0048]
模板2μl；
[0049]
rs6165、rs6166上下游引物(10μmol/l)各1μl；无菌双蒸水补齐至50μl。
[0050]
pcr反应条件：95℃预变性10min；然后94℃变性30s，55℃退火90s，72℃延伸60s， 40个循环后，再次72℃延伸10min，恢复至4℃。
[0051]
四、扩增结果检测
[0052]
1、扩增产物检测
[0053]
由于多重pcr的影响因素较多，扩增时需要对反应条件和引物位点、扩增产物等信息进行综合考虑，本实施例中的扩增引物组合是通过多次实验反复验证，相互间影响最小可以实现多重pcr的组合。
[0054]
采用本实施例中的上下游引物组合扩增后验证扩增产物，pcr产物选择2％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果中条带1、2为rs6166的扩增产物序列，条带3、4为rs17817449的扩增产物序列，电泳条带位置说明扩增结果无误。
[0055]
将电泳结果胶回收后送测序，测序结果也与目的产物序列一致。
[0056]
2、与fshr活性相关度高基因snp位点基因型频率统计
[0057]
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细
地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

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