一种氯吡格雷代谢标志物的检测试剂盒的制作方法

[0001]
本发明涉及一种氯吡格雷代谢标志物的检测试剂盒，属于检测试剂盒领域。


背景技术：

[0002]
动脉粥样硬化(aso)的发病随着人口老龄化、高血压、高血脂、糖尿病发病率的逐年升高而成为医学界关注的焦点。aso发病初期，动脉管腔未出现明显狭窄时患者一般没有明显症状，易被患者和临床医生忽略，各种危险因素联合作用使病情发展，动脉中膜组织破坏导致的血管脆性增加，粥样斑块阻塞管腔引起的缺血症状逐渐显现，而此病理过程累及全身动脉，冠脉及颅内动脉的慢性缺血症状容易被发觉，而下肢的动脉硬化患者就诊时大都已进入aso晚期，leaod患者通常斑块稳定性差，管腔闭塞严重，粥瘤易破裂引发急性动脉血栓栓塞，此时患者需要接受手术治疗拯救患肢，否则肢体缺血坏死是难以避免的。
[0003]
抗血小板凝集是治疗leaod的基础，不论手术与否，降低血小板活性都能有效降低血栓事件的发生率。传统抗血小板药物阿司匹林不能完全满足下肢动脉旁路术后患者的治疗需要，氯吡格雷作为强力的adp受体拮抗剂成为了抗血小板治疗的另一主角，经证实，氯吡格雷可大大降低旁路术后和支架置入术后再栓塞的发生几率，成为了心血管内科、血管外科、神经内科等的临床常用药物。然而，氯吡格雷药效受诸多因素影响，机体对标准剂量氯吡格雷药物反应低下，治疗后仍然出现血栓形成事件，称作氯吡格雷低反应，即氯吡格雷抵抗。
[0004]
目前，关于氯吡格雷抵抗的发生机制、影响因素、和检查手段、缓解方式的相关研究越来越多，并得到了客观的研究成果，其中被广大学者认同的影响因有遗传因素、肥胖、糖尿病、服药的依从性较差、其他药物拮抗等。遗传因素方面，已发现多个药物代谢酶基因与氯吡格雷作用强度相关，如细胞色素酶p450-2c19基因型，细胞色素酶p450-3a4和p450-3a5(cyp3a4/5)，药物耐药的蛋白质(mdr1)，对氧磷酸酶i(pon1,paraoxonase i)。其中尤其以细胞色素酶cyp2c19的研究最为透彻。目前报道的cyp2c19的基因型有超过30个突变型，这些突变型基因编码产生的蛋白多为无活性蛋白，只有cyp2c19*1型为野生型等位基因，编码产生具有正常活性的酶蛋白，称之为功能缺失型等位基因(lof，loss-of-function)，其中cyp2c19*2(c.681g＞a；rs4244285)、cyp2c19*3(c.636g＞a；rs4986893)型是亚洲人中最为常见的lof。不同患者对于氯吡格雷的反应存在明显差异，氯吡格雷抵抗(cr，clopidogrel resistance)的出现与患者治疗效果之间有着密切的关系。大量研究证实，p450功能缺失型等位基因位点cyp2c19*2与cyp2c19*3可使肝脏对氯吡格雷的代谢减弱，这解释了部分患者按照指南要求服用氯吡格雷后仍发生不良临床事件的现象。目前认为cyp2c19(*2/*3)等位基因编码功能低下的p450-2c19酶，或者编码组织不具有酶活性，其携带肝细胞内质网中p450-2c19酶功能缺失，则进入肝脏的氯吡格雷前体少了一种极为重要的氧化酶，虽有其他少数几种色素酶可以辅助代谢，但综合转运代谢能力明显降低，使得需经过p450-2c19色素酶代谢的所有物质转化效率降低。
[0005]
因此，针对cyp2c19在氯吡格雷中的重要作用和氯吡格雷在临床中的检测需求。设
计一款检测cyp2c19以指标氯吡格雷的检测试剂盒是十分重要的。


技术实现要素：

[0006]
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得一种氯吡格雷代谢标志物的检测试剂盒。
[0007]
为实现上述发明目的，本发明采用的一种氯吡格雷代谢标志物的检测试剂盒的技术方案如下：
[0008]
所述试剂盒包括两对扩增引物、多重pcr混合反应液，其中扩增引物用于扩增肥胖基因多态性位点，包括rs4244285位点和rs4986893位点，每对引物分别对应一个snp位点的上下游区域。
[0009]
优选的，所述rs4244285位点的扩增引物序列如序列表seq id no：1～2所示。
[0010]
优选的，所述rs4986893位点的扩增引物序列如序列表seq id no：3～4所示。
[0011]
优选的，所述多重pcr混合反应液包括dna聚合酶、mg
2+
和dntps。更进一步优选的，多重pcr混合反应液中还包括pcr稳定剂和增强剂。
[0012]
优选的，所述扩增体系中，每个snp位点的扩增引物和模板的加入量相同。
[0013]
本发明中的检测试剂盒一般采用处理过的dna样品作为扩增模板，样品一般来源于人全血或组织，处理样品可以减少血液中的免疫球蛋白g、血红蛋白和乳铁蛋白对pcr反应体系的干扰。
[0014]
优选的，所述检测试剂盒还包括全血样品pcr缓冲液，所述缓冲液含有100mmol/l tris-hcl，50mmol/l kcl，ph 9.3～9.5。全血样品pcr缓冲液是本发明的一种优选的实施方案，其他类型的全血pcr试剂均可以采用，不限于本发明中的缓冲液和缓冲液配方。
[0015]
优选的，试剂盒扩增体系为50μl的pcr体系，体系中同时含有rs4244285位点和rs4986893位点的扩增引物。
[0016]
所述扩增体系具体为：
[0017]
2
×
platinum multiplex pcr master mix 25μl；
[0018]
模板2μl；
[0019]
rs4244285、rs4986893上下游引物(10μmol/l)各1μl；无菌双蒸水补齐至50μl。
[0020]
pcr反应条件：95℃预变性10min；然后94℃变性30s，55℃退火90s，72℃延伸60s，40个循环后，再次72℃延伸10min，恢复至4℃。
[0021]
本试剂盒中一般采用提纯处理后的dna样本进行扩增检测。但本试剂盒中还包括全血扩增缓冲液，便于将采集到的人全血样品直接进行扩增。
[0022]
本发明的另一个目的在于提供一种氯吡格雷代谢标志物检测试剂的检测方法，所述检测试剂盒采用多重pcr的检测方法同时扩增rs4244285位点和rs4986893位点，扩增后检测扩增产物。
[0023]
本发明的第三个目的在于提供氯吡格雷代谢标志物检测试剂盒的的应用，所述检测试剂盒在检测临床氯吡格雷用药监测中的应用。
[0024]
与现有技术相比，本发明采用一种氯吡格雷代谢标志物的检测试剂盒采用多重pcr的扩增方法，同时扩增cyp2c19的两个重要snp位点，且可以根据实际需要灵活选择扩增的位点组合，可以起到一盒多用的作用，试剂盒中的引物特异性高，错配率低，引物长度和
t
m
值设计合理，扩增产物便于检测分离。一次扩增多条目的产物，不仅大大提高了扩增效率，降低了扩增成本。这种检测试剂盒可以扩展延伸到其他的snp位点检测中，具有良好的推广价值。
具体实施方式
[0025]
下面结合实施例对本发明提供的一种氯吡格雷代谢标志物的检测试剂盒作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0026]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
[0027]
一、设计引物
[0028]
根据ncbi中公布的多态性位点进行引物设计，rs4244285位点为“a/c/g”碱基突变，以“v”表示。具体序列如下：
[0029]
ctcccacttc taaaatacta attcaatttc agaggctgct tgatagaaat caatatagca
[0030]
gggactatct ttgtagtatc aatcaggttg tgcaaactct tttaacctat gctatcatct
[0031]
ccaaaatgtt aatgtagtaa ttcataccat cttatatttc aagattgtag agaagaattg
[0032]
ttgtaaaaag taagagaatt aatataaaga tgcttttata ctatcaaaag caggtataag
[0033]
tctaggaaat gattatcatc tttgattctc ttgtcagaat tttctttctc aaatcttgta
[0034]
taatcagaga attactacac atgtacaata aaaatttccc catcaagata tacaatatat
[0035]
tttatttata tttatagttt taaattacaa ccagagcttg gcatattgta tctatacctt
[0036]
tattaaatgc ttttaattta ataaattatt gttttctctt agatatgcaa taattttccc
[0037]
actatcattg attatttccc
[0038]
v
[0039]
ggaacccata acaaattact taaaaacctt gcttttatgg aaagtgatat tttggagaaa
[0040]
gtaaaagaac accaagaatc gatggacatc aacaaccctc gggactttat tgattgcttc
[0041]
ctgatcaaaa tggagaaggt aaaatgttaa caaaagctta gttatgtgac tgcttgcgta
[0042]
tttgtgattc attgactagt tttgtgttta ctacggatgt ttaacaggtc aaggagtaat
[0043]
gcttgagaag catatttaag tttttattgt atgcatgaat atccagtaag catcatagaa
[0044]
aatgtaaaat taaattgtta aataattaga atacatagaa gaaattgttt agataaatat
[0045]
aatctatctg aacaataagg atgtcaggat aggaaaagct ctgttctgca gcttccagtg
[0046]
agatcagcac aggaggaact taaatttaaa agaaaataaa aaacatctcc atcaaaaagt
[0047]
gagtgaagga tatgaacaga
[0048]
根据ncbi中公布的多态性位点进行引物设计，rs4986893位点为“a/g”碱基突变，以“r”表示。具体序列如下：
[0049]
ttgtctacag actttgcaga ctgatgtgat tccctctgaa acttgaatta tttggtttct
[0050]
aaaaaagtct ctttttttct ttccaaagta aaagacaaat aggccgggaa tgtaaattta
[0051]
gcatttgagc aaccattatt taaccagcta ggctgtaatt gttaattcga gattaatgta
[0052]
aaagtgatgt gttgatttta tgcatgccaa actctttttt gcttttaagg gaattcatag
[0053]
gtaagatatt acttaaaatt tctaaactat tattatctgt taacaaatat gaagtgtttt
[0054]
atatctaatg tttactcata ttttaaaatt gtttccaatc atttagcttc accctgtgat
[0055]
cccactttca tcctgggctg tgctccctgc aatgtgatct gctccattat tttccagaaa
[0056]
cgtttcgatt ataaagatca gcaatttctt aacttgatgg aaaaattgaa tgaaaacatc
[0057]
aggattgtaagcaccccctg
[0058]
r
[0059]
atccaggtaa ggccaagttt tttgcttcct gagaaaccac ttacagtctt tttttctggg
[0060]
aaatccaaaa ttctatattg accaagccct gaagtacatt tttgaatact acagtcttgc
[0061]
ctagacagcc atggggtgaa tatctggaaa agatggcaaa gttctttatt ttatgcacag
[0062]
gaaatgaata tcccaatata gatcaggctt ctaagcccat tagctccctg atcagtgttt
[0063]
tttccactaa actccaaagc cctgtttcta taaagtactt tggtgacagc cccaaagcgt
[0064]
gcttatatca ctccatggac atccaggcac tttggagtct tccattactc acaaggcttg
[0065]
tccttcaatt cacactttgt catattgtgt gacagaaata tcctaatcta aaagacatta
[0066]
tctccttcaa ggacagagaa tatttggaac cacagaagct gccaagaaac actgaatagg
[0067]
gcagaggtgt ttgatgtctc
[0068]
针对上述序列设计特异性扩增引物，便于进行快速高效的扩增。引物序列如下：
[0069][0070]
本实施例采用多重pcr法对两个snp位点进行同时扩增后检测。
[0071]
二、试剂盒组成
[0072]
本实施例中的快速检测试剂盒为针对cyp2c19两个较高的snp位点进行同时扩增的多重pcr试剂盒，其中包括两对snp位点的上下游扩增引物及扩增模板提取试剂、多重pcr混合反应液，反应液包括dna聚合酶、mg
2+
、dntps、pcr稳定剂和增强剂。
[0073]
本实施例试剂盒中采用的dna模板为处理后提取的人血dna模板，对于采集的人全血或组织来说，需要预先进行处理。如待扩增样品为未经处理的全血样品，需采用用于全血样品pcr的缓冲液，其中含有100mmol/l tris-hcl，50mmol/l kcl，ph 9.3～9.5。
[0074]
三、多重pcr
[0075]
多重pcr选择platinum multiplex pcr master mix作为反应体系，其中包括dna聚合酶、mg
2+
、dntps、pcr稳定剂和增强剂，本次实验选择invitrogen platinum multiplex pcr master mix，pcr体系为50μl，其中
[0076]
2
×
platinum multiplex pcr master mix 25μl；
[0077]
模板2μl；
[0078]
rs4244285、rs4986893上下游引物(10μmol/l)各1μl；无菌双蒸水补齐至50μl。
[0079]
pcr反应条件：95℃预变性10min；然后94℃变性30s，55℃退火90s，72℃延伸60s，40个循环后，再次72℃延伸10min，恢复至4℃。
[0080]
四、扩增结果检测
[0081]
1、扩增产物检测
[0082]
由于多重pcr的影响因素较多，扩增时需要对反应条件和引物位点、扩增产物等信息进行综合考虑，本实施例中的扩增引物组合是通过多次实验反复验证，相互间影响最小可以实现多重pcr的组合。
[0083]
采用本实施例中的上下游引物组合扩增后验证扩增产物，pcr产物选择2％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果中条带1、2为rs4986893的扩增产物序列，条带3、4为rs17817449的扩增产物序列，电泳条带位置说明扩增结果无误。
[0084]
将电泳结果胶回收后送测序，测序结果也与目的产物序列一致。
[0085]
2、cyp2c19基因snp位点基因型频率
[0086]
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

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