一种抗B7-H3抗体及其制备方法、其偶联物和应用与流程

一种抗b7-h3抗体及其制备方法、其偶联物和应用
技术领域
[0001]
本发明属于抗体领域，具体涉及特异性结合哺乳动物、特别是人的b7-h3的抗体及其制备方法、其偶联物和应用；特别是用于治疗癌症的全人抗体及全人抗体偶联物。


背景技术：

[0002]
b7-h3又名cd276，最早于2001年报道(chapoval ai等,nat immmunol 2001,2(3):269-274)，其蛋白因其缺少一个heptad结构以及b30.2结构域故而认为不属于嗜乳脂蛋白和髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白，并鉴定属于b7家族免疫球蛋白超家族成员(chapoval ai等,nat immmunol 2001,2(3):269-274)。与家族其它成员如pd-l1、b7-h4、cd80、cd86等不同的是：b7-h3在人体中以两种不同的变体形式存在：即2igb7-h3和4igb7-h3，其中4igb7-h3由2igb7-h3的外显子复制，人体中主要以4igb7-h3的形式存在(sun m等，the journal of immunology 2002,168(12):6294-6297；ling v等，genomics2003,82(3):365-377；steinberger p等,j immunol 2004,172(4):2352-2359)，而在鼠中只含有2igb7-h3结构(sun m等，the journal of immunology 2002,168(12):6294-6297)。研究结果显示，天然小鼠的2igb7-h3与人的4igb7-h3显示出相似的功能且无功能差异(ling v等，genomics 2003,82(3):365-377；hofmeyer ka等,proc natl acad sci u s a2008,105(30):10277-10278.)，晶体结构表明该蛋白igv区的fg loop是b7-h3发挥功能的重要表位(vigdorovich v等，structure 2013,21(5):707-717)。
[0003]
虽然b7-h3的mrna水平表达较为广泛，比如可在人体诸多组织器官中包括心脏、肝、胎盘、前列腺、睾丸、子宫、胰腺、小肠以及结肠中等检查到高水平的b7-h3的mrna水平，但蛋白表达水平相对局限在静息的成纤维细胞、内皮细胞、成骨细胞、羊水干细胞等非免疫细胞，以及受诱导的抗原提呈细胞、nk细胞表面(hofmeyer ka等,proc natl acad sci u s a 2008,105(30):10277-10278；yi kh等,immunol rev 2009,229(1):145-151；picarda e等,clin cancer res 2016,22(14):3425-3431)。b7-h3蛋白水平在正常健康组织中低表达，比如可在正常人体的肝、肺、膀胱、睾丸、前列腺、乳房、胎盘、淋巴器官等组织可检测到b7-h3较低的蛋白水平，但b7-h3蛋白在大量的恶性肿瘤中过表达，是肿瘤细胞的一个标志性抗原。研究表明b7-h3可在前列腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肾细胞癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、胃癌、膀胱癌、恶性神经胶质瘤以及骨肉瘤等诸多癌症中高表达，特别是在头颈部癌、肾癌、脑胶质瘤以及甲状腺癌等多种癌症中异常高表达(roth tj等，cancer res 2007,67(16):7893-7900；zang x等，modern pathol 2010,23(8):1104-1112；ingebrigtsen va等，int j cancer 2012,131(11):2528-2536；sun j等，cancer immunology,immunotherapy 2010,59(8):1163-1171；crispen pl等，clin cancer res 2008,14(16):5150-5157；zhang g等，lung cancer 2009,66(2):245-249；yamato i等，br j cancer 2009,101(10):1709-1716；tekle c等,int j cancer 2012,130(10):2282-2290；katayama a等,int j oncol 2011,38(5):1219-1226；wu cp等，world j gastroenterol 2006,12(3):457-459；wu d等，oncol lett 2015,9(3):1420-1424)。b7-h3
不仅表达肿瘤细胞上，在肿瘤新生血管内皮细胞上同样高表达，是一个非常广谱的肿瘤标志性抗原。b7-h3蛋白高表达可促进癌症进展，与患者的不良预后及较差的生存获益有关。
[0004]
虽然早期研究结果表明b7-h3可刺激活化t细胞功能，促进cd4及cd8细胞的增殖以及ifn-γ的分泌，但随着研究的深入，现已表明b7-h3作为一种免疫检查点主要起着抑制t细胞功能的作用，其下调t细胞活性，是t细胞的负调节分子。woong-kyung suh以及durbaka v.r.prasad的研究均表明鼠的b7-h3蛋白可剂量依赖性的显著抑制cd4、cd8细胞的增殖(suh w等，nat immunol 2003,4(9):899-906；prasad dvr等，the journal of immunology 2004,173(4):2500-2506)。judith leitner等人的研究同样表明人的4ig-b7-h3ig以及2ig-b7-h3ig在体外均可抑制t细胞的增殖，以及抑制cd4、cd8细胞的相关细胞因子(ifn-γ、il-2、il-10、il-13)的分泌(leitner j等，eur j immunol2009,39(7):1754-1764)，进一步分析指出b7-h3主要是通过抑制il-2的产生从而介导抑制t细胞增殖。而在小鼠体内靶向中和b7-h3的抗体可显著促进实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)的进展以及促进cd4细胞的增殖，客观说明b7-h3在体内抑制t细胞功能(prasad dvr等，the journal of immunology 2004,173(4):2500-2506)。在woong-kyung suh的研究中，在免疫eae条件下，b7-h3缺陷型小鼠相比野生型小鼠显示更早的发生实验性自身免疫性脑脊髓炎(由th1细胞引起)，说明b7-h3主要抑制th1细胞(suh w等，nat immunol 2003,4(9):899-906)。如上所述，b7-h3对t细胞的功能存在争论，但b7-h3促进t细胞功能目前只出现在小鼠的研究中，而人b7-h3促进t细胞功能暂未有报道，虽然b7-h3的受体未确定，但目前学界主要观点认为b7-h3是t细胞的负调控分子。
[0005]
基于b7-h3可抑制t细胞活性从而介导肿瘤细胞逃逸免疫监视，因此阻断b7-h3与未知受体的结合从而介导t细胞活化以及抑制肿瘤细胞活性是行之有效的，比如enoblituzumab的现有临床结果表明其对不同肿瘤均有不同程度的缓解，具有较好的疗效，但仍有多名患者发生疾病进展，因此单纯开发针对b7-h3的单克隆抗体在临床上仍不能达到预期；且上述抗体为通过杂交瘤进行筛选，然后进行了人源化改造，杂交瘤筛选虽然经过人源化改造，但仍然含有鼠源序列，具有潜在免疫原性风险，并且现有临床结果表明其抗肿瘤效果有待进一步改善。
[0006]
鉴于b7-h3在多种肿瘤中高表达，且在不同的肿瘤中其抗原峰度较高，是适合开发抗体偶联药物的靶点。


技术实现要素：

[0007]
本发明要解决的技术问题是针对现有技术中的抗b7-h3抗体数量缺乏、且多为含有鼠源序列的抗体的缺陷，提供一种抗b7-h3抗体及其制备方法、其偶联物和应用。本发明采用噬菌体全人文库筛选，获得的抗体的序列均为全人源序列，潜在免疫原性风险较低，具有一定临床应用安全性，并且具有内化功能，可用于adc药物开发有望获得更佳的抗肿瘤活性和功效，以期达到治疗癌症的用途。
[0008]
本发明主要通过以下技术手段解决上述技术问题。
[0009]
本发明提供一种抗b7-h3抗体，其包含互补决定区：重链cdr1、重链cdr2和重链cdr3中的一种或多种，和/或，轻链cdr1、轻链cdr2和轻链cdr3中的一种或多种；所述重链cdr1的氨基酸序列如序列表中seq id no:7、16或25所示；所述重链cdr2的氨基酸序列如序
列表中seq id no:8、17或26所示；所述重链cdr3的氨基酸序列如序列表中seq id no:9、18或27所示；所述轻链cdr1的氨基酸序列如序列表中seq id no:11、20或29所示；所述轻链cdr2的氨基酸序列如序列表中seq id no:12、21或30所示；所述轻链cdr3的氨基酸序列如序列表中seq id no:13、22或31所示；
[0010]
或者，所述重链cdr1的氨基酸序列与如序列表中seq id no:7、16或25所示氨基酸序列具有80％以上的序列同一性，例如具有80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性，且具有与seq id no:7、16或25所示的氨基酸序列相同或者相似的活性；
[0011]
所述重链cdr2的氨基酸序列与如序列表中seq id no:8、17或26所示的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性，例如具有80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性，且具有与seq id no:8、17或26所示氨基酸序列相同或者相似的活性；
[0012]
所述重链cdr3的氨基酸序列与如序列表中seq id no:9、18或27所示的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性，例如具有80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性，且具有与seq id no:9、18或27所示氨基酸序列相同或者相似的活性；
[0013]
所述轻链cdr1的氨基酸序列与如序列表中seq id no:11、20或29所示的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性，例如具有80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性，且具有与seq id no:11、20或29所示氨基酸序列相同或者相似的活性；
[0014]
所述轻链cdr2的氨基酸序列与如序列表中seq id no:12、21或30所示的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性，例如具有80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性，且具有与seq id no:12、21或30所示的氨基酸序列相同或者相似的活性；
[0015]
所述轻链cdr3的氨基酸序列与如序列表中seq id no:13、22或31所示的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性，例如具有80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性，且具有与seq id no:13、22或31所示的氨基酸序列相同或者相似的活性。
[0016]
本发明的序列同一性中，“至少
……”
与
“……
以上”代表一样的意思，例如至少80％意味着其为80％以上。
[0017]
较佳地，在上述b7-h3抗体中：
[0018]
所述的重链cdr1的氨基酸序列如seq id no:7所示，所述的重链cdr2的氨基酸序列如seq id no:8所示，且所述的重链cdr3的氨基酸序列如seq id no:9所示；
[0019]
或者，所述的重链cdr1的氨基酸序列如seq id no:16所示，所述的重链cdr2的氨基酸序列如seq id no:17所示，且所述的重链cdr3的氨基酸序列如seq id no:18所示；
[0020]
或者，所述的重链cdr1的氨基酸序列如seq id no:25所示，所述的重链cdr2的氨基酸序列如seq id no:26所示，且所述的重链cdr3的氨基酸序列如seq id no:27所示。
[0021]
所述的轻链cdr1的氨基酸序列如seq id no:11所示，所述的轻链cdr2的氨基酸序列如seq id no:12所示，且所述的轻链cdr3的氨基酸序列如seq id no:13所示；
[0022]
或者，所述的轻链cdr1的氨基酸序列如seq id no:20所示，所述的轻链cdr2的氨基酸序列如seq id no:21所示，且所述的轻链cdr3的氨基酸序列如seq id no:22所示；
[0023]
或者，所述的轻链cdr1的氨基酸序列如seq id no:29所示，所述的轻链cdr2的氨基酸序列如seq id no:30所示，且所述的轻链cdr3的氨基酸序列如seq id no:31所示。
[0024]
更佳地，所述的抗b7-h3抗体包含重链可变区(也可称为vh结构域)和/或轻链可变区(也可称为vl结构域)，或者具有一个或多个保守性氨基酸取代的等同物和它们的同源物
(homologs)；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中seq id no:6、15或者24所示，或者与如序列表中seq id no:6、15或者24所示的氨基酸序列有至少80％(例如80％、85％、90％、95％、98％或99％)的序列同一性，且具有与seq id no:6、15或者24所示的氨基酸序列相同或者相似的活性；所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中seq id no:10、19或者28所示，或者与如序列表中seq id no:10、19或者28所示的氨基酸序列有至少80％(例如80％、85％、90％、95％、98％或99％)的序列同一性，且具有与如序列表中seq id no:10、19或者28所示的氨基酸序列相同或者相似的活性。本发明中所述的“有至少80％的序列同一性”的氨基酸序列是通过对前述序列表中所示的氨基酸序列进行插入、缺失或者取代获得，所述的取代可为：例如，对序列进行计算机结构模拟分析，对可能存在的、特别是cdr区的转录后修饰(potential post-translational modifications，ptms)位点分析，包括抗体的聚集、脱酰胺基敏感(asparagine deamidation，位点(ng，ns，nh等)、天冬氨酸异构(dg，dp)敏感位点、n糖基化(n-{p}s/t)敏感位点及氧化敏感位点等分析和取代。
[0025]
所述抗b7-h3抗体包含或由具有来自seq id no:6、15或者24所示任一种vh结构域的氨基酸序列和来自seq id no:10、19或者28所示任一种vl结构域的氨基酸序列的一种多肽组成，以提供一个vh/vl对，表示抗体的抗原结合位点。
[0026]
进一步更佳地，所述的重链可变区的氨基酸序列如序列表中seq id no:6所示，且所述的轻链可变区的氨基酸序列如序列表中seq id no:10所示；
[0027]
或者，所述的重链可变区的氨基酸序列如序列表中seq id no:15所示，且所述的轻链可变区的氨基酸序列如序列表中seq id no:19所示；
[0028]
或者，所述的重链可变区的氨基酸序列如序列表中seq id no:24所示，且所述的轻链可变区的氨基酸序列如序列表中seq id no:28所示。
[0029]
再进一步更佳地，所述的抗b7-h3抗体还包括抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区；所述的抗体重链恒定区优选人源或小鼠源抗体重链恒定区；所述的抗体轻链恒定区优选人源或小鼠源抗体轻链恒定区。
[0030]
在本发明一较佳实施例中，所述的抗b7-h3抗体的重链的氨基酸序列如序列表中seq id no:32、33或者seq id no:34所示，或者与如序列表中seq id no:32、33或者seq id no:34所示的氨基酸序列有至少80％(例如80％、85％、90％、95％、98％或99％)的序列同一性且具有与seq id no:32、33或者seq id no:34所示的氨基酸序列相同或者相近的活性；所述的抗b7-h3抗体的轻链的氨基酸序列如序列表中seq id no:35、36或者seq id no:37所示，或者与如序列表seq id no:35、36或者seq id no:37所示的氨基酸序列有至少80％(例如80％、85％、90％、95％、98％或99％)的序列同一性且具有与如序列表seq id no:35、36或者seq id no:37所示的氨基酸序列相同或者相近的活性；较佳地，所述的抗b7-h3抗体的重链的氨基酸序列如序列表中seq id no:32所示，且所述的抗b7-h3抗体的轻链的氨基酸序列如序列表中seq id no:35所示；或者所述的抗b7-h3抗体的重链的氨基酸序列如序列表中seq id no:33所示，且所述的抗b7-h3抗体的轻链的氨基酸序列如序列表中seq id no:36所示；或者所述的抗b7-h3抗体的重链的氨基酸序列如序列表中seq id no:34所示，且所述的抗b7-h3抗体的轻链的氨基酸序列如序列表中seq id no:37所示。
[0031]
本发明中所述的抗b7-h3抗体可以为以下任何一种抗体形式：
[0032]
(a)一种完整的免疫球蛋白分子；
[0033]
(b)一种scfv；所述的scfv的氨基酸序列如序列表中seq id no:5、14或者23所示；
[0034]
(c)一种包含scfv的融合蛋白；
[0035]
(d)一种fab片段；
[0036]
(e)一种fab
′
片段；
[0037]
(f)一种f(ab)
2
。
[0038]
本发明中所述的抗b7-h3抗体可为一种单克隆抗体或者多克隆抗体，所述的单克隆抗体优选全人单克隆抗体。
[0039]
本发明中所述的b7-h3抗体可为超人源化抗体或者双抗体。
[0040]
本发明中所述的抗b7-h3抗体中涉及的b7-h3可为本领域常规的b7-h3，例如可溶性b7-h3、膜形式b7-h3等，所述可溶形式的b7-h3为，例如序列如seq id no:1所示的人b7-h3变体1，序列如seq id no:2所示的人b7-h3变体2，在人单核细胞上表达的b7-h3，序列如seq id no:3所示的鼠b7-h3，在鼠单核细胞上表达的b7-h3，序列如seq id no:4所示的猴b7-h3，在猴单核细胞上表达的b7-h3，序列如seq id no:38所示的可溶形式的人b7-h3蛋白，序列如seq id no:39所示的可溶形式的人b7-h3蛋白，序列如seq id no:40所示的b7-h3的igc结构域，或者序列如seq id no:41所示的b7-h3的igv结构域等。较佳地，本发明中的所述b7-h3为癌细胞表面上内源性表达的b7-h3；更佳地，所述的抗b7-h3抗体在结合癌细胞表面上表达的b7-h3后被内化。
[0041]
本发明中所述的抗b7-h3抗体的解离常数(kd)较佳地为5
×
10-7
m以下，更佳地为5
×
10-8
m以下，进一步更佳地为2
×
10-8
m以下。
[0042]
本发明还提供了抗体组(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子)，其中组成员对应于本发明的一个、两个、三个、四个、五个，或更多个不同的抗体[例如完全抗体、fab、f(ab)
2
片段和scfv等]。
[0043]
本发明中的所述抗b7-h3抗体为一种b7-h3拮抗剂，特别是人b7-h3拮抗剂。b7-h3的蛋白特异性拮抗剂(或本文称为“b7-h3特异性拮抗剂
″
)是有效抑制b7-h3功能的b7-h3蛋白特异性结合分子或蛋白，例如可为含有公开的cdr结构域或重链和/或轻链cdr结构域的组(sets)以及它们的以具有一个或多个保守性氨基酸取代为特征的等同物。
[0044]
它们在治疗与b7-h3功能相关或表达b7-h3的病症中非常重要，所述病症包括但不限于前列腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肾细胞癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、黑色素瘤、胃癌、膀胱癌、恶性神经胶质瘤以及骨肉瘤等相关表达b7-h3的肿瘤。b7-h3特异性拮抗剂的特征在于，对b7-h3的选择性识别和结合。b7-h3特异性拮抗剂不显示对除b7-h3之外的物质的显著结合，除了在那些特殊情况下：使拮抗剂补充带有另外的、与b7-h3特异性结合部分不同的特异性。在具体实施方式中，b7-h3特异性拮抗剂与人b7-h3结合的kd为1.2
×
10-6
m以下。在具体实施方式中，b7-h3特异性拮抗剂与人b7-h3结合的kd为1
×
10-7
m以下。在另外的实施方式中，b7-h3特异性拮抗剂与人b7-h3结合的kd为1
×
10-8
m以下。在其它实施方式中，b7-h3特异性拮抗剂与人b7-h3结合的kd为5
×
10-9
m以下，或1
×
10-9
m以下。其他实施方式中，b7-h3特异性拮抗剂与人b7-h3结合的kd为1
×
10-10
m以下，1
×
10-11
m以下，或1
×
10-12
m以下。在具体实施方式中，b7-h3特异性拮抗剂不以上述水平结合其它蛋白。
[0045]
b7-h3特异性拮抗剂特异性结合b7-h3后可有效地内化进入细胞。已屡次证明，b7-h3特异性拮抗剂结合后可通过内化可将其偶联的毒物分子带入细胞，引起凋亡，且引起细
胞凋亡的具体活性呈现剂量依赖性。因此，b7-h3特异性拮抗剂对杀伤肿瘤细胞非常重要。本发明所述的b7-h3特异性拮抗剂还可在检测和定量b7-h3中用于各种诊断目的。
[0046]
本领域技术人员将理解，可将保留了拮抗b7-h3能力的b7-h3特异性拮抗剂片段插入各种构架(frameworks)中，参见例如美国专利6,818,418以及其中的参考文献，它们讨论了可用于展示抗体环的各种支架(scaffolds)，所述抗体环之前基于抗原结合来选择。
[0047]
b7-h3特异性拮抗剂和片段可以是各种非基于抗体的支架的形式，包括但不限于高亲和性多聚体(avimers)(avidia)；darpins(molecμlarpartners)；adnectins(adnexus)，anticalins(pieris)和affibodies(affibody)。科学文献中对用于蛋白结合的可选支架的使用进行了很多评价，参见例如binz&pl
ü
ckthun，2005curr.opin.biotech.16：1-11。因此，具有b7-h3特异性选择性的、可特异性结合b7-h3，或结合后可内化、非基于抗体的支架或拮抗剂分子构成了本发明的重要实施方式。
[0048]
本发明还提供一种编码上述抗b7-h3抗体的核酸。
[0049]
本发明还提供一种包含上述核酸的表达载体。
[0050]
本发明还提供一种包含上述表达载体或者基因组中整合有如上所述的核酸的转化体。
[0051]
本发明还提供一种抗b7-h3抗体的制备方法，其包括如下步骤：培养上述转化体，从培养物中获得所述抗b7-h3抗体。
[0052]
本发明还提供一种免疫偶联物，其包括上述抗b7-h3抗体；较佳地，所述的免疫偶联物为抗体药物偶联物(adc)或者嵌合抗原受体t细胞(car-t)；更佳地，所述的抗体药物偶联物中，通过连接子将所述的抗b7-h3抗体和细胞毒剂连接。
[0053]
所述的连接子较佳地为vc-pab。
[0054]
所述的细胞毒剂较佳地为mmae。
[0055]
所述的mmae与所述的抗b7-h3抗体的药物抗体比率(drug antibody ratio，简称dar，)较佳地为4.0。
[0056]
本发明还提供一种药物组合物，其包括如上所述的抗b7-h3抗体或者免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。
[0057]
本发明还提供一种上述抗b7-h3抗体、或者上述免疫偶联物或者上述药物组合物在制备治疗b7-h3表达异常相关疾病的药物中的应用，所述的b7-h3表达异常相关疾病优选肿瘤，所述的肿瘤优选癌症，所述的癌症优选肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌、黑素瘤、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、胃癌、食管癌或肾癌。
[0058]
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0059]
本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0060]
本发明的积极进步效果在于：
[0061]
本发明的抗b7-h3抗体为噬菌体文库筛选的全人源抗体，具有独特的抗原结合表位；能特异性结合肿瘤细胞上的b7-h3抗原(kd值可达1.73
×
10-8
m)，且与肿瘤细胞结合后可快速内化进细胞，可用于adc药物开发有望获得更佳的抗肿瘤活性和功效，以期达到治疗癌症的用途。
附图说明
[0062]
图1示出了抗体p9a12、p7f10及p3h6同b7-h3的蛋白结合的elisa实验结果。
[0063]
图2示出了抗体p9a12、p7f10同hs-700t细胞结合的elisa实验结果。
[0064]
图3示出了抗体p9a12、p7f10及p3h6同经b7-h3转染的cho细胞结合的elisa实验结果。
[0065]
图4示出了抗体p9a12、p7f10及p3h6结合肿瘤细胞株后具有内化功能。
[0066]
图5示出了抗体p9a12、p7f10及p3h6的mmae类adc对calu-6的杀伤活性。
具体实施方式
[0067]
本文中使用的术语“b7-h3”与b7-h3蛋白代表相同的含义，并且还表示b7-h3变体1和/或b7-h3变体2。
[0068]
本文定义的b7-h3特异性拮抗剂选择性识别并特异性结合b7-h3。
[0069]
本文所用术语“选择性”或“特异性”指这样的事实：所述公开的拮抗剂不显示对除b7-h3之外的物质的显著结合，除了在下述特殊情况下：其中补充拮抗剂使其具有另外的、与b7-h3特异性结合部分不同的特异性(例如，双特异性或双官能分子，其中所述分子设计用于结合或行使两种功能，其中至少一种是特异性结合b7-h3)。
[0070]
kd指获得自kd(具体结合分子-靶蛋白相互作用的解离速率)与ka(具体结合分子-靶蛋白相互作用的结合速率)之比(或kd/ka，以摩尔浓度(m)表示)的解离常数。可使用本领域充分建立的方法测定kd值。测定结合分子的kd的优选方法是通过使用表面等离子共振，例如生物传感器系统，如biacore tm(ge healthcare life sciences)系统。
[0071]
如本文所述的“抗体分子”或“抗体”指指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。因此，术语抗体不仅涵盖完整抗体分子，还包括所述抗体的片段以及所述抗体和抗体片段的变体(包括衍生物)。在本说明书中所述术语抗体分子例如包括但非限于单链fv(scfv)，fab片段，fab
’
片段，f(ab
’
)
2
，二硫键连接的fv(sdfv)，fv，及完整抗体或全长抗体。术语“单链fv”或“scfv”是指一种多肽，其包含与抗体vh结构域连接的抗体的vl结构域。免疫特异性结合b7-h3的抗体可以与其它抗原发生交叉反应。优选地，免疫特异性结合b7-h3的抗体与其它抗原不发生交叉反应。免疫特异性结合b7-h3的抗体可以例如通过免疫测定或其它本领域技术人员已知的方法鉴别。“完整”抗体或“全长”抗体指包含两条重链(h)和两条轻链(l)的蛋白，所述重链和轻链通过二硫键相互连接，所述蛋白包含：(1)就重链而言，包含可变区(本文缩写为“vh”)和含有三个结构域ch1、ch2、ch3的重链恒定区；和(2)就轻链而言，包含轻链可变区(本文缩写为“vl”)和含有一个结构域cl的轻链恒定区。本发明的抗体包括但非限于单克隆，多特异性，人或嵌合抗体，单链抗体，fab片段，f(ab
’
)片段，抗独特型(抗-id)抗体(包括例如本发明抗体的抗-id抗体)，和上述任何抗体的表位结合片段。本发明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白的任何类型(例如igg，ige，igm，igd，iga和igy)，类别(例如igg1，igg2，igg3，igg4，iga1和iga2)或亚类。优选地，本发明的抗体包含或由具有表1所述任一氨基酸序列或其片段或变体的vh结构域，vh cdr，vl结构域，或vl cdr组成。
[0072]“结合可溶形式b7-h3”的本发明抗体是这样的一个抗体，其结合435个氨基酸的可溶形式的人b7-h3蛋白(seq id no:38)也即4ig b7-h3蛋白、和/或结合217个氨基酸的可溶
形式的人b7-h3(seq id no:39)也即2ig b7-h3蛋白、和/或102个氨基酸的可溶形式的人b7-h3的igc结构域(seq id no:40),和/或101个氨基酸的可溶形式的人b7-h3的igv结构域(seq id no:41)。在本发明的特异实施方案中，本发明的b7-h3特异性拮抗剂结合435个氨基酸的可溶形式的人b7-h3蛋白，优选同时结合217个氨基酸的可溶形式的人b7-h3的抗体。
[0073]“结合膜形式b7-h3”的本发明抗体是这样的一个抗体，其结合膜b7-h3蛋白。在本发明的特异实施方案中，“结合膜形式b7-h3”的本发明抗体不与可溶形式的b7-h3结合。在elisa中与经b7-h3转染的cho细胞(如本文所述)的结合，是抗体结合膜形式b7-h3特异性的检验。可以作为抗体对膜形式b7-h3具有特异性的检验包括但非限于如实施例5所述结合膜表达b7-h3。“结合可溶形式和膜形式b7-h3”的本发明抗体是即结合膜形式的b7-h3又结合可溶形式b7-h3的抗体。
[0074]
术语“变体”是指一种多肽，其与b7-h3多肽，b7-h3片段，抗b7-h3抗体或其抗体片段具有相似或相同的功能，但非必需包含相似或相同的b7-h3多肽，b7-h3片段，抗b7-h3抗体或其片段的氨基酸序列，或具有相似或相同的b7-h3多肽，b7-h3片段，抗b7-h3抗体或其片段的结构。具有相似氨基酸序列的一种变体称为一种多肽，其至少符合以下一种多肽：(a)包含或由一种氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列与b7-h3多肽，b7-h3片段，抗b7-h3抗体或其片段(包括具有表1所示任一种氨基酸序列的vh结构域，vhcdr，vl结构域，或vlcdr)的氨基酸序列具有至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％相同性；(b)由一种核苷酸序列编码的含有至少5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、125、或至少150个氨基酸残基的多肽，所述核苷酸序列的互补序列在严格杂交条件下与编码b7-h3多肽，b7-h3片段，抗b7-h3抗体或其片段(包括具有表1所示任一种氨基酸序列的vh结构域，vhcdr，vl结构域，或vlcdr)的核苷酸序列杂交；(c)由一种核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列与编码b7-h3多肽，b7-h3片段，抗b7-h3抗体或其片段(包括具有表1所示任一种氨基酸序列的vh结构域，vhcdr，vl结构域，或vlcdr)的核苷酸序列具有至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％相同性。与b7-h3多肽，b7-h3片段，抗b7-h3抗体或其片段具有相似结构的多肽是指这样的多肽，其与b7-h3多肽，b7-h3片段，抗与b7-h3抗体或其片段具有相似二级，三级或四级结构。多肽的结构可以通过本领域技术人员已知的方法确定，包括但非限于x光结晶法，核磁共振，和结晶电子显微镜方法。
[0075]
如本文所用，两个氨基酸序列之间的百分比同源性等于两个序列之间的百分比同一性(identity)。两个序列之间的序列百分比同一性是序列共享的相同位置的数目的函数(即，％同源性＝相同位置的数目/位置总数目
×
100)，其中考虑缺口(gap)的数目和每一缺口的长度，需要将其引入用于两个序列的最优对比。可用本领域通常所知的方法进行序列比较和确定序列间的百分比同一性，可用数学算法实现这种序列比较和百分比同一性的确定。例如，可用meyers和miller，1988comput.appl.biosci.4：11-17的算法(已整合入align程序(版本2.0))来确定氨基酸序列之间和/或核苷酸序列之间的百分比同一性。此外，可用从accelrys在线获得的gcg软件包中的gap程序(使用其缺省参数)来确定氨基酸序列之间或核苷酸序列之间的百分比同一性。在一个实施方案中，所述两个序列是等长的。
[0076]
术语“表位”是指在动物体优选哺乳动物体内具有抗原性或免疫原性活性的b7-h3的一部分。具有免疫原性活性的表位是b7-h3的一部分，其在动物体内激发抗体应答。具有
抗原性活性的表位是b7-h3的一部分，抗体与其免疫特异性结合，这可以通过本领域已知的方法测定，例如本文所述的免疫测定方法。抗原性表位非必需是免疫原性的。
[0077]
在一个具体方面，本发明提供拮抗b7-h3的分离的b7-h3特异性拮抗剂。具体实施方式中，所述b7-h3特异性拮抗剂特异性结合b7-h3并阻断与其未知受体的结合。通过重复实验，本发明的b7-h3特异性拮抗剂(例如抗体分子p1g2或p2e5)剂量依赖性地结合b7-h3。因此，在具体实施方式中，本发明包括b7-h3特异性拮抗剂，在更具体的实施方式中，本发明包括抗体分子，所述抗体分子内包含重链和/或轻链可变区，以及它们的等同物(特征是具有一个或多个保守性氨基酸取代)或同源物。本文所用术语“结构域”或“区域”简单地指抗体分子的各部分，其中将存在(reside)或者当前存在有争论(at issue)的序列或片段。
[0078]
本领域技术人员将理解，保守性氨基酸取代是用一个可带来类似或更好的(对预期的目的而言)功能特性和/或化学特性的氨基酸残基来取代氨基酸残基的置换。例如，保守性氨基酸取代常常是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。本领域中已定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。
[0079]
这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。此类修饰不是用来显著降低或改变b7-h3特异性拮抗剂的结合或功能特征，虽然它们可能改善这些特性。进行取代的目的不重要，可包括但绝不限于，用能够更好地维持或增强分子结构、分子的电荷或疏水性、或分子的大小的残基替代某一残基。例如，可希望用一种具有同样极性或电荷的残基取代一种不太理想的残基。可用本领域已知的标准技术(例如定位诱变和pcr介导的诱变)来引入此类修饰。本领域技术人员实现保守性氨基酸取代的一种具体方式是丙氨酸扫描诱变，描述于例如，maclennan等，1998acta physiol.scand.suppl.643：55-67，和sasaki等，1998adv.biophys.35：1-24中。然后用本领域可利用的或本文所述的功能性试验测试经改变的拮抗剂是否保留了功能或具有更好的功能。本文中将具有以下特征的b7-h3特异性拮抗剂称为本文公开的拮抗剂的“功能性等同物”并构成本发明的具体实施方式：具有一个或多个上述保守性氨基酸取代，保留了选择性结合于人b7-h3的能力，并且相对于不具有上述氨基酸变化的分子，拮抗b7-h3功能的水平相同或更佳。
[0080]
通常制备具有与本文所述的拮抗剂的氨基酸序列同源的氨基酸序列的b7-h3特异性拮抗剂来改善所述拮抗剂的一种或多种特性而不改变其对b7-h3的特异性。获得此类序列的一种方法(并非本领域技术人员可用的唯一方法)是使编码b7-h3特异性拮抗剂或其特异性决定区域的序列突变，表达包含这些突变序列的拮抗剂，使用可利用的功能性试验(包括本文所述的那些试验)来测试这些编码的拮抗剂是否保留了功能。可以通过定位诱变或随机诱变来突变。然而，本领域技术人员将理解，其他诱变方法可以容易地实现相同的效果。例如，某些方法中，用基于氨基酸的化学特性或者结构特性的非随机靶向保守取代或者用蛋白结构方面的考虑来限制突变体谱(spectrum)。在亲和力成熟实验中，单个经选择的分子(经随机或非随机选择)中可发现几个此类突变。对于亲和力成熟，还有各种基于结构的方法，描述于例如美国专利7,117,096、pct公开号：wo 02/084277和wo03/099999。
[0081]
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0082]
实施例1人b7-h3蛋白的制备
[0083]
选取人2ig b7-h3的29-245位氨基酸的核酸序列，其中n端添加纯化10his标签和c端添加检测myc标签，命名为h2m；选取人4ig b7-h3的27-461位氨基酸的核酸序列，其中n端添加纯化标签10his和c端添加检测myc标签，命名为h4m；选取人4ig b7-h3的27-461位氨基酸的核酸序列，其中n端添加检测myc标签和c端添加纯化10his标签，命名为m4h。分别合成上述三种b7-h3抗原的基因质粒h2m-puc57、m4h-puc57和h4m-puc57，并合成pv81表达载体质粒，分别通过ecori和smali酶切后连接转化大肠杆菌感受态细胞trans-t1，经pcr筛选扩增正确的克隆进行质粒的大量抽提。将抽提制备好的表达载体h2m、h4m和m4h分别于expi293中瞬转表达7天，表达上清经elisa检测后纯化制备。
[0084]
生物素化抗原制备，将已制备的h4m抗原(浓度3.36mg/ml)与pbs和10μm的生物素于37℃条件下孵育，抗原与生物素物质的量比为1:10，待孵育30min然后加入0.1ml 3m tris以终止反应，生物素化的抗原浓缩置换缓冲液至20mm pb,150mm nacl,ph7.4中以去除游离生物素，经计算，h4m抗原经生物素标记后其最终标记量约为2.5。
[0085]
实施例2文库制备
[0086]
分别取1ml文库lambda大小2.91
×
10
9
和文库kappa大小为3.72
×
10
9
的菌液加入2.0l新鲜培养基2yt+100μg/ml amp+2％葡萄糖中，文库菌液起始od600＜0.1，于37℃，转速200rpm的条件下培养。当od600为0.5-0.6时，加入365μl的m13k07，其滴度为9.6
×
10
12
/ml，加入量为菌量的10倍，菌量＝od600
×
8.0
×
10
8
/ml
×
摇菌体积，辅助噬菌粒侵染。加入辅助噬菌体后于37℃条件静止培养30min，然后在200rpm条件下30min培养，最后于4000rpm条件下离心10min，用2.0l等体积的2yt+100μg/mlamp+50μg/ml kana重悬，30℃培养16h，用于表达。待表达培养完成后，取菌液于4℃条件下，8000rpm离心30分钟，去上清。高速离心，去掉菌体，上清中加入1/5体积的peg/nacl，沉淀上清中的phage，离心后将phage溶解于pbs中，测phage滴度约为2.1
×
10
11
。
[0087]
实施例3抗b7-h3抗体噬菌体文库筛选
[0088]
液相淘选：150μl磁珠dynabeads m-280经1％酪蛋白室温封闭1h，再加入100μl已制备好的噬菌体文库phage，轻轻摇晃，室温封闭1h。封闭完成后加入30μg生物素化的b7-h3抗原h4m，室温孵育1h，待孵育完成后抗原h4m与phage抗体的复合物再与封闭的磁珠孵育15min，使其复合物结合到磁珠上，用pbst与pbs分别清洗15次。然后加入1ml的胰蛋白酶(10μg/ml)洗脱与抗原结合的噬菌体，洗脱体积1ml，将其侵染正在生长对数期的tg1，测滴度，扩增噬菌体用于下一轮淘选。共进行3轮淘选，后2轮淘选过程同第一轮，但加入的生物素化抗原量h4m逐渐减少分别为10μg和5μg或者7.5μg和2.5μg。
[0089]
噬菌体elisa筛选：取浓度为1mg/ml的链霉亲和素，室温溶解，混匀后用包被液逐步稀释至5μg/ml，加入96孔板中每孔100μl/孔，另设置3孔只加入100μl包被液作空白对照，2-8℃过夜。取生物素化的b7-h3抗原h4m，用0.5％bsa-pbst稀释液稀释至50ng/ml，然后以20ng/ml的浓度100μl加入链霉亲和素包被的板条中，放入微孔板振荡器内，37℃、600rpm振荡1小时后，弃液，用洗涤液洗板3次后拍干。取第二轮或第三轮淘选获得的阳性噬菌体，室
温溶解混匀后，用稀释液稀释500倍。将稀释好的噬菌体按照100μl/孔的量加入已酶标板中，放入微孔板振荡器内，于37℃、600rpm条件下振荡孵育1小时，弃液，用洗涤液洗板3次。然后每孔加入100μl已稀释的hrp/anti-m137的酶联抗体，放入微孔板振荡器内，37℃、600rpm振荡1小时后，弃液洗板3次，以100μl/孔的量加入tmb显色液显色15分钟，然后加入以100μl/孔加入1mol/l h
2
so
4
终止液终止反应，用酶标仪以650nm波长为参比波长，在波长450nm处测定吸光度。
[0090]
scfv蛋白elisa筛选：取b7-h3抗原h4m，室温溶解，用包被液稀释至2ng/ml，以100μl/孔的量加入疏水酶标板条中，另设置3孔只加入100μl包被液作空白对照，2-8℃过夜。向每孔中加入100μl的scfv蛋白样品，放入微孔板振荡器内，于37℃、600rpm条件下振荡1小时，弃液，用洗涤液洗板3次。然后以100μl/孔的量加入稀释后的酶联抗体，放入微孔板振荡器内，于37℃、600rpm振荡1小时后，弃液洗板3次，以100μl/孔的量加入tmb显色液显色15分钟，然后加入以100μl/孔加入1mol/l h
2
so
4
终止液终止反应，用酶标仪以650nm波长为参比波长，在波长450nm处测定吸光度。
[0091]
如上所述，共筛选到60个具有独特序列的抗b7-h3的scfv抗体，其中示例scfv抗体p3h6、p7f10和p9a12的序列组成如表1所示(其中cdr的确定依据kabat规则)。
[0092]
表1.各scfv抗体序列组成
[0093][0094]
scfv抗体p3h6、p7f10和p9a12等在噬菌体elisa和scfv蛋白elisa与b7-h3抗原h4m的结合信号值如下表2所示。结果表明，所筛选的scfv抗体均对b7-h3蛋白具较好的结合信号值。
[0095]
表2.phage scfv和蛋白scfv结合h4m elisa信号值
[0096]
抗体序列phage scfv elisa信号值scfv蛋白elisa信号值p3h6seq id no:53.050.79p7f10seq id no:140.650.96p9a12seq id no:230.780.94
[0097]
实施例4抗b7-h3全长抗体蛋白elisa结合
[0098]
抗b7-h3全长抗体蛋白elisa结合
[0099]
igg1抗体制备：将scfv转成igg1形式，将我们希望转成igg分子的scfv的vh结构域和vl结构域克隆进含有编码合适的重链(人igg1)或轻链(人kappa或人lambda)恒定区的核苷酸序列的载体中，以便当将这些载体转染进合适的宿主细胞中时可以从这些载体表达完整的重链或轻链分子。另外，当克隆的重链和轻链在一个细胞系中(从一个载体或两个载体)同时表达时，它们可组装成完整的有功能的抗体分子，分泌进细胞培养物培养基。将scfv转成常规抗体分子是本领域熟知的技术(将scfv序列的vh和vl分别直接组装在全长抗
体的重链恒定区和轻链恒定区上)。分别设计上述示例抗体如p3h6、p7f10和p9a12的轻重链引物序列，抗体轻链采用ecori+arvii双酶切构建到pfu-clig-hl2(invitrogen)载体上，重链采用ecori+nhei双酶切h链(igg1)构建到pfu-clig-hg1(invitrogen)载体上，经pcr筛选扩增正确的克隆进行质粒的大量抽提(详见j.萨姆布鲁克.分子克隆实验指南.2版[m].科学出版社,1992.)。将抽提制备好的表达载体分别于cho-s细胞中瞬转表达7天，表达上清经elisa检测后纯化制备。
[0100]
蛋白结合：包被100μl 20ng/ml的抗原b7-h3(r&d)于酶标板上，2-8℃过夜。然后分别加入100μl浓度从2000ng/ml起始，3倍梯度稀释，共计8个浓度点的上述已制备好的全长igg1抗体，于37℃、600rpm条件下孵育1小时，洗涤三次,加goat anti human igg(fc)-hrp酶联抗体，37℃、600rpm振荡1小时，洗涤4次，加tmb显色液，显色10分钟，加100μl的1mol/l的h
2
so
4
终止反应，测吸光度。结果显示p3h6、p7f10和p9a12均特异性结合b7-h3抗原，如图1所示p3h6、p7f10以及p9a12同b7-h3蛋白水平结合。
[0101]
实施例5抗b7-h3抗体cell-base elisa结合评价
[0102]
胰腺癌细胞株hs-700t经培养后，添加fbs/dmem培养基，以20000cells/孔的量铺板，设置不接种细胞的板孔加细胞完全培养基作空白对照，于37℃，5％co
2
的条件下培养20～24小时。pbst洗涤洗板1次，加入甲醛200μl/孔，室温固定0.5小时，洗涤3次，加入10％脱脂奶粉室温封闭1小时再次洗涤液3次，轻轻拍干待用。分别将上述制备好的igg1抗体如p3h6、p7f10和p9a12混匀后，每个抗体用0.5％bsa-pbst稀释液稀释至10000ng/ml，然后倍比稀释，共计8个浓度点，分别按100μl/孔的加入已包被hs-700t的孔板中，室温孵育1小时，然后洗涤3次。加tmb显色后终止反应，检测。结果如图2所示抗体p7f10和p9a12同hs-700t细胞结合。
[0103]
采用如上方式同样可证实所制备的igg1抗体同经b7-h3转染的cho结合，结果如图3所示p9a12、p7f10、p3h6同经b7-h3转染的cho细胞结合。
[0104]
实施例6抗b7-h3抗体同b7-h3结构域结合
[0105]
以与实施例4中相同的方式，通过蛋白elisa方法检验了igg1抗体p3h6、p7f10和p9a12结合b7-h3的哪个结构域如结构域2igb7-h3、igc结构域和igv结构域。作为结果，如表3所示，证实了p3h6与igv结构域(seq id no:41)具有强结合关系，而与igc结构域不结合，p7f10和p9a12与b7-h3的igc结构域(seq id no:40)和igv结构域(seq id no:41)均具有一定的结合关系。
[0106]
表3 p1g2、p2e5和p1e11同b7-h3不同结构域结合
[0107]
样品编号4ig b7-h32ig b7-h3igc结构域ig v结构域p3h6+++++
×
+++p7f10+++++++p9a12++++++
[0108]
注：+，弱结合；++，中等结合水平；+++，强结合；
×
，不结合
[0109]
实施例7抗b7-h3抗体同b7-h3结合内化
[0110]
研究了本发明的抗b7-h3抗体在结合癌细胞后被内化的能力。将胰细胞癌hs700t(购自atcc)接种于96孔细胞培养板中，每孔80000cells/50μl，培养20-24hr；其次用细胞对
应的含15％fbs的培养基分别稀释本发明的抗b7-h3抗体如p3h6、p7f10和p9a12至12.5、6.3、3.1、1.6、0.8、0.4、0.2nm以及0nm制备8个浓度梯度，分别将稀释好的本发明的抗b7-h3抗体与200nm(30μg/ml)的pa-goat anti-human igg fc antibody(dar-10.6)先1:1等体积混合反应后直接转移至已接种细胞的培养板内，50μl/孔，轻轻混匀1-2分钟，置37℃条件下培养，内化反应24hr，取出后吸弃培养液，加1
×
pbs(ph8.0)100μl；然后酶标仪激发波长：532nm，发射波长：560nm，选择底读模式进行读数。结果如图4所示表明本发明的抗b7-h3抗体在结合癌细胞后24h内具有较强的内化活性。
[0111]
实施例8adc杀伤评价
[0112]
mmae类adc样品的偶联制备。分别取适量抗体样品p3h6、p7f10和p9a12，按制备1:1的体积比与缓冲液50mm pb，1mm edta，ph 7.4对半稀释，并用缓冲液3m tris调节ph至7.4，控制样品浓度在5mg/ml左右。将样品置于反应釜中进行还原，控制温度在37℃，搅拌转速600rpm，预热5-10min，快速加入1mg/ml的tcep溶液，并用封口膜密封反应容器，开始反应2小时。待还原反应结束后立刻将样品转移至另一反应釜，控制温度在0-6℃，打开搅拌600rpm，缓慢加入vc-pab-mmae溶液，开始反应40分钟，反应结束取出样品。将样品体系置换成缓冲液50mm pb，1mm edta，ph 6.0，tff换液次数达15cv；超滤浓缩管达200倍体积比，换液后加入样品总体积的1/6体积的42％蔗糖缓冲液保存待用。
[0113]
将肺癌细胞株calu-6(atcc)与经vc-pab-mmae偶联制备的抗b7-h3抗体偶联药物p3h6-mmae、p7f10-mmae和p9a12-mmae一起孵育。通过测定细胞的活力，以此评价本发明的抗b7-h3抗体的mmae类adc(dar 4.0
±
0.2左右)对肿瘤细胞的内化杀伤活力。
[0114]
结果如图5所示：表明本发明的抗b7-h3抗体偶联药物p3h6-mmae、p7f10-mmae和p9a12-mmae均对肿瘤细胞calu-6呈现较好的adc杀伤活性。
[0115]
实施例9用表面等离子共振(“spr”)评估抗体与b7-h3相互作用的动力学
[0116]
用biacore t200(ge)系统进行spr检测。传感器芯片cm5(series sensor chip cm5)和用于固定的胺偶联试剂盒购自ge。
[0117]
分别将抗体p3h6、p7f10和p9a12供试品用ph 5.5的naac缓冲液稀释至10μg/ml，流速设置为10μl/min，edc和nhs混合液活化芯片时间为默认值420s，采用预设偶联量模式分别固定抗体p3h6、p7f10和p9a12至200ru水平，以乙醇胺封闭未结合供试品的活化基团。
[0118]
b7-h3抗原用hbs-ep缓冲液按一定比例进行稀释为浓度梯度分别为0nm、0.15625nm、0.3125nm、0.625nm、1.25nm(两个重复)、2.5nm、5nm、10nm、20nm，样品分析时设置流速为30μl/min，结合时间为120s，解离时间为1800s。然后进行再生，用gly-hcl缓冲液(ph 1.5)可作为再生缓冲液，再生时流速设置为30μl/min，再生30s。实验采用多循环运行，其响应信号以分析时间为横坐标，响应值为纵坐标。所得数据通过biacore t200分析软件进行拟合，所采用的拟合模型为1:1langmuir结合模型，确定其结合速率常数、解离速率常数及结合解离常数等动力学常数。
[0119]
表4抗b7-h3抗体的结合动力学参数
[0120]
抗体名称抗原ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)p3h64igb7-h32.559e+56.649e-23.770e-7p7f104igb7-h38.766e+52.485e-22.834e-8
p9a124igb7-h31.138e+61.97e-21.730e-8

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